阅读说明：本技术 苏氨酸醛缩酶、其编码基因和在屈昔多巴生物合成中的应用 (Threonine aldolase, coding gene thereof and application of threonine aldolase in droxidopa biosynthesis ) 是由 赵文艳 杨碧玲 潘银平 倪德春 王伯初 戚娜 祝连彩 于 2019-10-12 设计创作，主要内容包括：本发明涉及L-苏氨酸醛缩酶及其编码基因与应用,属于生物技术领域。所述L-苏氨酸醛缩酶,为SEQ ID NO.1所示的蛋白,或将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加所获得的功能相同的蛋白。所述L-苏氨酸醛缩酶能够以3-/4-位羟基取代的苯甲醛为底物,以5-磷酸吡哆醛为辅酶,以甘氨酸为辅底物,在适当的条件和介质内进行酶催化反应,生物合成屈昔多巴(L-threo-DOPS),该方法的非对映选择性能达到30％。本发明具有较高选择性的L-苏氨酸醛缩酶对于屈昔多巴生物催化具有重要的意义。(The invention relates to an L-threonine aldolase, a coding gene and application thereof, belonging to the technical field of biology. The L-threonine aldolase is a protein shown in SEQ ID NO.1, or a protein with the same function obtained by substituting and/or deleting and/or adding one or more amino acid residues in an amino acid sequence shown in SEQ ID NO. 1. The L-threonine aldolase can perform enzyme catalytic reaction in a proper condition and medium by using 3-/4-hydroxyl-substituted benzaldehyde as a substrate, pyridoxal 5-phosphate as a coenzyme and glycine as an auxiliary substrate to biosynthesize droxidopa (L-threo-DOPS), and the diastereoselectivity of the method reaches 30%. The L-threonine aldolase with higher selectivity has important significance for droxidopa biocatalysis.)

苏氨酸醛缩酶、其编码基因和在屈昔多巴生物合成中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及L-苏氨酸醛缩酶、其编码基因和在屈昔多巴生物合成中的应用。

背景技术

屈昔多巴(L-threo-DOPS)是一种新的抗帕金森氏病药物。用于改善由帕金森病引起的步态僵直和直立性头晕；改善由Shy-Drager综合征或家族性淀粉样神经病所致的直立性低血压、直立性头晕和昏厥；改善血液透析患者由于直立性低血压引发的头晕和乏力。

目前，屈昔多巴的合成方法主要包括化学合成和酶催化法。其中，化学合成法主要是通过加成反应，酯化反应和化学拆分来得到手性的屈昔多巴，虽然化学法操作简单，但是反应过程中用到了大量的水，重金属和剧毒的硫化氢，并且有大量的光学异构体作为副产物，不符合目前和将来国家提倡和推进的原子经济学和环境保护政策。而酶催化法具有条件温和，用水量少(仅为化学法的十分之一)，没有重金属污染，不使用剧毒化学品，手性选择高等诸多优点，具有很好的应用前景。

苏氨酸醛缩酶(Threonine Aldolase，TA)有着十分广泛的应用潜力，它可以催化合成手性的医药关键中间体β-羟基-α-氨基酸。根据苏氨酸醛缩酶对苏氨酸底物α碳上的立体专一性可将该酶分为L型和D型两类。但是由于苏氨酸醛缩酶的稳定性不好，手性选择性特别是β-羟基的手性选择性不足，限制了此酶在手性合成中的应用。因此非常有必要挖掘具有高选择性的苏氨酸醛缩酶用于屈昔多巴的合成。

发明内容

本发明利用宏基因组测序技术从四川黑熊保护及孵育基地的健康黑熊的粪便样品中分离出一种新的L-苏氨酸醛缩酶基因，命名为L-TA Sz-1-2基因，其核苷酸序列如序列表中序列2所示，自5’末端第1位到第1032位为开放阅读框，长1032bp，其编码的L-TA Sz-1-2蛋白的氨基酸如序列1所示，由343个氨基酸序列组成。

本发明的L-苏氨酸醛缩酶属于生物催化剂，能够以3-/4-位羟基取代的苯甲醛为底物，以5-磷酸吡哆醛为辅酶，以甘氨酸为辅底物，在适当的条件和介质内进行酶催化反应，用于生物合成屈昔多巴(L-threo-DOPS)，该方法的非对映选择性能达到30％。由于目前屈昔多巴主要采用环境不友好，条件严苛的化学合成，酶催化由于较低的de值尚未实现工业化生产，所以本发明的L-苏氨酸醛缩酶对于屈昔多巴生物催化具有重要的意义。

一方面，本发明提供一种L-苏氨酸醛缩酶，为如下a1或a2所示：

a1.SEQ ID NO.1所示的蛋白；

a2.将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加所获得的功能相同的蛋白。

本发明还提供所述L-苏氨酸醛缩酶的编码基因。优选，所述编码基因为如下b1-b3中的任一种：

b1.SEQ ID NO.2所示的DNA分子；

b2.在严格条件下与b1限定的DNA分子杂交且编码所述L-苏氨酸醛缩酶的DNA分子；

b3.与b1或b2限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述L-苏氨酸醛缩酶的DNA分子。

含有所述编码基因的重组载体、表达盒或重组细胞也属于本发明的保护范围。所述载体，可以是克隆载体，包含L-TA Sz-1-2基因和质粒复制所需的其它元件；也可以是表达载体，包含L-TA Sz-1-2基因和能够使蛋白成功表达的其它元件。重组细胞是指转基因细胞系或重组菌，可以是包含克隆载体的重组细胞，例如E.coli DH5α；也可以是包含表达载体的重组细胞，例如E.coli BL21。在适当的条件下培养重组细胞，可诱导L-TA Sz-1-2的表达。

所述L-苏氨酸醛缩酶在催化反应中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明还提供一种催化剂，所述催化剂包括所述L-苏氨酸醛缩酶。所述催化剂可以与其它适合的催化剂同时使用，从而提高酶催化效率或者在同一反应体系中先后进行两种催化反应。

另一方面，本发明提供一种实现底物的选择性醛缩反应的方法，使用所述L-苏氨酸醛缩酶或所述催化剂对底物进行催化反应。

优选，所述催化反应以3,4-二羟基苯甲醛为底物，以5-磷酸吡哆醛为辅酶，以甘氨酸为辅底物，合成屈昔多巴。

优选，L-苏氨酸醛缩酶的用量为100-2000mg/mL，3,4-二羟基苯甲醛的浓度为1-100g/L，甘氨酸的浓度为5-100g/L，5-磷酸吡哆醛的浓度为0.01-0.2g/L。

优选，所述催化反应控制温度为5-42℃，搅拌速度为70-300rpm。

附图说明

图1是L-苏氨酸醛缩酶选择性合成屈昔多巴的示意图。

图2是分离的L-TA Sz-1-2基因的琼脂糖凝胶电泳图。

图3是L-TA Sz-1-2蛋白的SDS-PAGE电泳图，其中泳道1为14kDa-120kDa的Marker，泳道2为L-TA Sz-1-2蛋白。

图4是L-TA Sz-1-2与现有的大肠杆菌L-苏氨酸醛缩酶的序列比对结果。

图5是合成屈昔多巴的HPLC图谱，其中峰1为L-erythro-DOPS，峰2为L-threo-DOPS(屈昔多巴)。

图6显示了pH对L-TA Sz-1-2酶促反应de值的影响。

图7显示了温度对L-TA Sz-1-2酶促反应de值的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步描述本发明，需要声明的是，下述实施例仅作为解释和说明，不以任何方式限制本发明的范围。

生物材料：

E.coli DH5α感受态细胞，购买自天根生化科技(北京)有限公司，货号：CB101；

E.coli BL21感受态细胞，购买自天根生化科技(北京)有限公司，货号：CB105。

实验试剂：

粪便DNA基因组提取试剂盒，购买自德国Qiagen公司，货号：51604；

Prime STAR HS DNA Polymerase，购买自TaKaRa公司，货号：DR010A；

琼脂糖凝胶回收试剂盒，购买自Omega，货号：D2500-01；

载体pGEX-6p-2，购买自优宝公司：货号VT1259；

质粒提取试剂盒OMEGA Plasmid Mini Kit I，购买自OMEGA公司，货号：D6943；

限制性内切酶BamHI，购买自大连宝生物科技有限公司，货号：1010S；

限制性内切酶XhoI，购买自大连宝生物科技有限公司，货号：1094S；

T4DNA Ligase，购买自大连宝生物科技有限公司，货号：D2011A；10×T4Ligasebuffer，购买自大连宝生物科技有限公司；

Lysis buffer(裂解缓冲液)：配制而得，10mM pH 7.3的PBS含有PMSF 0.1mM、亮肽素Leupeptin 0.5mg/mL；

Glutathione Sepharose 4B，购买自GE Healthcare，货号：10223836；

PreScission Protease，购买自GenScript公司，货号：Z02799-100；

BCA试剂盒，购买自Beyotime公司，货号：P0006；

L-threo-DOPS，购买自百灵威科技公司，货号：D4235；

甘氨酸，购买自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：A502065；

3,4-二羟基苯甲醛，购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：A601406；

PLP，购买自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：A610455；

EB，购买自百灵威科技公司，货号：242101；

DNA提取所使用的黑熊粪便，本实验室冻存。

以下实施例中未特别说明的生物化学试剂，均为本领域常规试剂，可根据本领域常规方法配制而得或商购获得，均为化学分析纯和生物纯即可。

实施例1、L-TA Sz-1-2基因的发现

使用灭菌处理的药匙，采取了四川黑熊保护及孵育基地的健康黑熊的粪便样品，并干冰保存运回实验室。使用Qiagen粪便DNA基因组提取试剂盒提取了黑熊粪便的总DNA，交由上海美吉生物医药科技有限公司进行宏基因组测序。用现有的大肠杆菌L-苏氨酸醛缩酶(E.coli.L-TA)编码基因序列(Genbank登录号为：AOM47009.1)与宏基因组测序数据进行对比，发现了一种新的L-苏氨酸醛缩酶基因，命名为L-TA Sz-1-2，其核苷酸序列如序列2所示。序列2自5’末端第1位到第1032位为开放阅读框，开放阅读框部分为1032bp，其编码的L-TA Sz-1-2蛋白的氨基酸如序列1所示，由343个氨基酸组成。序列比对结果表明，这种新的L-TA Sz-1-2基因与现有的大肠杆菌L-苏氨酸醛缩酶基因序列的一致性为69.86％(图4)。

实施例2、L-TA Sz-1-2基因的克隆

1)引物设计：对测序获得的L-TA Sz-1-2基因序列设计引物，引物核苷酸序列如下：

Sz-1-2-BamHI-F：5′-CGCGGATCCATGTATAGTTTTAAAAATGATTATA-3′(序列表中序列3)，

Sz-1-2-XhoI-R：5′-CCGCTCGAGTTATTGTACTTCATCTAATAGCAT-3′(序列表中序列4)。

2)PCR扩增：以黑熊粪便的总DNA为模板，采用步骤1)获得的引物，按照下列PCR体系和程序进行扩增。

PCR体系：模板DNA是0.5μL，Sz-1-2-BamHI-F(10μM)是2μL，Sz-1-2-XhoI-R(10μM)是2μL，0.1％BSA是3μL，Prime STAR HS DNA Polymerase是25μL，补ddH₂O至PCR体系为50μL。

PCR程序如下：

a.94℃预变性5min；

b.98℃变性10sec，48℃退火10sec，72℃延伸10sec，40个循环；

c.72℃延伸10min。

3)琼脂糖凝胶电泳：使用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，结果如图2所示，出现大小约为1000bp的条带。

4)切胶回收：在紫外灯下切取目的条带，使用Omega琼脂糖凝胶回收试剂盒，按照试剂盒说明书中的操作步骤回收目的基因片段。

5)双酶切L-TA Sz-1-2基因：以BamHI和XhoI(均购买自大连宝生物科技有限公司)为限制性内切酶，双酶切步骤4)切胶回收的L-TA Sz-1-2基因片段。

双酶切体系包括：L-TA Sz-1-2基因是35μL，BamHI是3μL，XhoI是3μL，10×Kbuffer是6μL，补无菌双蒸水至体系为60μL。37℃酶切3小时。

6)回收双酶切产物：使用Omega回收试剂盒，按照试剂盒说明书中的操作步骤回收双酶切目的基因片段。

实施例3、L-TA Sz-1-2基因的表达、提取与纯化

1.构建连接载体：将L-TA Sz-1-2基因的序列全长连接在载体pGEX-6p-2上。

连接体系包括：双酶切L-TA Sz-1-2基因是6μL，T4DNA Ligase是1μL，载体pGEX-6p-2是2μL，10×T4Ligase buffer是1μL，体系为10μL，16℃连接12h。

2.转化E.coli DH5α感受态细胞，步骤如下：

1)感受态细胞E.coli DH5α放置冰上融化。

2)将步骤1所得的连接体系加入融化的E.coli DH5α感受态中，冰上30min。

3)42℃热处理90s。

4)冰上静置2min。

5)加入无抗LB培养基600μL，摇床温度37℃，摇床摇速150rpm，时间45min。

6)吸取200μL菌液，涂布于氨苄青霉素(Amp⁺)抗性LB平板培养基上。

7)37℃过夜培养。

3.阳性克隆鉴定，步骤如下：

1)挑选单菌落，接种于LB/Amp⁺的液体培养基中，180rpm、37℃培养12小时，14000rpm离心4min获取菌体。

2)使用OMEGA Plasmid Mini Kit I质粒提取试剂盒，按照说明书中的操作步骤提取质粒。

3)使用克隆引物Sz-1-2-BamHI-F和Sz-1-2-XhoI-R按照实施例2中的PCR体系和程序进行PCR验证，确定基因片段成功***pGEX-6p-2载体中。

4)将鉴定正确的重组质粒送上海生工公司测序，将测序结果比对正确的重组质粒pGEX-6p-2/L-TA Sz-1-2作为基因表达载体。

4.L-TA Sz-1-2的表达

1)质粒转化E.coli BL21细胞

a.-80℃中取出E.coliBL21感受态细胞冰上放置10min。

b.加入2μL表达载体pGEX-6p-2/L-TA Sz-1-2，冰上放置30min。

c.42℃热处理90sec。

d.冰上放置2min。

e.复苏，加入600μL LB培养基，于37℃，150rpm摇床培养45min。

f.吸取200μL菌液，涂布于Amp⁺LB平板培养基上。

g.37℃培养过夜，即得到重组细胞。

2)重组细胞表达与纯化

a.将重组细胞接种入无菌LB液体培养基中，氨苄青霉素终浓度为50μg/mL，37℃，180rpm摇床培养。

b.待菌液OD600≈0.8时，加入终浓度为0.5mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，16℃诱导12h。8000rpm，5min收集菌体。

c.按1L培养体系加30mL Lysis buffer的比例重悬菌体，超声破菌至澄清。12000rpm离心20min。取上清。

d.将上清与Glutathione Sepharose 4B结合，填料使用的比例为每升培养体系使用5mL填料，4℃结合2h。轻轻垂直颠倒混悬。

e.结合完毕后，5000rpm，5min沉淀填料。填料用4℃预冷PBS冲洗3-5个柱体积，去除杂蛋白。

f.加入PreScission Protease酶切缓冲液。

g.4℃酶切过夜。酶切完毕后，将上清从层析柱中放出。

h.将所得样品进行SDS-PAGE，鉴定其分子量大小及纯度，分子量约为38.7KD，使用BCA试剂盒按照试剂盒说明书的操作步骤测定纯化蛋白的浓度。

结果如图3所示，获得的L-TA Sz-1-2酶蛋白纯度很高，呈单一条带。图3中泳道1为14kDa-120kDa的蛋白分子标记，泳道2为L-TA Sz-1-2。

实施例4、L-TA Sz-1-2最适pH值测定

配置不同pH梯度的pH缓冲液：pH 6.0-8.0：50mM磷酸钠缓冲液；pH 8.0-9.0：50mMTris-HCl；pH 9.0-11：50mM甘氨酸-NaOH，每个梯度间隔0.5个pH值。测定L-苏氨酸醛缩酶在pH 6.0-11.0范围合成屈昔多巴，选择性最高的最佳pH。

测定de值(Diastereoisomeric excess，非对映体过量百分率)：[(L-threo-DOPS–L-erythro-DOPS)/(L-threo-DOPS+L-erythro-DOPS)]*100％

以3,4-二羟基苯甲醛为底物，以5-磷酸吡哆醛为辅酶，以甘氨酸为辅底物，使用实施例3获得的L-苏氨酸醛缩酶进行催化反应，控制温度为5-42℃，搅拌速度为70-300rpm，合成屈昔多巴。催化反应体系中，L-苏氨酸醛缩酶的用量为100-2000mg/mL，3,4-二羟基苯甲醛的浓度为1-100g/L，甘氨酸的浓度为5-100g/L，5-磷酸吡哆醛的浓度为0.01-0.2g/L。利用HPLC检测屈昔多巴和它的非对映异构体，HPLC参数设置为：波长280nm，柱温30℃，甲醇：0.1％(W/V)磺酸庚烷缓冲盐＝90：10，流速1mL/min。通过峰面积计算其非对映选择性。

结果如图6所示，本发明的L-TA Sz-1-2的最适pH落在比较宽泛的区域内，在pH6.0-11均有较高非对映选择性，均具有28％-32％范围的非对映选择性(de值)，表明本发明的L-TASz-1-2具有较宽的pH适应性。

实施例5、L-TA Sz-1-2最适温度测定

将酶反应样品在5-42℃摇床中200rpm反应2h，按照实施例4测定de值的方法检测与计算de值。每个样品进行不少于3次的重复实验，结果取平均值。

结果如图7所示，37℃时达到最高的非对映选择性，为29.66％，并且37℃时相同反应条件下产量较其他温度高，所以在其他条件相同情况下，选择该温度作为酶促反应最优温度。该温和的温度使本发明的苏氨酸醛缩酶更适于工业应用。

序列表

<110> 重庆大学

<120> 苏氨酸醛缩酶、其编码基因和在屈昔多巴生物合成中的应用

<130> P1930593-CQD-CQ-XDW

<141> 2019-10-12

<150> 2019104629462

<151> 2019-05-30

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 343

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

Met Tyr Ser Phe Lys Asn Asp Tyr Ser Glu Gly Ala His Pro Arg Ile

1 5 10 15

Leu Glu Thr Leu Leu Arg Thr Asn Leu Glu Gln Cys Glu Gly Tyr Gly

20 25 30

Lys Asp Thr Tyr Cys Glu Glu Ala Glu Asn Leu Ile Lys Asn Lys Leu

35 40 45

Asn Asn Glu Ser Ile Glu Val His Phe Ile Ser Gly Gly Thr Gln Thr

50 55 60

Asn Leu Ile Ala Ile Ser Ala Phe Leu Arg Pro His Gln Gly Val Ile

65 70 75 80

Ser Ala Asp Thr Gly His Ile Phe Val Asn Glu Ala Gly Ser Ile Glu

85 90 95

Ala Thr Gly His Lys Val Ile Ser Val Asp Val Val Asp Gly Lys Leu

100 105 110

Arg Arg Asp Asp Ile Leu Ser Val Leu Ser Lys Phe Thr Asn Glu His

115 120 125

Val Val Lys Pro Lys Leu Val Tyr Ile Ser Asn Ser Thr Glu Ile Gly

130 135 140

Thr Ile Tyr Lys Lys Ser Glu Leu Glu Glu Leu Ser Lys Val Cys Arg

145 150 155 160

Glu Asn Asn Leu Leu Leu Phe Met Asp Gly Ala Arg Leu Gly Ser Ala

165 170 175

Leu Ser Cys Lys Glu Asn Asp Leu Thr Leu Glu Asp Ile Ser Lys Leu

180 185 190

Thr Asp Ala Phe Tyr Ile Gly Gly Thr Lys Asn Gly Ala Leu Leu Gly

195 200 205

Glu Ala Leu Val Ile Cys Asn Lys Asp Leu Gln Glu Asp Phe Arg Tyr

210 215 220

His Leu Lys Gln Lys Gly Ala Met Leu Ala Lys Gly Arg Leu Leu Gly

225 230 235 240

Ile Gln Phe Ile Glu Leu Phe Lys Asp Asp Leu Phe Phe Glu Ile Gly

245 250 255

Lys His Glu Asn Asp Met Ala Asp Ile Leu Arg Asp Gly Ile Ser Arg

260 265 270

Leu Gly Tyr Glu Phe Leu Val Asp Ser Pro Ser Asn Gln Ile Phe Pro

275 280 285

Val Phe Asn Asn Asp Ile Ile Arg Glu Leu Glu Lys Asn Tyr Gly Phe

290 295 300

Asn Ile Trp Glu Lys Val Asn Glu Glu Lys Thr Ala Ile Arg Leu Val

305 310 315 320

Thr Ser Phe Ala Thr Lys Glu Glu Pro Cys Leu Glu Phe Ile Lys Phe

325 330 335

Leu Ser Gly Leu Thr Asn Lys

340

<210> 2

<211> 1032

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

atgtatagtt ttaaaaatga ttatagtgaa ggggcacatc ctagaattct tgaaacgttg 60

ctgagaacaa atttagaaca atgtgaaggt tacggaaaag atacatactg tgaggaagct 120

gaaaacttaa taaaaaataa actaaataat gagtctattg aagtccattt catatctgga 180

ggtacacaaa ctaacttaat agcaatatct gcatttttaa ggcctcatga gggtgttata 240

tcagcagata cagggcatat atttgtaaat gaagcaggtt caatagaagc aacaggacat 300

aaggtgatat ctgttgatgt tgtggatggt aaactaagaa gagacgatat actatcagta 360

ttgagtaagt ttactaatga gcatgttgta aaaccaaagc ttgtttatat atctaactct 420

actgaaattg gaactatata taaaaaatct gaattagaag agttaagcaa agtttgtaga 480

gaaaataatt tattactatt tatggatgga gcaagattag gatctgcact ttcttgcaaa 540

gaaaatgatt tgacattaga agatataagt aaattaactg atgcttttta tatcggggga 600

actaagaatg gagctctttt aggagaagca cttgttatat gtaataaaga tttacaggaa 660

gattttagat atcacttaaa acaaaaagga gcgatgcttg ctaagggaag gttgcttgga 720

atacagttta tagaattatt taaagatgat ttattttttg aaataggaaa acatgaaaat 780

gatatggctg atatattaag ggatggaata agtaggcttg gatatgaatt tttagtagac 840

tctccatcta atcaaatatt cccagtattt aacaatgata ttataagaga attagagaaa 900

aactatggat ttaatatatg ggaaaaagta aatgaagaga aaactgcaat aagattagta 960

acatcttttg caacaaaaga agaaccttgt ctagagttta taaagttttt aagtggatta 1020

actaataaat aa 1032

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgcggatcca tgtatagttt taaaaatgat tat 33

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccgctcgagt tatttattag ttaatccact ta 32