瑞德西韦（Remdesivir）在制备抗牛副流感病毒3型药物中的应用
阅读说明：本技术 瑞德西韦（Remdesivir）在制备抗牛副流感病毒3型药物中的应用 (Application of Reddesivir (Remdesivir) in preparation of anti-bovine parainfluenza virus type 3 medicine ) 是由 程凯慧 于志君 杨宏军 楚会萌 朱彤 任亚初 于 2021-03-30 设计创作，主要内容包括：本发明涉及医药技术领域,具体涉及瑞德西韦在制备抗牛副流感病毒3型药物中的应用,所述抗BPIV3包括以下一种或多种作用：抑制BPIV3病毒增殖；灭活BPIV3病毒；阻止BPIV3对细胞的吸附作用；阻断BPIV3在细胞内的复制。本发明首次发现化合物瑞德西韦能够有效抑制BPIV3的增殖,且对细胞的毒性较小,经实验证明,瑞德西韦在体外实验MDBK细胞模型上能够有效抑制和杀灭BPIV3,能够有效抑制BPIV3的入侵和复制,可作为一类新的抗BPIV3的药物,为瑞德西韦开辟了新的药物用途,也为开发高效特异的抗BPIV3药物奠定实验基础并提供新的视野。(The invention relates to the technical field of medicines, in particular to application of Reidcvir in preparing an anti-bovine parainfluenza virus type 3 medicine, wherein the anti-BPIV 3 has one or more of the following effects: inhibiting BPIV3 virus proliferation; inactivating the BPIV3 virus; preventing the adsorption of BPIV3 to cells; blocking the replication of BPIV3 in the cell. The invention discovers for the first time that the compound Reidexi Wei can effectively inhibit the proliferation of BPIV3 and has low toxicity to cells, and experiments prove that Reidexi Wei can effectively inhibit and kill BPIV3 on an MDBK cell model in vitro experiments, can effectively inhibit the invasion and replication of BPIV3, can be used as a new anti-BPIV 3 drug, opens up new drug application for Reidexi Wei, also lays an experimental foundation for developing high-efficiency and specific anti-BPIV 3 drugs and provides a new visual field.)
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及瑞德西韦在制备抗牛副流感病毒3型药物中的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)属于副黏病毒科、呼吸道病毒属的成员，是牛呼吸道综合征(Bovine respiratory disease complex,BRDC)最重要病原，临床上以发热、咳嗽、气喘、食欲减退、眼睛鼻部分泌物增多，少数伴有腹泻为特征，最终表现为肺炎，严重的能够引起流产。目前，BPIV3的感染已呈世界性分布，给世界养牛业造成严重的经济损失。1959年该病毒在美国被首次分离到，随后法国、前苏联、日本、丹麦、加拿大、澳大利亚、巴拿马、意大利、阿根廷和韩国等国家也相继分离出该病毒，我国对BPIV3的报道比较晚。
BPIV3是引起犊牛和成年牛上呼吸道感染的重要病原体之一，BPIV3同属的成员还包括人副流感病毒3型(Human parainfluenza virus type 3,HPIV3)和仙台病毒(Sendaivirus,SeV)。在自然条件下，本病仅感染牛，多见于舍饲的肥育牛，病牛及带毒牛是主要的传染源，易感牛群因与排毒的牛接触，通过空气-飞沫经呼吸道而感染，也可以发生子宫内感染。曾从公牛精液和母牛生殖道中发现病毒，并可能导致不育。此外，也有研究者从奶牛临床乳房炎中分离到了BPIV3。本病常见于晚秋和冬季，感染BPIV3的牛只常因呼吸道上皮受损，而造成呼吸道黏膜的防御能力下降，引起免疫抑制，因此，BPIV3的患病牛经常容易继发感染严重的细菌性或支原体性疾病，从而引起严重的肺炎，使死亡率大大增加。
瑞德西韦(Remdesivir)是一种核苷类似物，具有抗病毒活性，在已有的实验室研究中，其对丝状病毒(埃博拉等)、沙粒病毒(Lassa热病毒等)、冠状病毒(SARS和MERS等)，都具有一定抑制效果。2016年USAMRIID和吉利德合作发表的Nature文章报道了瑞得西韦的作用机制、恒河猴PK/PD及在体抗埃博拉病毒效果，表明该药物在体外对MERS病毒抑制率很高。但迄今尚未有关于其用于预防或治疗牛副流感病毒3型的报道。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供瑞德西韦(Remdesivir)在制备抗BPIV3药物中的应用，本发明首次证实瑞德西韦(Remdesivir)能够有效抑制BPIV3的增殖，且对细胞的毒性较小，因此具有开发成抗BPIV3药物的前景。
为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的是提供一种瑞德西韦在制备抗BPIV3药物中的应用。
具体地，本发明的技术方案如下所述：
在本发明的第一方面，提供一种瑞德西韦在制备抗BPIV3药物中的应用。
在本发明的第二方面，提供一种抗BPIV3的药物制剂，所述药物制剂由瑞德西韦(Remdesivir)与至少一种其它非药物活性成分组成。
本发明的第三方面，提供一种抗BPIV3的药物组合物，所述药物组合物由瑞德西韦(Remdesivir)与至少一种其它药物活性成分组成。
本发明的
具体实施方式
具有以下有益效果：
本发明首次发现化合物瑞德西韦(Remdesivir)能够有效抑制BPIV3的增殖，且对细胞的毒性相对较小，经实验证明，瑞德西韦(Remdesivir)能够抑制BPIV3病毒；灭活BPIV3病毒；阻止BPIV3对细胞的吸附作用；阻断BPIV3在细胞内的复制；
瑞德西韦(Remdesivir)对MDBK细胞的半数细胞毒性浓度(CC50)是12.5μM，而对BPIV3病毒的半数有效浓度(EC50)为0.39μM；瑞德西韦(Remdesivir)对BPIV3的治疗指数为32，表明其具有开发成抗BPIV3药物的前景，为瑞德西韦(Remdesivir)开辟了新的药物用途，也为开发高效特异的抗BPIV3药物奠定实验基础并提供新的视野。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明瑞德西韦(Remdesivir)抗BPIV3损伤细胞的作用图；
其中：其中图1A为病毒对照组；图1B为MDBK正常细胞组；图1C为感染细胞药物试验组(使用0.39μM瑞德西韦(Remdesivir))；
图2为实施例2中瑞德西韦(Remdesivir)对MDBK细胞的半数细胞毒性浓度(CC50)图；
图3为实施例3中瑞德西韦(Remdesivir)对BPIV3的半数有效浓度(EC50)图；
图4为实施例4中瑞德西韦(Remdesivir)不同时间点给药对BPIV3抑制的效果图；
图5为实施例5中瑞德西韦(Remdesivir)对BPIV3直接杀伤作用效果图。
图6实施例5瑞德西韦(Remdesivir)对BPIV3吸附的阻断作用效果图。
图7实施例5瑞德西韦(Remdesivir)对BPIV3复制的阻断作用效果图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本申请使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。以下实施例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照销售公司所推荐的条件；实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径购买得到。
正如背景技术中论述的，现有技术中，迄今尚未有瑞德西韦(Remdesivir)用于预防和治疗BPIV3中的报道，有鉴于此，本发明提供瑞德西韦(Remdesivir)在制备抗BPIV3药物中的应用。
需要说明的是，该应用是首次公开，与其已知的临床用药用途并不相同，瑞德西韦其结构式如下：
本发明的一种实施方式中，提供了一种瑞德西韦在制备抗BPIV3药物中的应用，所述抗BPIV3包括预防和/或治疗BPIV3相关的疾病；
优选的，所述抗BPIV3包括以下一种或多种作用：
(1)抑制BPIV3病毒；
(2)灭活BPIV3病毒；
(3)阻止BPIV3对细胞的吸附作用；
(4)阻断BPIV3在细胞内的复制；
根据本发明，“预防和/或治疗”的概念表示任一适用于治疗BPIV3相关疾病的措施，或者对于这种表现的疾病或所表现出来的症状进行预防性治疗，或者避免这种疾病的复发，例如在结束了治疗时间段之后的复发或对已经发作的疾病的症状进行治疗，或预先介入性的防止或抑制或减少该类疾病或症状的发生。
“抗BPIV3药物”表示一种物质，其对BPIV3具有明显的抑制杀灭作用，对病毒的直接杀灭、吸附阻断、复制阻断方面都有很好的效果。
作为其它药物活性成分的替代或补充，瑞德西韦(Remdesivir)还可以与其它非药物活性成分组合使用。
本发明的一种实施方式中，提供了一种抗BPIV3的药物制剂，所述药物制剂由瑞德西韦(Remdesivir)与至少一种其它非药物活性成分组成，其中，瑞德西韦(Remdesivir)的药物浓度不低于半数有效浓度(EC50)；
优选的，瑞德西韦(Remdesivir)对BPIV3的半数有效浓度(EC50)为0.39μM；瑞德西韦(Remdesivir)对BPIV3的治疗指数为32；
优选的，所述非药物活性成分包括但不限于药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。
进一步优选的，所述非药物活性成分包括：药学上相容的无机或有机酸或碱、聚合物、共聚物、嵌段共聚物、单糖、多糖、离子和非离子型表面活性剂或脂质、药理上无害的盐例如氯化钠、调味剂、维生素例如维生素A或维生素E、生育酚或维生素原、抗氧化剂，例如抗坏血酸，以及用于延长药物活性成分或配方的使用和保存时间的稳定剂和/或防腐剂，和其它现有技术中公知的常用非药物活性成分或助剂和添加剂，以及它们的混合物。
所述药物制剂可以以单位剂量形式给药；给药剂型可以是常用的瑞德西韦(Remdesivir)剂型形式，或者其他可行的剂型，比如本领域技术人员可以在常规的剂型中选择适合于瑞德西韦(Remdesivir)的剂型，通过加入与瑞德西韦(Remdesivir)相容的载体、赋形剂、粘合剂、稀释剂等来实现。
所述常规剂型包括：液体剂型、固体剂型、外用制剂和喷剂；进一步的，包括以下剂型：真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混旋剂型、片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、栓剂、冻干粉针剂、包合物、填埋剂、贴剂、擦剂。
本发明的一种实施方式中，提供了一种抗BPIV3的药物组合物，所述药物组合物由瑞德西韦(Remdesivir)与至少一种其它药物活性成分组成。
优选的，所述其它药物活性成分包括具有抑制和/或杀灭BPIV3或者协助抑制和/或杀灭BPIV3的物质。
优选的，瑞德西韦(Remdesivir)的药物浓度不低于半数有效浓度(EC50)；
进一步优选的，瑞德西韦(Remdesivir)对BPIV3的半数有效浓度(EC50)为0.39μM；瑞德西韦(Remdesivir)对BPIV3的治疗指数为32。
在一种具体的实施方式中，当瑞德西韦(Remdesivir)与其他具有抑制和/或杀灭或者协助抑制和/或杀灭BPIV3等与本发明内容中所提及的相同应用的药物或活性成分联合使用时，其药物浓度理论上可以低于上述半数有效浓度，但也不排除特殊的例外情况。
根据本发明，不仅公开了瑞德西韦(Remdesivir)在制备抗BPIV3药物中的应用，而且还公开了，施用瑞德西韦(Remdesivir)与其它至少一种药物活性成分的组合时，可以增强这种作用。
下面结合具体实施例对本发明技术方案做进一步阐述。
需要说明的是，本申请实施例中使用的BPIV3由山东省农业科学院奶牛研究中心分离获得，经鉴定其属于BPIV3 C型。
具体分离及鉴定方法如下：将新鲜的鼻拭子用PBS稀释，反复冻融3次，5 000r/min离心5min，取上清液加入青霉素(200IU/mL)、链霉素(100μg/mL)，取200μL上清液，按照病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒说明书提取BPIV3病毒基因组RNA，反转录为cDNA，用BPIV3特异性引物进行PCR扩增，将PCR鉴定为阳性的鼻拭子液体用0.22μm的滤膜过滤除菌，取1ml接种MDBK单层细胞，37℃吸附1h，弃去，加入含有2％FBS的DMEM培养基中，在37℃、5％CO2细胞培养箱中培养，每12h观察细胞病变情况，连续观察3d。将出现病变(CPE)的细胞反复冻融3次，收集细胞病毒液，同时鉴定获得的细胞病毒夜是否是BPIV3单一感染，若不是单一病毒感染，使用噬斑纯化的方法获得BPIV3单一感染的细胞病毒液。经BPIV3系统进化树分析鉴定，该分离株属于BPIV3 C型。
实施例1
病毒TCID50的测定
将MDBK细胞(山东省农业科学院奶牛研究中心保存)消化后以每孔1×105个/mL的细胞密度接种到96孔细胞培养板中，放入37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养成单层细胞后，弃去孔内细胞生长液，将BPIV3连续10倍稀释的病毒稀释液(稀释度分别为10-1～10-10)接种于长满单层细胞的96孔板，每孔100μL，放入37℃、5％CO2的培养箱中继续培养，并逐日观察细胞的CPE情况，以及详细记录细胞病变孔数。同时设置正常细胞对照组和空白对照组，每组设8个重复，待不再继续发生细胞病变时判定结果。细胞病变孔是以上的细胞发生病变对应的细胞孔，并按Karber法计算病毒TCID50。
表1 TCID50 of BPIV3
注：TCID50，Tissue culture infective dose，半数组织培养感染剂量，又称50％组织细胞感染量；即指能在培养板孔或试管内引起半数细胞病变或死亡(cytopathiceffect,CPE)所需的病毒量。
结果：在显微镜下的形态学观察发现36h时不同浓度的病毒稀释液均造成了细胞病变，细胞的折光性发生改变，单层结构被破坏，细胞出现圆缩坏死，逐渐呈拉网状并形成空泡，有的细胞裂解脱落成碎片状，72h后各孔的细胞病变不再继续，统计出不同浓度的CPE孔数，并计算出不同浓度的CPE比率，并按Karber法计算BPIV3的TCID50值：
LgTCID50＝L-D(S-0.5)
(L：最高稀释度的对数；D：稀释度对数之间的差；S阳性孔比率总和)
LgTCID50＝L-D(S-0.5)＝-1-1×(5.75-0.5)＝-3.75
TCID50＝10-6.25/0.1mL
即将该病毒稀释106.25接种100μL可使50％的细胞发生病变。
实施例2
瑞德西韦(Remdesivir)对MDBK细胞的毒性实验：
MDBK细胞是BPIV3的易感细胞。因此，首先检测瑞德西韦(Remdesivir)对MDBK细胞的细胞毒性，具体实验步骤如下：
(1)在96孔板内接种100μL细胞(MDBK 1×104个/孔)。
(2)培养至MDBK单层后，进行下一步加药分析。弃去培养基，每孔加100μL含不同药物浓度的2％FBS DMEM，每个浓度做3个平行。同时对照孔：加100μL 2％FBS DMEM培养基。调零孔：不铺细胞。
(3)在37℃，5％CO2条件下培养48h后，按CCK-8试剂盒说明书操作，用酶标仪测定450nm处的OD值。
(4)37℃，5％CO2条件下继续培养2h后，在450nm测定吸光值。将正常生长细胞的A450 nm设为100％细胞对照。
(5)分析数据，利用GraphPad Prism5计算瑞德西韦(Remdesivir)的半数细胞毒性浓度(CC50)值。其结果如图2所示。
结果：瑞德西韦(Remdesivir)出现剂量依赖关系，即随着药物浓度的增加，则表现出细胞病变较为明显。经统计学分析，确定瑞德西韦(Remdesivir)半数中毒浓度为12.5μM。
实施例3
瑞德西韦(Remdesivir)对BPIV3的抑制实验：
(1)在96孔板的每个孔中接种1×104个MDBK细胞，37℃，5％CO2培养箱中过夜培养；
(2)弃去培养基，每孔加入100μL 1000TCID50的BPIV3稀释液(用2％FBS DMEM细胞长满后加入病毒稀释液，按照25μM初始浓度，两倍浓度梯度稀释加药，5％CO2培养箱中培养；
(3)48h后，按CCK-8试剂盒说明书操作，用酶标仪测定450nm处的OD值。
(4)分析数据，病毒抑制率(％)＝(药物处理组D450nm值-病毒对照组D450 nm值)/(正常细胞对照组D450 nm值-病毒对照组D450nm值)×100％，用GraphPad Prism5软件得化合物的半数有效浓度(EC50)值。其结果如图3所示。然后按公式TI＝CC50/EC50，计算相应的治疗指数TI值。
结果：通过CCK-8试剂盒检测细胞活力，可以计算出药物对BPIV3的有效抑制率。从结果可以看出，瑞德西韦(Remdesivir)在安全浓度范围内，其有效抑制率随着药物浓度的增加而增大，呈一定的量效关系。通过分析软件，对BPIV3的半数有效浓度(EC50)为0.69μM。瑞德西韦(Remdesivir)对BPIV3的治疗指数为32。
实施例4
作用机制的初步研究
通过不同的给药时间，即对应的时刻是先给药后感染病毒(0h之前)、先感染病毒后给药(0h之后)、病毒和药物同时加入细胞(0h)三个时间点，将待测化合物加入到接种了BPIV3的MDBK细胞中，进而初步判断瑞德西韦(Remdesivir)的作用时期。具体实验步骤如下：
(1)在96孔板的每个孔中接种1×104个MDBK细胞，37℃，5％CO2培养箱中培养。
(2)根据已测得的相关药物的药效学评价结果，确定实验所需药物的浓度，并用维持培养基把药物稀释至所需浓度。
(3)细胞过夜培养后，将96孔板中第二列三个复孔的细胞上清吸走，用磷酸缓冲液清洗细胞2遍。然后加入50μL的待测药物，记为-2h。
(4)2h后，将其他孔的细胞上清全部吸走，将稀释好的BPIV3稀释液加到第2～11列的每孔中，每孔加样体积为50μL。同时在第3列的三个复孔中加入50μL相应待测物，此刻记为0h。
(5)以后每隔一定时间在下一列的三个复孔中加入相应待测化合物，标记好相应时间。以第11列的MDBK细胞作为病毒对照组。
(6)培养48h后，进行OD值测定。分析数据，得出结论，其结果如图4所示。
结果：从不同时间点给药实验结果分析可知，瑞德西韦(Remdesivir)在病毒感染细胞-2h、0h、2h、4h、6h、8h时加药，对病毒均有明显的抑制作用。
实施例5
化合物不同时间加入对BPIV3复制的影响
将瑞德西韦(Remdesivir)分别采用先加药后加病毒、先加病毒后加药、药物和病毒预先作用的3种不同作用方式进行了体外抗病毒抑制试验。
(1)药物对病毒的直接杀伤作用
将等量的1000TCID50病毒液与不同浓度的药物稀释液混合均匀置于37℃、5％CO2培养箱中预先作用4h后，加入长成单层的96孔细胞培养板中，每个药液梯度100μL/孔，培养箱中作用2h，弃去上清液，加细胞维持液继续培养。本试验同时设置正常细胞对照组、病毒对照组和空白对照组，每个浓度设3个重复，48h进行细胞活力检测，用GraphPad Prism5软件得化合物的EC50。
结果：瑞德西韦(Remdesivir)与BPIV3预先作用的给药方式下，通过分析软件，瑞德西韦(Remdesivir)对BPIV3的作用效果如图5所示。从图5中可以看出，在这种作用式下，瑞德西韦(Remdesivir)在安全浓度范围内对BPIV3表现出抑制作用，表明瑞德西韦(Remdesivir)对BPIV3具有一定的直接灭活的作用。
(2)药物对BPIV3吸附的阻断作用
按每孔1×104个的细胞密度将消化好的细胞接种到孔板中，待长成单层细胞后弃去上清液，将不同浓度的药物稀释液每个药液梯度100μL/孔，加入长成单层的96孔细胞培养板中，培养箱中预先作用4h后，弃去上清液，用PBS洗两遍，加入等量的1000TCID50病毒液置于37℃、5％CO2培养箱中培养。本试验同时设置正常细胞对照组、病毒对照组和空白对照组，每个浓度设3个重复，48h后进行细胞活力检测，并计算该作用方式下不同浓度药物的抗病毒有效率。
结果：通过分析软件，瑞德西韦(Remdesivir)对BPIV3的作用效果如图6所示，结果显示，在安全浓度范围内，0.78μM及以上浓度对BPIV3的有效抑制率能达到100％，表明瑞德西韦(Remdesivir)能阻止BPIV3对细胞的吸附作用。
(3)药物对BPIV3复制的阻断作用
按每孔1×104个的细胞密度将消化好的细胞接种到孔板中，待长成单层细胞后弃去上清液，将等量的1000TCID50病毒液加入长成单层的96孔细胞培养板中，置于37℃、5％CO2培养箱中预先作用2h后，然后弃去上清液，PBS将细胞洗2遍，然后加入不同浓度的药物稀释液，每个药液梯度100μL/孔，本试验同时设置正常细胞对照组、病毒对照组和空白对照组，每个浓度设3个重复，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，48h后进行细胞活力检测，分析数据，得出结论。
结果：通过分析软件，瑞德西韦(Remdesivir)对BPIV3的复制阻断作用效果如图7所示，结果显示，在安全浓度范围内，0.78μM及以上浓度对BPIV3的有效抑制率能达到100％，表明瑞德西韦(Remdesivir)能有效阻断BPIV3在MDBK细胞内的复制。
本发明应用实施例以牛肾细胞(MDBK)为载体，在细胞致病模型上，采用先加药后加病毒、先加病毒后加药、病毒预先作用再加药物的3种不同作用方式进行了体外抗病毒抑制研究。发现瑞德西韦(Remdesivir)的新型抗病毒作用，对BPIV3有一定的抑制作用。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。