具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1紫薇属萜烯合酶基因LcTPS14、LiTPS14的克隆及生物信息学分析

紫薇属香花物种尾叶紫薇(Lagerstroemia caudata)与无香型紫薇‘白云映霞’(L.indica‘Baiyunyingxia’)均为白花，单萜类物质是二者盛开期花朵的主要差异挥发性成分，但在紫薇属中该类物质生物合成相关基因及功能尚不明确，为解析紫薇属单萜类物质生物合成的分子机制，本发明对尾叶紫薇进行全长转录组测序，筛选获得差异表达的萜烯合酶基因，以尾叶紫薇和紫薇‘白云映霞’为材料，分离萜烯合酶基因，分析基因的表达规律，并对其功能进行初步验证。

1、材料与方法

1.1植物材料：参考徐婉(2019)对尾叶紫薇各阶段花及盛开期不同部位的研究，采集尾叶紫薇和紫薇‘白云映霞’不同时期及盛开期花不同部位，用离心管装好，液氮速冻，保存于实验室超低温冰箱。

1.2试剂与耗材

植物总RNA提取试剂盒(DP441)，DNA回收试剂盒(DP209)，大肠杆菌(Escherichiacoli)感受态DH5α，氨苄青霉素(RT501)均购于天根生化科技(北京)有限公司；Max DNA Polymerase(R045A)，去基因组的反转录试剂(RR047)、TBPremix Ex Taq^TM II(RR820A)、DNA Marker购于宝日医生物技术(北京)有限公司；TOPOBlunt(平末端)克隆载体(cv17)购于北京艾德莱生物科技有限公司；外源RNA酶清除剂购于华越洋生物(北京)科技有限公司。引物合成及测序均由北京擎科新业生物技术有限公司承担；其他耗材类购于北京拜尔迪生物技术有限公司。

1.3试验方法

(1)植物总RNA提取

提取RNA前，使用外源RNA酶清除剂处理耗材、桌面及仪器，高温高压灭菌器材等，减少RNA分解酶的干扰。用液氮将样品充分研磨成粉末，参考陈之琳(2017)的方法提取总RNA，使用DTT(工作浓度1mmol/L)配制裂解液。

(2)检测RNA完整度和浓度

用1.2％的TBE普通琼脂糖凝胶电泳检测，在UV条件下于凝胶成像系统照相并分析胶片。超微量紫外分光光度计检测RNA提取液，记录OD₂₆₀/OD₂₈₀读数及浓度，RNA暂存于冰上以后续反转实验，长期保存则在-80℃冰箱中。

(3)反转合成cDNA并扩增目的基因全长

按照反转录试剂盒说明书步骤，以每管0.5μg总RNA量反转录获得cDNA。根据全长转录组序列数据，使用Primer premier 5设计扩增引物(上游引物5’-ATGGATTGTGTGGAAAGCTT-3’和下游引物5’-TTAGGCTAAACCATTAATCAGC-3’)。分别以尾叶紫薇和紫薇‘白云映霞’盛开期花朵的cDNA为模板，扩增目的基因。PCR反应体系如下：

PCR反应程序如下：98℃1min；98℃10s，55℃15s，72℃，30s，35个循环；72℃2min；4℃保存。

琼脂糖凝胶电泳检测产物，参照DNA回收试剂盒说明书进行胶回收。琼脂糖凝胶电泳并使用超微量紫外分光度计检测回收产物。

(4)目的基因连接TOPO克隆载体

采用艾德莱平末端连接试剂盒，连接体系为10×Enhancer 0.5μL，TOPO载体0.5μL，目的基因20-40ng，ddH₂O补齐至5μL。25℃连接5min。

转化大肠杆菌DH5α，5μL连接液与50μL菌液轻弹混匀，冰浴25min，42℃热激45sec-1min，冰上静置2min，加入500μL无抗生素的LB液体，37℃摇床200rpm复性30min。5000rpm离心收集菌体，在超净工作台环境，去上清，留存50μL液体，枪头吸打重悬菌体，将菌液涂布至含Amp(工作浓度50μg/mL)的固体LB培养基上，37℃倒置培养过夜。

挑取大小适当、圆整的单菌落于1mL含50μg/mL Amp的液体LB培养基中，37℃200rpm培养4h，菌液PCR检测，阳性菌液送至公司测序。

(5)序列的生物信息学分析

对获得的序列信息进行生物信息学分析。使用ORF Finder进行开放阅读框搜索，Blastp分析多序列同源性和蛋白结构域。使用DNAMAN和ClustalW软件进行多序列比对，MEGA7构建系统进化树。

基因LcTPS14的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，经密码子优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，基因LcTPS14编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

基因LiTPS14的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，经密码子优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，基因LcTPS14编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

(6)qRT-PCR验证基因表达

根据引物设计原则在Primer premier 5软件设计定量引物，内参基因采用EF-1α(陈之琳，2017)，cDNA稀释5倍进行，使用10μL体系(染料5μL+cDNA1μL+上、下游引物各0.4μL+ddH₂O)进行荧光定量反应，染液与cDNA提前按反应数+3配制，充分混匀并离心。引物提前与ddH₂O按反应数+3混匀。温度程序为：95℃预变性30s；95℃5s，60℃15s，共40个循环；从60℃到95℃以5℃/s升温，△T＝1℃，采集6s。进行3次技术重复及生物学重复，用2^-△△Ct法计算分析数据。

2、结果与分析

2.1植物总RNA的提取结果

提取的总RNA测得的OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.8-2.1范围内，浓度在100-800ng/μL范围，RNA的琼脂糖凝胶电泳结果显示所提取的总RNA条带清晰并且无明显拖尾现象，可用于下游实验。

2.2萜烯合酶序列分析

在前期筛选获得了候选萜烯合酶序列，利用NCBI ORF Finder搜索基因CDS并设计全长引物，在尾叶紫薇中成功分离获得了LcTPS14，通过同源克隆方法在紫薇‘白云映霞’中分离获得LiTPS14(图1)。

(1)LcTPS14与LiTPS14序列分析

LcTPS14和LiTPS14基因长度均为1575bp，编码525个氨基酸(SEQ ID NO:1和2)，二者核酸序列相似度为96.83％，氨基酸序列相似度为95.24％，含有DDXXD和DTE/NSE结构域。

(2)TPS基因编码蛋白同源性比对及系统进化树构建

将两个基因序列信息分别在NCBI进行blastp比对分析，多序列比对发现，LcTPS14和LiTPS14氨基酸序列含有DDXXD结构域，缺失RRX₈W结构域。NCBI蛋白保守结构域分析二者均有Terpene_cyclase_plant_C1(LcTPS14在4-522位点区间，LiTPS14是1-522位点区间)和Terpene_synth_C(208-470位点)结构域，两处富含天冬氨酸的区域及金属Mg²⁺结合位点。

与已验证功能的萜烯合酶基因一起构建系统进化树(Neighbor-Joining，bootstrap1000，partial deletion 50)(图2)，LcTPS14和LiTPS14在TPS-g亚家族，而TPS-g亚家族通常缺失RRX₈W结构域。

2.3基因表达分析

利用荧光定量技术，对尾叶紫薇和紫薇‘白云映霞’不同开花阶段和盛开期花的不同部位进行了候选基因表达规律探究。半定量PCR初步筛选荧光定量引物，筛选出的引物应该使得条带单一清晰，无引物二聚体(表1)。

表1荧光定量引物

(1)转录组数据验证

尾叶紫薇qRT-PCR数据与二代转录组中同样开花阶段FPKM数据比对，规律一致，表明尾叶紫薇二代转录组差异表达基因数据较为可靠。

(2)不同开花阶段的表达分析

选取叶芽、花序芽、未成熟花蕾、成熟花蕾、现蕾期、盛开期、盛开末期、衰败期八个时期，检测基因在不同时期的表达变化规律(图3)。

LcTPS14在尾叶紫薇不同开花阶段的表达规律为：叶芽-成熟花蕾-盛开期-盛开末期-衰败期呈现先下降后上升到峰值再下降最后到表达量较低无差异的趋势。在叶芽、花序芽和盛开期阶段，表达量较高。

LiTPS14在紫薇‘白云映霞’不同开花阶段的表达规律为叶芽-未成熟花蕾-成熟花蕾-盛开期-盛开末期-衰败期表现出了先上升后下降再上升至峰值后下降至无差异的表达规律，在盛开期表达量相对最高，其次是未成熟花蕾时期，在叶芽时期表达量极低。

(3)花不同部位的表达分析

取盛开期花的不同部位进行表达分析(图4)，发现LcTPS14在尾叶紫薇雌蕊表达量极高，在其他部位中几乎不表达。而LiTPS14在紫薇‘白云映霞’花瓣及雌蕊中高表达，雄蕊、花萼和花梗中有表达，但表达量不高。

本实施例采用分子生物学手段获得了尾叶紫薇和紫薇‘白云映霞’萜类物质生物合成途径的关键萜烯合酶基因，构建系统进化树，发现LcTPS14和LiTPS14被划分到TPS-g亚家族，预测其在细胞质中表达，有可能是倍半萜合酶或具有催化生成不同萜类的多功能酶，其具体功能需要进一步验证。

qRT-PCR检测表达分析发现LcTPS14和LiTPS14均在盛开期表达量最高，LcTPS14在雌蕊中表达量极高，LiTPS14在花瓣及雌蕊中高表达，在其他部位中表达量较低。

实施例2萜烯合酶基因的亚细胞定位

萜烯合酶是催化萜类化合物反应途径中最后一步的关键酶，其基因的功能与亚细胞定位相关。本实施例利用植物表达载体pCAMBIA Super1300::GFP，构建LcTPS14、LiTPS14植物表达载体，农杆菌介导侵染本氏烟草叶片，探究基因的亚细胞定位，以进一步了解这两个TPS基因功能。

1、材料与方法

1.1植物材料

6周龄本氏烟草(Nicotiana benthamiana)。

1.2试剂与耗材

琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(DP209)购于天根生化科技(北京)有限公司。农杆菌GV3101和大肠杆菌DH5α购于上海唯地生物技术有限公司。限制性核酸内切酶Kpn I(1068S)、Xba I(1093S)、DNA Ligation Kit(6023Q)购于宝日医生物技术(北京)有限公司。DMSO(CAS：67-68-5)、Kana(INALCO，CAS：133-92-6)、Rif(INALCO，CAS：13292-46-1)、AS(Sigma，CAS：2478-38-8)、MES·H₂O(Amresco，CAS：145224-94-8)等试剂购自北京拜尔迪生物技术有限公司。无缝克隆试剂盒(CV1901)购于北京艾德莱生物科技有限公司。引物合成及测序均由北京擎科新业生物技术有限公司承担。

重组质粒pCAMBIA Super1300::GFP(以下简称pSuper1300)由本实验室保存。

1.3试验方法

(1)溶液配制

100mg/mL Kana母液：3g Kana+30mL ddH₂O，过滤除菌(0.22μm)，-20℃保存。

10mg/mL Rif母液：100mg粉末溶于10mL DMSO中，过滤除菌(0.22μm)，-20℃保存。

1mol/L MES溶液：10.66g MES·H₂O粉末溶于50mL蒸馏水中，超净工作台中过滤除菌(0.22μm)，分装低温保存。

50mmol/L AS溶液：0.196g As粉末溶于20mL DMSO中，过滤除菌(0.22μm)，-20℃保存。

1mol/L MgCl₂溶液：溶于水中，高温高压灭菌，4℃保存。

(2)目的基因片段扩增

根据无缝克隆试剂盒说明书要求设计引物，以含有目的基因的TOPO重组质粒为模板，扩增引物(上游引物5’-ATACTAGTGGATCCGGTACCATGGATTGTGTGGAAAGCTTGC-3’和下游引物5’-CCTTGCTCACCATGGTACCGGCTAAACCATTAATCAGCAATGAC-3’)。PCR反应体系如下：

PCR反应程序如下：98℃1min；98℃10s，55℃15s，72℃，30s，35个循环；72℃2min；4℃保存。

(3)载体酶切

限制性内切酶Kpn I酶切质粒pSuper1300::GFP，37℃酶切4h，酶切体系如下：

(4)无缝克隆连接构建重组载体

将酶切回收的目的基因LcTPS14、LiTPS14与单酶切回收的载体按3:1摩尔比混合，50℃连接30min，连接体系如下：

转化大肠杆菌DH5α，37℃摇床200rpm复性1h。5000rpm离心1min收集菌体，在超净工作台中，去上清，留存50μL液体，枪头吸打重悬菌体，将菌液涂布至含Kana(工作浓度50μg/mL)的固体LB培养基上，37℃倒置培养过夜。

挑取大小适当、圆整的单菌落于1mL含50μg/mL Kana的液体LB培养基中，37℃200rpm条件下培养4h，菌液PCR检测，选取阳性菌液送至北京擎科新业生物技术有限公司进行测序。

(5)农杆菌转化及本氏烟草叶片侵染

将空载与构建成功的4个重组载体分别转化农杆菌GV3101，1μL重组质粒与50μL菌液混合，轻弹管底混匀，按说明书进行农杆菌转化，菌液涂布至固体LB(50μg/mL Kana+30μg/mL Rif)，28℃倒置培养60h。

挑取大小适当、圆整的单菌落于1mL含液体LB培养基(50μg/mL Kana+30μg/mLRif)中，28℃200rpm培养24h，菌液PCR检测。

取阳性菌液1mL与15mL含50μg/mL Kana+30μg/mL Rif+10mmol/L MES+20μmol/LAS的LB培养基混合，28℃200rpm诱导过夜。5000rpm离心收集菌体，使用新鲜配制的侵染液(无菌水+10mmol/L MES+200μmol/L AS+10mmol/L MgCl₂)重悬菌体，调节OD₆₀₀至0.5～0.8，暗处静置2～3h。一次性注射器吸取侵染液在本氏烟草叶背进行注射，暗处理24h后，放入人工气候箱。

(6)激光共聚焦显微镜观察荧光

侵染72小时后，取1cm×1cm叶片用清水制片，叶背面朝上，以空载为对照，上机观察绿色荧光蛋白表达情况。

2、结果与分析

2.1含目的基因的植物表达载体及转化农杆菌

(1)无缝克隆方法获得LcTPS14和LiTPS14重组载体

目的基因LcTPS14和LiTPS14去掉终止密码子，无缝克隆方法设计扩增引物，与经过Kpn I单酶切的表达载体连接，经公司测序获得正确的重组载体。

(2)获得含重组载体的农杆菌

pSuper1300空载作为对照，重组质粒转化农杆菌，挑取完整菌落培养24h后，菌液PCR检测(图5)，筛选含目的大小条带的菌液进行后续扩大培养并侵染本氏烟草叶片。

2.2激光共聚焦显微镜观察基因表达部位

通过农杆菌侵染本氏烟草叶片，注射72h后上机检测荧光，在Leica SP8激光共聚焦显微镜下观察本氏烟草叶片下表皮。结果表明注射了空载体的叶片(CK)在细胞质和细胞核中均发现了GFP的表达，在质体未检测到绿色荧光信号，可以看出GFP的荧光与质体自发荧光不重合。观察两个TPS14基因融合蛋白的表达情况，与空载表达结果相似，在细胞质中检测到了GFP信号表达，表明LcTPS14和LiTPS14的融合蛋白均在本氏烟草叶片的细胞质中表达(图6)，这两个蛋白在细胞质中发挥作用，与前期预测结果一致。

本实施例通过烟草叶片瞬时表达技术获得LcTPS14和LiTPS14的亚细胞定位，LcTPS14和LiTPS14均在细胞质中表达。

实施例3萜烯合酶基因的原核表达及体外功能研究

本实施例构建目的基因LcTPS14和LiTPS14的原核表达载体，在大肠杆菌中表达目的基因从而获得重组蛋白，以FPP/GPP为底物进行体外酶促反应，GC-MS技术分析生成物质，以期获得重组蛋白的功能。

1、材料与方法

1.1载体与菌株

Arctic-Express BL21(DE3)和BL21(DE3)PLySs表达菌和表达载体pCZN1，pET30a，pGEX-4T-1均购于南京钟鼎生物技术有限公司。大肠杆菌感受态TOP10购于上海唯地生物技术有限公司。

1.2试剂与耗材

Protein Marker(Thermo)、GPP铵盐(Sigma，CAS：763-10-0，货号G6772)、FPP铵盐(Sigma，CAS：13058-04-3，货号F6892)、IPTG(Sigma，CAS：367-93-1)、Arc(Sigma，CAS：79-06-1)、Bis(Sigma，CAS：110-26-9)、Tris(Sigma，CAS：77-86-1)、SDS(Amresco，CAS：151-21-3)、TEMED(BIO-RAD，CAS：110-18-9)、蛋白胨(OXOID)、LB(OXOID)、0.22μm尼龙针筒过滤器(Membrane Solutions)、0.22μm无菌滤器和透析袋(Millipore)、Ni-IDA亲和层析胶(Novagen)，正己烷(色谱纯，CAS：110-54-3)及其它试剂购于北京蓝弋化工产品有限责任公司。

1.3试验方法

(1)表达载体构建

基因LcTPS14、LiTPS14分别按大肠杆菌密码子偏好进行序列优化。序列合成由南京钟鼎生物技术有限公司完成，采用基于PAS的方法，将LcTPS14和LiTPS14分别构建至载体pCZN1的Nde I-Xba I位点之间，pET30a的Nde I-Xho I位点之间，pGEX-4T-1的EcoR I-XhoI位点之间。酶切鉴定重组质粒，酶切体系如下：

含目的基因的质粒转化至大肠杆菌TOP10菌株，挑取阳性菌落测序。

(2)重组载体转化至大肠杆菌

重组质粒转化至大肠杆菌Arctic Express BL21(DE3)或BL21(DE3)PLySs，质粒和感受态细菌按体积比1:100混匀，按说明转化，37℃条件220rpm复性1h，pCZN1和pGEX-4T-1的重组载体涂布于Amp抗性(工作浓度50μg/mL)的LB固体培养基，pET30a的重组载体涂布于含Kana(工作浓度50μg/mL)的LB固体培养基，37℃倒置过夜。

(3)IPTG诱导重组蛋白的表达

挑取转化平板上的单克隆接种于3mL含对应抗生素(50μg/mL)的LB液体培养基中，37℃220rpm振摇过夜。参考Green等(2012)的方法，0.5mM IPTG诱导表达，过程中分别取1mL37℃OD₆₀₀达0.6-0.8菌液，过夜诱导后菌液，菌体超声破碎后上清及沉淀进行12％SDS-PAGE检测蛋白表达情况，考马斯亮蓝显色。

(4)重组蛋白的Ni柱亲和纯化

选择表达效果最好的重组菌株进行蛋白纯化，以空载为对照，Ni亲和层析柱法纯化回收蛋白，12％SDS-PAGE分析。纯化出的蛋白溶液于-80℃超低温冰箱保存。

(7)重组蛋白的体外催化反应

100μL总反应体系，含有13-35μg重组蛋白的缓冲液(PBS+20mM MgCl₂+5mM DTT)，与底物GPP或FPP(工作浓度0.5mM)混合均匀，用100μL色谱纯的正己烷覆盖，30℃催化反应1h，涡旋振荡2min停止反应，离心促进液体分层，吸取上层有机相，无水MgSO₄充分干燥，0.22μm尼龙膜过滤，取1μL液体上机进行GC-MS分析，重复3次。GC-MS检测条件见表2，产物与NIST147比对进行定性分析。

表2 GC-MS检测条件

2、结果与分析

2.1原核表达载体构建

根据大肠杆菌密码子偏好优化LcTPS14和LiTPS14序列，分别与载体pCZN1构建N-his标签融合表达蛋白(6×his+Nde I+目的蛋白+taa+Xba I)、与pGEX-4T-1载体构建N-GST、C-his标签融合表达蛋白(EcoR I+目的蛋白+6×his+taa+Xho I)、与pET30a载体构建C-his标签融合表达蛋白(Nde I+目的蛋白+6×his+taa+Xho I)，重组蛋白分子量见表3。

表3重组蛋白分子量

构建好的重组载体进行测序及双酶切验证，获得含目的基因的重组质粒pCZN1-LcTPS14、pGEX-4T-1-LcTPS14、pET30a-LcTPS14、pCZN1-LiTPS14、pGEX-4T-1-LiTPS14、pET30a-LiTPS14。

2.2重组蛋白的功能分析

重组蛋白分别与不同底物GPP或FPP混合进行催化反应，GC-MS上机分析。在重组蛋白LcTPS14和LiTPS14与底物GPP的反应液里检测到了大量芳樟醇，在底物FPP反应液里检测到了反式-橙花叔醇(图7)。离子峰图见图8。表明LcTPS14和LiTPS14是双功能酶，具有催化FPP生成反式-橙花叔醇，催化GPP生成芳樟醇的功能。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

参考文献:

[1]陈之琳,大花紫薇MADS-box家族B类和C类基因克隆及表达模式研究[D].北京林业大学硕士学位论文.2017.

[2]徐婉.尾叶紫薇特征香气成分释放规律与MEP通路关键基因的研究[D].北京林业大学博士学位论文,2019.

序列表

<110> 北京林业大学

<120> 紫薇属萜烯合酶基因及其应用

<130> KHP211118368.1

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 525

<212> PRT

<213> 尾叶紫薇(Lagerstroemia caudata)

<400> 1

Met Asp Cys Val Glu Ser Leu His Glu Arg Arg Leu Lys Glu Ala Arg

1 5 10 15

His Leu Val Arg Arg Val Glu Lys Gly Ser Leu Glu Ser Leu Val Met

20 25 30

Val Asp Ala Leu Gln Arg Leu Gly Ile Ala Tyr His Phe Glu Glu Glu

35 40 45

Thr Arg Ser Leu Leu Gln Glu His Leu Leu Ser Ala Tyr Asn Gly His

50 55 60

Ser Ser Ser Asp Ser Leu Asn Lys Val Ala Leu Arg Phe Arg Leu Leu

65 70 75 80

Arg Gln Glu Gly Tyr Asn Val Pro Ala Gly Ile Phe Glu Gly Phe Lys

85 90 95

Ser Lys Asp Asp Asn Asn Gly Arg Phe Thr Phe Asp Arg Lys Leu Tyr

100 105 110

Lys Asp Ile Val Gly Leu Met Ser Leu Tyr Glu Ala Ser His Leu Gly

115 120 125

Thr Gln Gly Glu Asp Ile Leu Asp Glu Ala Ala Ser Phe Ser Lys Lys

130 135 140

Ala Leu Thr Gly Thr Leu Asp Arg Leu Leu Cys Ala Gly Asn Asp Thr

145 150 155 160

Asn Gly Ile Ser Ser Pro Ile Leu Arg Glu Leu Val Lys Asn Thr Leu

165 170 175

Ser Asn Pro Phe His Lys Ser Leu Pro Arg Phe Thr Ser Glu Thr Phe

180 185 190

Gln Val Tyr Phe Gly Gly Pro Phe Glu Trp Ile Gly Val Phe Arg Glu

195 200 205

Leu Ala Val Leu Asp Ser Glu Leu Val Ala Ser Ile Asn Arg Asn Glu

210 215 220

Ile Leu Gln Val Ser Lys Trp Trp Lys Asp Leu Gly Leu Ala Lys Glu

225 230 235 240

Leu Lys Phe Ala Arg Asp Gln Pro Met Lys Trp Tyr Leu Trp Pro Met

245 250 255

Ala Val Leu Pro Asp Pro Lys Leu Ser Gln Glu Arg Val Asp Ile Thr

260 265 270

Lys Pro Ile Ala Met Val Tyr Ile Ile Asp Asp Ile Phe Asp Val Tyr

275 280 285

Gly Ser Leu Asp Glu Leu Thr Leu Phe Thr Glu Ala Val Lys Arg Trp

290 295 300

Glu Cys Ile Glu Glu Leu Pro Asp Tyr Met Lys Arg Cys Phe Arg Ala

305 310 315 320

Leu Asp Asp Ile Thr Ser Glu Ile Ser Phe Asn Val Tyr Lys Lys His

325 330 335

Gly Trp Ser Pro Met Asp Leu Leu Lys Glu Ser Trp Lys Ser Leu Phe

340 345 350

Asp Ala Phe Leu Leu Glu Thr Arg Trp Phe Arg Cys His Asn Ser Pro

355 360 365

Ser Ala Asp Glu Tyr Leu Asn Asn Ala Ile Val Thr Ser Gly Val Pro

370 375 380

Leu Val Ile Val His Ile Phe Ala His Leu Cys Glu Gly Leu Asn Lys

385 390 395 400

Gln Cys Leu Asp Lys Leu Ser Gly Phe Ser Glu Ile Ser Ser Ser Thr

405 410 415

Ala Lys Ile Leu Arg Leu Trp Asp Asp Leu Gly Ser Ala Lys Asp Glu

420 425 430

Asn Gln Glu Gly His Asp Gly Ser Tyr Leu Asp Tyr Tyr Met Asn Glu

435 440 445

Asn Pro Ser Cys Ser Leu Glu Gln Ala Thr Asp Arg Val Lys Glu Met

450 455 460

Ile Leu Asp Ala Trp Lys Ser Leu Asn Lys Glu Cys Leu Phe Ser His

465 470 475 480

Thr Phe Ser Thr Ser Val Ala Gln Ala Ser Leu Asn Thr Ala Arg Met

485 490 495

Val Pro Leu Met Tyr Asp Tyr Asp Glu Asn His Cys Leu Pro Arg Ile

500 505 510

Glu Asp Tyr Met Lys Ser Leu Leu Ile Asn Gly Leu Ala

515 520 525

<210> 2

<211> 525

<212> PRT

<213> 白云映霞紫薇(L. indica ‘Baiyunyingxia’)

<400> 2

Met Asp Cys Val Glu Ser Leu His Glu Thr Arg Leu Lys Glu Ala Arg

1 5 10 15

His Leu Val Arg Gly Val Glu Lys Gly Ser Leu Glu Ser Leu Val Met

20 25 30

Val Asp Ala Leu Gln Arg Leu Gly Ile Ala Tyr His Phe Glu Glu Glu

35 40 45

Thr Arg Ser Leu Leu Gln Glu His Leu Leu Ser Ala Tyr Asn Gly His

50 55 60

Ser Ser Ser Asp Ser Leu Asn Glu Val Ala Leu Arg Phe Arg Leu Leu

65 70 75 80

Arg Gln Glu Gly Tyr Asn Val Pro Ala Gly Ile Phe Glu Gly Phe Lys

85 90 95

Ser Lys Asp Asp Asn Ser Gly Arg Phe Thr Phe Asp Arg Lys Leu Tyr

100 105 110

Lys Asp Ile Val Gly Leu Met Ser Leu Tyr Glu Ala Ser His Leu Gly

115 120 125

Thr Gln Gly Glu Asp Ile Leu Asp Asp Ala Ser Ser Phe Ser Lys Lys

130 135 140

Ala Leu Ser Gly Thr Gln Asp Arg Leu Leu Asp Ala Gly Asn Asp Ile

145 150 155 160

Asp Gly Ile Ser Ser Pro Ile Leu Ile Glu Phe Val Arg Asn Thr Leu

165 170 175

Ser Asn Pro Phe His Lys Ser Leu Pro Arg Phe Thr Ser Glu Thr Phe

180 185 190

Gln Val Tyr Phe Gly Gly Pro Tyr Glu Trp Ile Gly Val Phe Arg Glu

195 200 205

Leu Ala Val Leu Asp Ser Glu Leu Ile Ala Ser Ile Asn Arg Asn Glu

210 215 220

Ile Leu Gln Val Ser Lys Trp Trp Lys Asp Leu Gly Leu Ala Lys Glu

225 230 235 240

Leu Lys Phe Ala Arg Asp Gln Pro Met Lys Trp Tyr Leu Trp Pro Met

245 250 255

Ala Val Leu Pro Asp Pro Lys Leu Ser Gln Glu Arg Val Asp Ile Thr

260 265 270

Lys Pro Ile Ala Met Val Tyr Ile Ile Asp Asp Ile Phe Asp Val Tyr

275 280 285

Gly Ser Leu Asp Glu Leu Thr Leu Phe Thr Glu Ala Ile Lys Arg Trp

290 295 300

Glu Cys Ile Glu Glu Leu Pro Asp Tyr Met Lys Arg Cys Phe Arg Ala

305 310 315 320

Leu Asp Asp Ile Thr Ser Glu Ile Ser Phe Asn Val Tyr Lys Lys His

325 330 335

Gly Trp Ser Pro Met Asp Ser Leu Lys Glu Ser Trp Lys Ser Leu Phe

340 345 350

Asp Ala Phe Leu Val Glu Thr Arg Trp Phe Arg Cys Arg Asn Ser Pro

355 360 365

Ser Ala Asp Glu Tyr Leu Asn Asn Ala Ile Val Thr Ser Gly Val Pro

370 375 380

Leu Val Ile Val His Ile Phe Ala His Leu Cys Glu Gly Leu Asn Lys

385 390 395 400

Gln Cys Leu Asp Lys Leu Ser Ser Phe Ser Glu Ile Ser Ser Ser Thr

405 410 415

Ala Lys Ile Leu Arg Leu Trp Asp Asp Leu Gly Ser Ala Lys Asp Glu

420 425 430

Asn Gln Glu Gly His Asp Gly Ser Tyr Leu Asp Tyr Tyr Met Asn Glu

435 440 445

Asn Pro Ser Cys Ser Leu Glu Gln Ala Arg Asp Arg Val Lys Glu Met

450 455 460

Ile Ser Asp Ala Trp Lys Asn Leu Asn Lys Glu Cys Leu Phe Ser His

465 470 475 480

Thr Phe Ser Thr Ser Val Ala Gln Ala Ser Leu Asn Thr Ala Arg Met

485 490 495

Val Pro Leu Met Tyr Asp Tyr Asp Glu Asn His Cys Leu Pro Lys Ile

500 505 510

Glu Asp Tyr Met Lys Ser Leu Leu Ile Asn Gly Leu Ala

515 520 525

<210> 3

<211> 1578

<212> DNA

<213> 尾叶紫薇(Lagerstroemia caudata)

<400> 3

atggattgtg tggaaagctt gcacgagagg aggttgaagg aagcgaggca tttggttcgg 60

agagtggaaa agggatcctt agaaagtctg gtaatggtgg acgctctcca acgccttggc 120

attgcctacc actttgagga agagactcgg agccttctgc aggaacattt gctctccgcc 180

tacaatggcc actccagcag tgacagcctt aacaaggtcg cgcttcgttt tcgacttctc 240

cgacaggaag gctacaatgt tcccgcaggt atttttgagg gcttcaagag caaagacgac 300

aacaatggca gatttacgtt tgaccgaaag ctgtacaagg acattgtcgg attaatgagc 360

ttgtatgaag cttcccatct gggcacacaa ggggaagata tactcgacga ggctgcaagt 420

tttagcaaaa aggccctaac tggtacacta gatagattgt tatgtgctgg taatgatact 480

aacggcataa gttctccgat actaagagag cttgtgaaga acacattgtc aaatcccttc 540

cacaagagct tgccaaggtt cacttctgag actttccaag tttatttcgg tgggcccttc 600

gagtggatcg gagtattcag ggagctggcc gttttggact cggaattggt tgcttccatt 660

aatcggaacg aaatcttaca agtctccaag tggtggaaag atctaggatt agcaaaggag 720

ttgaagttcg caagagatca gcccatgaaa tggtacctgt ggccaatggc agttctaccg 780

gacccgaaat tatcacagga gagagtggat ataacaaagc cgatagccat ggtctacatc 840

atcgacgaca tcttcgatgt ctatgggtcc cttgatgaac tcactctctt cactgaagcc 900

gtcaaaagat gggagtgtat cgaagaactg ccggattaca tgaagagatg cttcagggct 960

ttagatgaca ttacgagtga aatcagcttc aacgtctata aaaagcatgg ctggagtcca 1020

atggatttac tcaaagaatc atggaagagc ttgtttgatg cattcctgct ggaaacgaga 1080

tggtttcgtt gccacaactc tccatctgca gatgagtact tgaacaatgc aatagtcacc 1140

tccggggtgc ccctagtgat tgttcacata tttgcgcacc tgtgtgaagg tctaaataag 1200

cagtgtcttg acaagctgag tggtttctcg gaaatttctt cctcgacagc aaagattcta 1260

cgtctatggg atgacctcgg aagtgccaag gatgagaatc aagaaggtca tgatggctcg 1320

tacttggact actacatgaa cgaaaaccct agttgctcac tcgagcaggc aacagaccgt 1380

gtgaaggaga tgatcttaga tgcatggaag agcctaaaca aagaatgtct cttctcccac 1440

acattctcta cttccgtggc tcaagcttct cttaacactg ccagaatggt ccctctcatg 1500

tacgattacg atgagaacca ttgcctccca agaattgagg attatatgaa gtcattgctg 1560

attaatggtt tagcctaa 1578

<210> 4

<211> 1578

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atggattgcg tggaaagtct gcatgaacgt cgtctgaaag aagcacgcca tctggtgcgt 60

cgtgttgaaa aaggtagcct ggaaagcctg gttatggttg atgcactgca gcgtctgggt 120

attgcatatc attttgaaga agaaacccgt agcctgctgc aggaacatct gctgagcgcc 180

tataatggtc atagcagtag cgatagcctg aataaggtgg ccctgcgctt tcgtctgctg 240

cgccaggaag gctataatgt tccggccggc atttttgaag gctttaaaag taaagatgac 300

aacaatggtc gctttacctt tgatcgcaaa ctgtataaag atattgtggg cctgatgagc 360

ctgtatgaag ccagtcatct gggcacccag ggtgaagata ttctggatga agccgcaagc 420

tttagtaaaa aagccctgac cggcaccctg gatcgtctgc tgtgtgcagg taatgatacc 480

aatggtatta gcagtccgat tctgcgtgaa ctggtgaaaa ataccctgag caatccgttt 540

cataaaagcc tgccgcgctt taccagtgaa acctttcagg tgtattttgg tggtccgttt 600

gaatggattg gcgtttttcg cgaactggca gttctggata gcgaactggt tgccagtatt 660

aatcgcaatg aaattctgca ggttagtaaa tggtggaaag atctgggcct ggcaaaagaa 720

ctgaaatttg cacgtgatca gccgatgaaa tggtatctgt ggccgatggc cgttctgccg 780

gatccgaaac tgagccagga acgcgtggat attaccaaac cgattgcaat ggtgtatatt 840

attgatgata tcttcgacgt ttacggcagt ctggatgaac tgaccctgtt taccgaagcc 900

gtgaaacgct gggaatgcat tgaagaactg ccggattata tgaaacgctg ctttcgtgcc 960

ctggatgata ttaccagtga aattagcttt aacgtgtata aaaagcacgg ttggagtccg 1020

atggatctgc tgaaagaaag ctggaaaagc ctgtttgatg cctttctgct ggaaacccgt 1080

tggtttcgtt gtcataatag cccgagcgca gatgaatatc tgaataatgc aattgtgacc 1140

agtggtgtgc cgctggttat tgttcatatt tttgcacatc tgtgcgaagg tctgaataag 1200

cagtgtctgg ataaactgag cggctttagt gaaatttcaa gtagcaccgc caaaattctg 1260

cgcctgtggg atgatctggg cagtgcaaaa gatgaaaatc aggaaggtca tgatggtagt 1320

tatctggatt attatatgaa cgaaaacccg agctgcagtc tggaacaggc aaccgatcgc 1380

gttaaagaaa tgattctgga tgcatggaaa agtctgaata aggaatgcct gtttagtcat 1440

acctttagca ccagtgttgc acaggcaagt ctgaataccg cacgtatggt tccgctgatg 1500

tatgattatg atgaaaatca ttgcctgccg cgtattgaag attatatgaa gagcctgctg 1560

attaatggtc tggcataa 1578

<210> 5

<211> 1578

<212> DNA

<213> 白云映霞紫薇(L. indica ‘Baiyunyingxia’)

<400> 5

atggattgtg tggaaagctt gcacgagacg aggttgaagg aagcgaggca tttggttcgg 60

ggagtggaaa agggatcctt agaaagtctg gtaatggtgg acgctctcca acgccttggc 120

attgcctacc actttgagga agagactcgg agccttctgc aggaacattt gctctccgcc 180

tacaatggcc actccagtag tgacagcctt aacgaggttg cacttcgttt tcgacttctc 240

cgacaggaag gctacaatgt tcccgcaggt atttttgagg gcttcaagag caaagacgac 300

aacagtggca gatttacgtt tgaccgaaag ctgtacaagg atattgtcgg attaatgagc 360

ttgtatgaag cttcccatct gggcacgcaa ggggaagata tactcgacga tgcttcaagt 420

tttagcaaaa aggccctcag tggtacacaa gatagattgt tagatgctgg taatgatatc 480

gacggcataa gttctccgat actaatagag tttgtgagga acacattgtc aaatcccttc 540

cacaagagct taccaaggtt cacttctgag accttccaag tttatttcgg agggccctac 600

gagtggatcg gagtattcag ggagctggcc gttttggact cggaattgat tgcttccatt 660

aatcgaaatg aaatcttaca agtctccaag tggtggaaag atctagggtt agcaaaggag 720

ttgaagttcg caagagatca gcccatgaaa tggtacctgt ggccaatggc agttctacca 780

gacccgaaat tatcgcaaga gagagtggat ataacaaagc caatagccat ggtctacatc 840

atcgacgaca tcttcgatgt ctatgggtcc cttgatgaac tcactctctt cactgaagcc 900

atcaaaagat gggagtgtat cgaagaactg ccggattaca tgaagagatg tttcagggct 960

ttagatgaca ttacgagtga aatcagcttc aacgtctata aaaagcatgg ctggagtcca 1020

atggattcac tcaaagaatc ctggaagagc ttgtttgatg cattcctggt ggaaacgaga 1080

tggtttcgtt gccgcaactc tccatctgca gatgagtact tgaacaatgc aatagtcacc 1140

tccggggtgc ccctggtgat cgttcacata tttgcgcacc tgtgtgaagg tctgaataag 1200

cagtgtcttg acaagctgag tagtttctcg gaaatttctt cctcgacagc aaagattcta 1260

cgtctatggg atgacctcgg aagtgccaag gatgagaatc aagaaggtca tgatggctcg 1320

tacttggact actacatgaa cgaaaaccct agttgctcac tcgagcaggc aagggaccgt 1380

gtgaaggaga tgatctcaga tgcatggaag aacctaaaca aagaatgtct cttctcccac 1440

acattctcta cttccgtggc tcaagcttct cttaacactg ccagaatggt ccctctcatg 1500

tacgattacg atgagaacca ttgcctccca aaaatcgagg attatatgaa gtcattgctg 1560

attaatggtt tagcctaa 1578

<210> 6

<211> 1596

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atggattgcg tggaaagtct gcatgaaacc cgtctgaaag aagcacgcca tctggtgcgt 60

ggcgtggaaa aaggtagcct ggaaagtctg gttatggtgg atgcactgca gcgtctgggc 120

attgcatatc attttgaaga agaaacccgt agcctgctgc aggaacatct gctgagcgca 180

tataatggtc atagtagcag cgatagcctg aatgaagtgg ccctgcgttt tcgtctgctg 240

cgccaggaag gttataatgt gccggcaggt atttttgaag gctttaaaag taaagacgac 300

aatagtggtc gttttacctt tgatcgtaaa ctgtataaag acattgtggg cctgatgagt 360

ctgtatgaag ccagccatct gggcacccag ggtgaagata ttctggatga tgcaagtagc 420

tttagtaaaa aagccctgag tggtacccag gatcgtctgc tggatgcagg taatgatatt 480

gatggcatta gtagcccgat tctgattgaa tttgtgcgca ataccctgag caatccgttt 540

cataaaagtc tgccgcgttt taccagcgaa acctttcagg tgtattttgg tggtccgtat 600

gaatggattg gtgtgtttcg tgaactggcc gttctggata gcgaactgat tgccagcatt 660

aatcgcaatg aaattctgca ggtgagcaaa tggtggaaag atctgggtct ggcaaaagaa 720

ctgaaatttg cacgcgatca gccgatgaaa tggtatctgt ggccgatggc agtgctgccg 780

gatccgaaac tgagccagga acgtgtggat attaccaaac cgattgccat ggtttatatt 840

attgatgata tcttcgacgt gtacggtagc ctggatgaac tgaccctgtt taccgaagca 900

attaagcgct gggaatgtat tgaagaactg ccggattata tgaaacgttg ctttcgtgcc 960

ctggatgata ttaccagcga aattagtttt aacgtttaca aaaagcacgg ttggagtccg 1020

atggatagcc tgaaagaaag ctggaaaagt ctgtttgatg cctttctggt tgaaacccgt 1080

tggtttcgtt gccgcaatag cccgagcgca gatgaatatc tgaataatgc aattgttacc 1140

agcggcgtgc cgctggttat tgtgcatatt tttgcccatc tgtgtgaagg tctgaataag 1200

cagtgcctgg ataaactgag tagctttagc gaaatttcaa gcagcaccgc caaaattctg 1260

cgcctgtggg atgatctggg tagtgccaaa gatgaaaatc aggaaggtca tgatggtagt 1320

tatctggatt attatatgaa cgaaaacccg agttgcagtc tggaacaggc acgtgatcgc 1380

gttaaagaaa tgattagtga tgcatggaaa aacctgaata aggaatgcct gtttagtcat 1440

acctttagta ccagtgttgc ccaggccagc ctgaataccg cccgtatggt tccgctgatg 1500

tatgattatg atgaaaatca ttgcctgccg aaaattgaag attatatgaa gagcctgctg 1560

attaatggtc tggcacatca tcatcatcac cattaa 1596