一种褐藻胶裂解酶系及其应用
阅读说明：本技术 一种褐藻胶裂解酶系及其应用 (A kind of algin catenase system and its application ) 是由 李福川 路丹荣 关靖雯 王淑敏 张庆冬 焦润苗 于 2019-08-01 设计创作，主要内容包括：本发明属于酶工程技术领域,涉及一种褐藻胶裂解酶系及其应用。一种褐藻胶裂解酶系,包含内切酶AlyPB1和外切酶AlyPB2；所述内切酶AlyPB1氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；外切酶AlyPB2氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。该酶系可应用于生产生物乙醇。两种褐藻胶裂解酶具有良好的协同作用,当两种酶以1:1的酶活比混合时,单糖的生成量是单独的外切酶降解褐藻胶时的6-8倍,大大提高了褐藻胶的糖化效率,为生物乙醇的生产提供了高效新颖的候选酶系。(The invention belongs to technical field of enzyme engineering, it is related to a kind of algin catenase system and its application.A kind of algin catenase system includes restriction endonuclease AlyPB1 and excision enzyme AlyPB2；The restriction endonuclease AlyPB1 amino acid sequence is as shown in SEQ ID NO.3；Excision enzyme AlyPB2 amino acid sequence is as shown in SEQ ID NO.4.The enzyme system can be applied to production bio-ethanol.Two kinds of algin catenases have good synergistic effect, when enzyme activity ratio mixing of two kinds of enzymes with 1:1,6-8 times when the production quantity of monosaccharide is individual excision enzyme degradation algin, the saccharification efficiency of algin is substantially increased, provides efficiently novel candidate enzyme system for the production of bio-ethanol.)
技术领域
本发明属于酶工程技术领域，涉及一种褐藻胶裂解酶系及其应用。
背景技术
随着世界能源需求的不断增长，化石燃料资源的迅速枯竭及其所产生的环境问题逐渐引起了人们的注意。大型藻类作为生产生物燃料的理想原料近来受到极大的关注。由于其不含纤维素，生产过程不占用耕地和消耗淡水资源，不使用肥料，可控制大气中的二氧化碳及能够规避与粮食供应之间的矛盾等优点，使之成为第三代可再生资源的重要候选（MacDonald LC, Weiler EB, Berger BW. Engineering broad-spectrum digestionofpolyuronides from an exolytic polysaccharidelyase. Biotechnology forBiofuels. 2016;9(1):43. Medipally SR, Yusoff FM, Banerjee S, Shariff M.Microalgae as sustainable renewable energy feedstock for biofuel production.BioMed Res Int. 2015;2015:519513. Wargacki AJ, Leonard E, Win MN, RegitskyDD, Santos CN, Kim PB, CooperSR, Raisner RM, Herman A, Sivitz AB, et al. Anengineered microbial platform for direct biofuel production from brownmacroalgae. Science (NewYork, NY). 2012;335(6066):308-13.）。褐藻胶（alginate）是褐藻类植物细胞壁和胞间质中最丰富的碳水化合物，约占褐藻干重的40%（Peng CE, WangQB, Lu DR, Han WJ, Li FC. A Novel Bifunctional Endolytic Alginate Lyase withVariable Alginate-Degrading Modes and Versatile Monosaccharide-ProducingProperties. Frontiers in Microbiology. 2018;9(167):1-14.）。褐藻胶是由β-D-甘露糖醛酸(β-D-Mannuronate,M)及其C5差向异构体α-L-古罗糖醛酸(α-L-Guluronate,G)通过β-1，4糖苷键连接形成的线性阴离子酸性多糖，根据两种糖醛酸排列顺序的不同，分为聚甘露糖醛酸区段(PolyM)、聚古罗糖醛酸区段(PolyG)以及甘露糖醛酸和古罗糖醛酸交替嵌段(PolyMG/GM)（Cheng YY, Wang DD, Gu JY, Li JG, Liu HH, Li FC, Han WJ.Biochemical Characteristics and Variable Alginate-Degrading Modes of a NovelBifunctional Endolytic Alginate Lyase. Applied and EnvironmentalMicrobiology. 2017;83(23):e01608-17.）。植物来源与细菌来源的褐藻胶基本组成单元相似，但细菌来源的褐藻胶C2或C3位羟基容易被不同程度乙酰化。褐藻胶无毒无害，因具有凝胶性、高黏性、生物相容性以及螯合金属离子等特点，被广泛的应用于食品、医药、化工、纺织、生产生物乙醇等行业中（Han WJ, Gu JY, Cheng YY, Liu HH, Li YZ, Li FC.Novel alginate lyase (Aly5) from a polysaccharide-degrading marine bacterium,Flammeovirga sp. strain MY04: effects of module truncation on biochemicalcharacteristics, alginate degradation patterns, and oligosaccharide-yieldingproperties. Applied and Environmental Microbiology. 2015;82(1):364-74.）。
褐藻胶裂解酶是一种通过β-消去反应催化褐藻胶分子内糖苷键断裂的多糖降解酶，并在新产生的褐藻胶寡糖的非还原端形成C4=C5不饱和双键，非还原端的不饱和糖醛酸与M和G糖单元的结构不同，故称为Δ单糖，不饱和寡糖产物在232nm处具有特征吸收（PengCE, Wang QB, Lu DR, Han WJ, Li FC. A Novel Bifunctional Endolytic AlginateLyase with Variable Alginate-Degrading Modes and Versatile Monosaccharide-Producing Properties. Frontiers in Microbiology. 2018;9(167):1-14. Cheng YY,Wang DD, Gu JY, Li JG, Liu HH, Li FC, Han WJ. Biochemical Characteristics andVariable Alginate-Degrading Modes of a Novel Bifunctional Endolytic AlginateLyase. Applied and Environmental Microbiology. 2017;83(23):e01608-17. Han WJ,Gu JY, Cheng YY, Liu HH, Li YZ, Li FC. Novel alginate lyase (Aly5) from apolysaccharide-degrading marine bacterium, Flammeovirga sp. strain MY04:effects of module truncation on biochemical characteristics, alginatedegradation patterns, and oligosaccharide-yielding properties. Applied andEnvironmental Microbiology. 2015;82(1):364-74.）。褐藻胶裂解酶来源广泛，包括动物源（海洋软体动物、棘皮动物）、植物源（海洋藻类）和微生物源（细菌、真菌、病毒）。根据褐藻胶裂解酶对底物的偏好性，可分为M专一性裂解酶、G专一性裂解酶和双功能裂解酶；根据褐藻胶裂解酶的一级结构的不同，CAZy数据库将其划归入7个多糖裂解酶家族，分别为PL-5、PL-6、PL-7、PL-14、PL-15、PL-17、PL-18家族（Xu F, Dong F, Wang P, Cao HY, Li CY, LiPY, Pang XH, Zhang YZ, Chen XL. Novel Molecular Insights into the CatalyticMechanism of Marine Bacterial Alginate Lyase AlyGC from Polysaccharide LyaseFamily 6. Journal of Biological Chemistry. 2017;292(11):4457-68. Uchimura K,Miyazaki M, Nogi Y, Kobayashi T, Horikoshi K. Cloning and Sequencing ofAlginate Lyase Genes from Deep-Sea Strains of Vibrio and Agarivorans andCharacterization of a New Vibrio Enzyme. Mar Biotechnol. 2010;12(5):526-33.Zhu B, Yin H. Alginate lyase: Review of major sources and classification,properties, structure-function analysis and applications. Bioengineered Bugs.2015;6(3):125-31. Lee SI, Choi SH, Lee EY, Kim HS. Molecular cloning,purification, and characterization of a novel polyMG-specific alginate lyaseresponsible for alginate MG block degradation in Stenotrophomas maltophiliaKJ-2. Appl Microbiol Biotechnol. 2012;95(6):1643-53. Cantarel BL, CoutinhoPM, Rancurel C, Bernard T, Lombard V, Henrissat B. The Carbohydrate-ActiveEnZymes database (CAZy): An expert resource for glycogenomics. Nucleic AcidsRes. 2009;37:D233-D238.）；根据褐藻胶裂解酶的降解模式不同，分为内切型裂解酶和外切型裂解酶，迄今为止已鉴定的褐藻胶裂解酶多数为内切酶，内切型褐藻胶裂解酶酶活力高，稳定性好，其作用于褐藻胶可快速产生一系列分子尺寸不同的不饱和寡糖，最小产物多为不饱和二糖（Badur AH, Jagtap SS, Yalamanchili G, Lee JK, Zhao HM, Rao CV.Alginate Lyases from Alginate-Degrading Vibrio splendidus 12B01 AreEndolytic. Applied and Environmental Microbiology. 2015;81(5):1865-73. Li SY,Wang LN, Chen XH, Zhao WW, Sun M, Han YT. Cloning, Expression, andBiochemical Characterization of Two New Oligoalginate Lyases with SynergisticDegradation Capability. Marine Biotechnology. 2018;20(1):75-86.），这些不饱和寡糖不能直接转化为生物燃料。然而，外切型褐藻胶裂解酶是从褐藻胶分子的一端依次降解，产物为不饱和单糖，不饱和单糖在非酶催化下可自动转变为4-deoxy-L-erythro-5-hexoseulose uronic acid （DEH）或2,4,5,6-tetrahydroxytetrahydro-2H-pyran-2-carboxylic acid （TPC），DEH和TPC在还原酶（DehR）的作用下被还原成2-酮-3-脱氧葡萄糖酸盐（KDG），KDG可以进入细菌ED途径从而被细菌利用或者转化为生物乙醇（Preiss J,Ashwell G. Alginic acid metabolism in bacteria. I. Enzymatic formation ofunsaturated oligosaccharides and 4-deoxy-L-erythro-5-hexoseulose uronic acid.Journal of Biochemistry. 1962;237:309-16. Li SY, Wang LN, Han F, Gong QH, YuWG. Cloning and characterization of the first polysaccharide lyase family 6oligoalginate lyase from marine Shewanellasp. Kz7. Journal of Biochemistry.2016;159(1):77-86.）。
在褐藻胶转化为生物乙醇的过程中，外切型褐藻胶裂解酶发挥着至关重要的作用。然而目前关于外切酶的研究较少，且已鉴定的外切型褐藻胶裂解酶均表现出酶活力低，稳定性差等缺点（Wang LN, Li SY, Yu WG, Gong QH. Cloning, overexpression andcharacterization of a new oligoalginate lyase from a marine bacterium,Shewanella sp. Biotechnol Lett.2015;37(3):665-71.）。另外，通常一个细菌基因组中往往同时存在内切型褐藻胶裂解酶和外切型褐藻胶裂解酶的基因，表明细菌在两种酶共同作用下能够将褐藻胶完全降解并且吸收利用。因此，内切酶和外切酶的协同作用可以极大地促进褐藻胶的糖化效率。然而过去的研究主要集中在单一酶的分类、酶学性质、底物降解模式和酶的结构和功能研究上，对来自同菌株的褐藻胶裂解酶系的研究较少。与单一酶生物催化相比，多酶协同催化能够提高褐藻胶的利用率并降低生产成本，但目前对内、外切褐藻胶裂解酶协同催化研究很少，缺乏协同作用机制清楚，能高效降解褐藻胶的褐藻胶裂解酶系，因此，寻找新型高效的褐藻胶裂解酶系对于生物乙醇的低成本生产具有重要意义。
发明内容
为了弥补现有技术中的不足，本发明提供一种褐藻胶裂解酶系，该酶系包含内切型褐藻胶裂解酶AlyPB1和外切型褐藻胶裂解酶AlyPB2，具有高效的降解褐藻胶的酶活性。
本发明解决其技术问题采用的技术方案是：一种褐藻胶裂解酶系，包含内切酶AlyPB1和外切酶AlyPB2；所述内切酶AlyPB1氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；外切酶AlyPB2氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
作为本发明进一步的改进，所述的内切酶AlyPB1的编码基因核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
作为本发明的进一步改进，所述的外切酶AlyPB2的编码基因核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
本发明还提供了一种褐藻胶裂解酶系的应用，该酶系在生产生物乙醇中的应用。
作为本发明的进一步改进，所述应用中，酶系中内切酶AlyPB1和外切酶AlyPB2酶活比为1:1。
进一步的，内切酶AlyPB1对褐藻胶和聚古罗糖醛酸的比活力分别为185U/mg和1295U/mg，对聚甘露糖醛酸的比活力较低（<1 U/mg）。
进一步的，外切酶AlyPB2对褐藻胶、聚古罗糖醛酸、聚甘露糖醛酸的比活力分别为10.93U/mg、8.5U/mg和14.63U/mg。
本发明还提供了一种利用本发明的酶系降解褐藻胶的方法，该方法为：将3mg/mL的褐藻胶、150mM pH8.0的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液按照体积比1:1的比例混合，内切酶AlyPB1与外切酶AlyPB2以1:1的酶活比预混后，加入到反应体系中，并补加去离子水至300微升，于20℃条件下反应10min，反应结束。
本发明的褐藻胶裂解酶系，具有以下有益效果：
1、内切型褐藻胶裂解酶AlyPB1，理化性质稳定，降解活性高，最终的主产物是不饱和二糖、不饱和三糖和不饱和四糖，是一种G-倾向性的内切型褐藻胶裂解酶，具备工业应用的潜质。
2、外切型褐藻胶裂解酶AlyPB2，该酶为外切型双功能褐藻胶裂解酶，从非还原端降解多糖及寡糖底物，产物为不饱和单糖。
3、两种褐藻胶裂解酶具有良好的协同作用，当两种酶以1:1的酶活比混合时，单糖的生成量是单独的外切酶降解褐藻胶时的6-8倍，大大提高了褐藻胶的糖化效率，为生物乙醇的生产提供了高效新颖的候选酶系。
附图说明
图1、重组褐藻胶裂解酶AlyPB1(A)和AlyPB2(B)的蛋白质三维结构模型；
图2、褐藻胶裂解酶AlyPB1(A)和AlyPB2(B)的表达及纯化情况的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱；
其中：泳道1、蛋白质分子量标准，条带自上至下大小为 116 kD，66.2 kD，45 kD，35kD，25 kD，18.4 kD，14.4 kD；泳道2、对照菌株破壁前菌体，上样量10 µL，泳道3、重组菌破壁后菌液，上样量 10 µL，泳道4、重组菌破壁后上清，上样量10 µL，泳道5、经镍柱纯化的AlyPB1或AlyPB2，上样量10 µL；
图3、温度对褐藻胶裂解酶AlyPB1(A)和AlyPB2(B)的活性影响曲线；
图4、pH对褐藻胶裂解酶AlyPB1(A)和AlyPB2(B)的活性影响曲线；
图5、温度对褐藻胶裂解酶AlyPB1(A)和AlyPB2(B)的稳定性影响曲线；
图6、金属离子及化学试剂对褐藻胶裂解酶AlyPB1(A)和AlyPB2(B)活性的影响曲线；
图7、重组褐藻胶裂解酶AlyPB1不同时间降解褐藻胶的降解产物的高效液相（HPLC）分析图；
图中：UDP2：不饱和二糖，UDP3：不饱和三糖；UDP4：不饱和四糖，UDP5：不饱和五糖，UDP6：不饱和六糖；
图8、重组褐藻胶裂解酶AlyPB2不同时间降解褐藻胶的降解产物的高效液相（HPLC）分析图；
图中： UDP1：不饱和单糖，DEH和TPC：不饱和单糖转化物；
图9、褐藻胶裂解酶AlyPB2不同时间降解荧光标记的饱和褐藻胶五糖的降解产物的高效液相（HPLC）分析图；
图中：2-AB-Alg5：荧光标记的饱和褐藻胶五糖，2-AB-Alg2-4：荧光标记的不饱和褐藻胶二糖、三糖和四糖；
图10、褐藻胶裂解酶AlyPB2对不同分子尺寸褐藻胶底物的酶活力分析图；
图11、褐藻胶裂解酶AlyPB1和AlyPB2的协同作用分析图；
图中：UDP1：不饱和单糖，UDP2：不饱和二糖，UDP3：不饱和三糖；UDP4：不饱和四糖。
具体实施方式
以下实施例的阐述，是为了全面公开本发明如何实施的一些常用技术，而不是为了限制本发明的应用范围。发明人已经尽最大努力确保实施例中个参数的准确性（例如量，温度，等等），但是一些实验误差和偏差也应该予以考虑。除非另有说明，本发明中分子量是指平均分子量，温度是指摄氏度。
生物材料来源
一株发光杆菌（Photobacterium sp.）FC615，2018年12月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC NO. 16918。
实施例1、发光杆菌（Photobacterium sp.）FC615基因组DNA的提取
将发光杆菌（Photobacterium sp.）FC615接种至液体培养基中，在30 ℃、200 rpm的条件下，振荡培养至OD600=0.8；取培养菌液40 mL，在12,000 rpm条件下离心25 min，收集菌体沉淀，用20 mL的溶菌酶缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 8.0）洗涤，在12,000 rpm条件下离心25 min，收集菌体沉淀。
上述菌体沉淀中，每管加入溶菌酶缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 8.0）12.0 mL，得到约14.0 mL的菌液，分别加入浓度为20 mg/mL的溶菌酶各560 µL，其终浓度约800 µg/mL；冰浴1.0 h后，37 ℃温浴2 h，至溶液粘稠；加入10wt% SDS （十二烷基磺酸钠）0.82 mL，100mg/mL的蛋白酶K溶液60 µL，52 ℃水浴1.0 h；加入Tris-平衡过的酚/氯仿/异戊醇（体积比25：24：1）15 mL，轻轻颠倒混匀，至充分乳化；10,000g、4℃条件下离心10 min，转移上清，加入2.0 mL的NaAc-HAc（pH 5.2，3.0 M）缓冲液，以及17.0 mL的无水乙醇，混匀；用1.0 mL的枪头挑出丝状DNA，转移至1.5 mL的EP离心管中，以70wt%的乙醇（贮于-20℃），洗涤2次，微离心后弃上清；10,000g、4 ℃条件下离心3 min，彻底弃掉上清；样品于无菌工作台中，酒精灯下风吹干燥；用无菌去离子水重悬溶解DNA样品，4℃过夜，得到大分子量基因组DNA。
实施例2、发光杆菌（Photobacterium sp.）FC615菌株基因组扫描及其序列分析
将实施例1制得的大分子量基因组DNA进行测序（美吉生物公司）。用NCBI （NationalCenter for Biotechnology Information, http://www.ncb1.nlm.nih.gov/）上的软件对测序结果进行分析。所用到的NCBI分析软件是Open Reading Frame Finder（ORF Finder,http://www. ncb1.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）和 Basic Local Alignment SearchTool（BLAST, http://blast.ncb1.nlm.nih.gov/Blast.cgi）。
NCBI分析结果显示发光杆菌（Photobacterium sp.）FC615菌株基因组上携带两个褐藻胶裂解酶基因alypb1和alypb2，其中alypb1基因编码区长1638bp，alypb2基因编码区长2043bp，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。用BLAST软件在线分析，结果显示AlyPB1与Vibrio splendidus OU02的全基因组序列中polyguluronate-specificlyase基因所编码的由536氨基酸组成的褐藻胶裂解酶AlyF (NCBI序列号：6A40_A)有60.23％的同源性；AlyPB2与Vibrio splendidus 12B01的全基因组序列中oligoalginatelyase基因所编码的由692氨基酸组成的褐藻胶裂解酶OalA (NCBI序列号：EAP93067.1)有93％的同源性。
褐藻胶裂解酶基因alypb1编码的褐藻胶裂解酶AlyPB1，由545个氨基酸组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，蛋白质的理论分子量约为57.6kD。用Simple ModularArchitecture Research Tool（SMART， http://smart.embl_heidelberg.de/）分析褐藻胶裂解酶AlyPB1的结构信息，结果显示N端第1至第21个氨基酸是信号肽序列，第74-459位氨基酸序列属于多糖裂解酶6超家族。用SWISS-MODEL同源建模服务器（http://swissmodel.expasy.org）对褐藻胶裂解酶AlyPB1的蛋白质三维结构进行同源建模，最终得到的AlyPB1蛋白质三维结构模型如图1A所示。
褐藻胶裂解酶基因alypb2编码的褐藻胶裂解酶AlyPB2，由680个氨基酸组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，蛋白质的理论分子量约为77.7kD。用Simple ModularArchitecture Research Tool（SMART，http://smart.embl_heidelberg.de/）分析褐藻胶裂解酶AlyPB2的结构信息，结果显示褐藻胶裂解酶AlyPB2中无信号肽序列，其中第396-571位氨基酸序列属于肝素酶Ⅱ/Ⅲ结构域。用SWISS-MODEL同源建模服务器（http://swissmodel.expasy.org）对褐藻胶裂解酶AlyPB2的蛋白质三维结构进行同源建模，最终得到的AlyPB2蛋白质三维结构模型如图1B所示。
实施例3、alypb1和alypb2基因在大肠杆菌中的重组表达
以实施例1制得的大分子量基因组DNA为模板，进行PCR扩增，引物如下：
正向引物alypb1-F:catatgtcgacccaagatacaccagtaccggtac，SEQ ID NO.5；
反向引物alypb1-R:ctcgaggctcttcggtgcaacctgcaaacggtag，SEQ ID NO.6；
正向引物alypb2-F:catatgaagctggagaatgatacttcagcagg，SEQ ID NO.7；
反向引物alypb2-R: ctcgagcagctcgatagtcactaactcgccgtc，SEQ ID NO.8。
在正向和反向引物中，标注有下划线的碱基序列分别为限制性内切酶NdeI和XhoI的酶切位点。Primerstar HS DNA聚合酶购自宝生物公司，PCR反应体系按照公司提供的产品说明操作。
PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性40s，60 ℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10min，4℃稳定15min。
alypb1和alypb2的基因片段经PCR扩增后，利用限制性内切酶NdeI和XhoI对PCR产物和pET-22b表达载体进行双酶切处理，然后通过琼脂糖凝胶电泳回收双酶切处理过的alypb1基因片段、alypb2基因片段以及pET-22b表达载体酶切大片段，限制性内切酶NdeI、XhoI以及Primerstar HS DNA聚合酶购自宝生物公司，pET-22b载体购自美国Novagen公司，酶与底物反应的体系、反应温度以及反应时间均遵循使用说明书。
利用T4 DNA ligase将酶切处理过的alypb1、alypb2基因片段分别与同样经过双酶切的pET-22b表达载体于16℃水浴条件下进行连接，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α菌株后，涂布到含50µg/mL氨苄青霉素的Luria-Bertani培养基固体平板上；37℃培养12-14h，挑取单克隆到含有50µg/mL的氨苄青霉素液体Luria-Bertani培养基中，37℃、200rpm摇床培养12-14h后，提取质粒；将质粒用正向引物和反向引物进行菌液PCR验证，结果得到大小正确的扩增产物，初步证明构建的重组质粒正确，取出20µL重组质粒送去生工生物公司测序，测序结果表明，alypb1（SEQID NO .1）和alypb2（SEQID NO .2）基因片段均成功***到pET-22b表达载体的酶切位点NdeI、XhoI之间，***方向正确，且未发生碱基突变、缺失以及增加的情况，所以进一步证明构建的重组质粒正确，将重组表达载体命名为pET22b-alypb1和pET22b-alypb2。T4 DNA ligase购自TaKaRa公司，连接反应体系、反应温度、反应时间均遵循使用说明书。
将重组质粒pET22b-alypb1和pET22b-alypb2分别转化到大肠杆菌BL21（DE3）（购自美国Novagen公司），然后按照该公司提供的操作步骤进行重组褐藻胶降解酶AlyPB1和AlyPB2的诱导表达，利用Ni Sepharose 6 Fast Flow（GE）凝胶对目的蛋白进行纯化，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳对纯化的目的蛋白进行检测，检测结果如图2所示，纯化后的重组褐藻胶裂解酶AlyPB1（图2A）和AlyPB2（图2B）在电泳胶上均呈单一条带，且位置与预测的分子量相吻合，纯度均达到95％。
实施例4、重组褐藻胶裂解酶AlyPB1和AlyPB2的酶学性质分析
1、温度对酶活性的影响
首先将3mg/mL的褐藻胶、150mM pH7.0的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液、AlyPB1或AlyPB2酶液以及去离子水按照10:10:3:7（体积比）的比例混合后，分别在0℃、10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃条件下反应1h，反应结束后，按紫外分光光度法测定酶活力，检测结果如图3所示，AlyPB1（图3A）和AlyPB2（图3B）分别在30 ℃和20 ℃时达到最大活力，表明重组褐藻胶裂解酶AlyPB1的最适反应温度为30℃，AlyPB2的最适反应温度为20℃。
紫外法测定酶活力的方法参考现有技术（Yamagata, T., et al., Purificationand properties of bacterial chondroitinases and chondrosulfatases. TheJournal of biological chemistry, 1968. 243(7): p. 1523-35），是以灭活酶为阴性对照，利用分光光度计测定反应产物232nm光吸收判断产物生产量从而判定酶活力的大小。
2、pH对酶活性的影响
将3mg/mL的褐藻胶、反应缓冲液、AlyPB1或AlyPB2酶液以及去离子水按照10:10:3:7（体积比）的比例混合，反应缓冲液包括150mM的NaAc-HAc（pH5.0-6.0）、150mM的NaH2PO4-Na2HPO4（pH6.0-8.0）、150mM的Tris-HCl（pH7.0-10.0）。在最适温度条件下反应1h，反应结束后，按紫外分光光度法测定酶活力，检测结果如图4所示，重组褐藻胶裂解酶AlyPB1和AlyPB2在NaH2PO4-Na2HPO4（pH 8.0）时达到最大活力，表明重组褐藻胶裂解酶AlyPB1（图4A）和AlyPB2（图4B）的最适反应pH为8.0。
3、温度对酶稳定性的影响
将在不同温度（0℃-70℃）下热处理1、2、4、8、12、24h后的AlyPB1或AlyPB2酶液与3mg/mL的褐藻胶，在最适温度和最适pH下测定残余酶活，以不经过热处理的酶液酶活定义为100%相对活力（relativie activity），检测结果如图5所示，重组褐藻胶裂解酶AlyPB1在0-30℃，24h后仍保持80％以上的酶活力（图5A），AlyPB2在0-20℃，24h后仍能够保持90％以上的酶活力（图5B）。
4、金属离子对酶稳定性的影响
将3mg/mL的褐藻胶、150mM pH8.0的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液、AlyPB1或AlyPB2酶液以及去离子水按照10:10:3:4（体积比）的比例混合，接着向反应体系中添加不同的金属离子，添加的金属离子终浓度为1mM和10mM，在最适温度条件下反应1h，反应结束后，按紫外分光光度法检测残余酶活力，以未加金属离子的酶活力定义为100％，检测结果如图6A所示，Na+、DTT、β-巯基乙醇、Glycerol对AlyPB1的酶活性有微弱促进作用、Li+、K+、Pb2+、Mg2+和咪唑对AlyPB1的酶活性基本无影响，Fe2+、Ag+和EDTA对AlyPB1的酶活性呈现微弱抑制作用，Co2+、Hg2+、Ni2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+、Ca2+、Cr3+、Fe3+和SDS对AlyPB1的酶活性具有强烈抑制作用；检测结果如图6B所示，Co2+(1mM)、β-巯基乙醇和DTT明显促进AlyPB2的酶活性，其中β-巯基乙醇(10mM)促进作用最大，能够达到350％，Li+、K+、Na+和Cr3+对AlyPB2的酶活性具有微弱促进作用，Fe2+、咪唑和Glycerol对AlyPB2的酶活性基本无影响，Pb2+和Fe3+(10mM)对AlyPB2的酶活性呈现微弱抑制作用，Ag+、Hg2+、Ni2+、Mn2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Ca2+、EDTA和SDS对AlyPB2的酶活性具有强烈的抑制作用。
实施例5、重组褐藻胶裂解酶AlyPB1和AlyPB2的酶活力测定
将3mg/mL的褐藻胶、150mM pH8.0的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液、酶液以及去离子水按照10:10:3:7（体积比）的比例混合，在最适条件下进行反应，反应时间为：1-10min，阴性对照中加入等量的灭活酶，反应结束后，按前述的紫外分光光度法测定酶活力。对聚古罗糖醛酸和聚甘露糖醛酸底物的降解活性按照上述方法测定。同时用购于康为世纪公司的蛋白质定量试剂盒测定AlyPB1和AlyPB2酶液的蛋白含量，结果表明：重组褐藻胶裂解酶AlyPB1对褐藻胶和聚古罗糖醛酸区段的比活分别为185U/mg和1295U/mg，对聚甘露糖醛酸区段的比活极低（<1U/mg），表明AlyPB1是G-倾向性褐藻胶裂解酶。重组褐藻胶裂解酶AlyPB2对褐藻胶、聚甘露糖醛酸和聚古罗糖醛酸区段的比活分别为10.93U/mg，14.63U/mg，8.5U/mg。表明AlyPB2为双功能褐藻胶裂解酶。
实施例6、重组褐藻胶裂解酶AlyPB1和AlyPB2降解褐藻胶的降解产物的高效液相（HPLC）分析
将3mg/mL的褐藻胶、150mM NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液（pH8.0）、AlyPB1或AlyPB2酶液以及去离子水按照10:10:3:7（体积比）的比例混合，在最适条件下进行反应，选取不同酶解时间以及彻底降解产物进行HPLC分析，HPLC分析条件为凝胶柱：superdex peptide 10/300 GL（GE）；流动相：0.2 M碳酸氢铵；流速：0.4 mL/min；检测条件：UV232nm。
检测结果如图7所示，重组褐藻胶裂解酶AlyPB1降解多糖的过程中，首先生成较大分子量的寡糖，大分子量的寡糖快速被降解为更小分子量的寡糖。另外，AlyPB1将褐藻胶彻底降解时，终产物主要为不饱和二糖、不饱和三糖，不饱和四糖以及少量的不饱和五糖和不饱和六糖。根据对褐藻胶的时间梯度实验以及最终降解产物表明AlyPB1是一种内切型褐藻胶裂解酶；图8所示，重组褐藻胶裂解酶AlyPB2降解多糖的过程中，从始至终仅能看到单糖峰，根据该多糖降解模式可以初步判断AlyPB2是一种外切型褐藻胶裂解酶。
实施例7、重组外切型褐藻胶裂解酶AlyPB2的降解方向
将经过2-AB荧光标记后的饱和褐藻胶五糖（2-AB-Alg5）、AlyPB2酶液、150 mMNaH2PO4-Na2HPO4缓冲液（pH8.0）以及水，按2：3：10：15（体积比）的比例混合后，在最适条件下进行反应，选取不同酶解时间的降解产物进行HPLC分析，HPLC分析条件为凝胶柱：superdex peptide 10/300 GL（GE）；流动相：0.2 M碳酸氢铵；流速：0.4 mL/min；检测条件：Ex 330nm，Em 420nm。
图9所示，AlyPB2在降解2-AB-Alg5时，首先生成较大分子量的不饱和寡糖2-AB-Alg4和2-AB-Alg3，大分子量的寡糖快速被降解为更小分子量的寡糖2-AB-Alg2，该结果表明外切酶AlyPB2是从褐藻胶多糖及寡糖的非还原端逐个切割糖醛酸。在降解荧光标记寡糖时，终产物为荧光标记的二糖而不能完全降解为单糖，表明荧光标记对AlyPB2的降解产生了空间位阻效应。
实施例8、重组外切型褐藻胶裂解酶AlyPB2对不同分子尺寸底物的酶活力测定
将3mg/mL的多糖或寡糖底物、150mM pH8.0的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液、AlyPB2酶液以及去离子水按照10:10:3:7（体积比）的比例混合。多糖底物包括褐藻胶以及褐藻胶酸解产物（10-25KDa），寡糖底物是内切酶AlyPB1的酶解产物UDP2-UDP10。在最适条件下进行反应，反应时间为：1-10min，阴性对照中加入等量的灭活酶，反应结束后，按前述的紫外分光光度法测定酶活力。以AlyPB2对褐藻胶的酶活力定义为100％，结果如图10所示，外切酶AlyPB2的酶活力大小是底物分子尺寸依赖型，其对寡糖的酶活力显著高于多糖底物，最适底物是不饱和四糖，对其酶活力约为对褐藻胶多糖的6.5倍。
实施例9、重组褐藻胶裂解酶AlyPB1与AlyPB2的协同作用机制分析
将3mg/mL的褐藻胶、150mM pH8.0的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液按照1:1（体积比）的比例混合，内切酶AlyPB1与外切酶AlyPB2以1:1（各50mU）的酶活比预混后，加入到反应体系进行反应，并补加去离子水至300微升，以只加100mU的内切酶AlyPB1或100mU的外切酶AlyPB2作为阴性对照，于20℃条件下反应10min，反应结束后，将反应产物进行HPLC分析，结果如图11所示，当两种褐藻胶裂解酶以1:1的酶活比混合时，单糖的生成量约为单独外切酶降解褐藻胶时的6-8倍，结合外切酶AlyPB2对不同分子尺寸底物的酶活力的结果我们发现，AlyPB2可以快速降解内切酶AlyPB1产生的不饱和寡糖，从而提高褐藻胶的糖化效率，表明重组褐藻胶裂解酶AlyPB1与AlyPB2在降解褐藻胶底物时具有良好的协同作用。
结果分析
来自同一菌株Photobacteriumsp. FC615的褐藻胶裂解酶系中包含两种不同类型的褐藻胶裂解酶，内切型褐藻胶裂解酶AlyPB1和外切型褐藻胶裂解酶AlyPB2，两种酶在共同降解褐藻胶时具有显著的协同作用，其单糖的生成率是单独外切酶降解褐藻胶时的6-8倍，两者的协同作用机制主要表现为：1.内切酶AlyPB1偏好降解聚古罗糖醛酸区段，外切酶AlyPB2偏好降解聚甘露糖醛酸区段，表明两种褐藻胶裂解酶具有互补的底物谱；2. AlyPB1和AlyPB2的最适反应条件相似，在20℃，NaH2PO4-Na2HPO4 pH8.0条件下均能达到90％以上的活性，表明两者在该条件下均可以高效的发挥作用；3. AlyPB1和AlyPB2的酶活力和稳定性显著不同，内切酶AlyPB1的酶活力较高，稳定性好，能够快速的将褐藻胶降解为一系列的不饱和寡糖。外切酶AlyPB2的酶活力是分子尺寸依赖型，其对不饱和寡糖的酶活力显著高于多糖底物，表明AlyPB2可以快速降解内切酶的酶解产物，产生大量的不饱和单糖，提高褐藻胶的利用率。在褐藻胶向生物乙醇转化的过程中，外切型褐藻胶裂解酶发挥着至关重要的作用，但外切酶酶活力低、稳定性差等缺陷难以克服，因此本发明对于寻找高效的褐藻胶裂解酶系，发挥内切酶和外切酶的协同作用，成功规避外切酶自身的缺陷，对生物乙醇的生产具有重要的意义。
序列表
<110> 山东大学
<120> 一种褐藻胶裂解酶系及其应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1638
<212> DNA
<213> 褐藻胶裂解酶基因alypb1(Photobacterium sp)
<400> 1
atgaaaaaac acacgccaat cgcgctggca ttgctggcgg cgatgtcttt taacgtccat 60
gcttcgaccc aagatacacc agtaccggta cagttgcctg aggttgccac ttggccatcc 120
attgctgaag tgtcactgca atctttgacg gccgagcagc ttgttgaagc agcaagccgt 180
gaagttgtta atacgaccaa ggtggacgtt gctagcgata ctgctgtaga agctttgaag 240
cagcagcttg aaaatgccaa gccgggtgag gtgatcagta ttgcgcctgg ccgttatgcc 300
aatttgggtg tggttgaact gacagccgat gatattactg tgaaagctga tcagccgggt 360
acggtattgc tgaccggttt ggtgcagctg gtggtgaaag gggatgacat taccctcgat 420
agcatagtgt ttactgaagg cggcccggca gagcgctttg gtggcgtacg tctggaaggt 480
atgcgtaata ctttgcagaa ctcgactttc tactacttta atgatgacta cgagtatgaa 540
ccggacgaga ggcgtagtga gtacccacgt tacttgtggg tgtcgttatg gggcaaagat 600
ggcaaggtca tcaacaaccg cttcgagggt aagcacaagc gcggcacctt gatcggtatc 660
cagaagaaca ttgacgataa ggcggataac catcttatcg aaggaaatat attctattcc 720
cagaagaaga accgctacaa cgagttggcg attgaagagg ccgtgcgata caacggtaac 780
agttgggaag cgatccgcat cggtgactcg aagagcagcc agtggccgtc gcgcacccag 840
ttcgtgaaca atttgctggt ggactccgac ggcgagcgtg aattgatctc ggtaaaatca 900
ggtgagaacc gcatagcggg taacactatc tttgagagcg cgtcgatgat ctccctgcgt 960
catggcaagg cgaatctggt tgagaacaac gtgatcattg ggaacagcaa gcaagatacc 1020
ggtggtatcc gtatctacga tgaagatcat gttgtccgca ataactatct cgtaggcttg 1080
cgaggatcgg gtggccaaat cgcgggtaac gctgatgtac gcggtggtgt ggtgatcaac 1140
accggcatca tcgatgtgaa gaacaacgaa cagcttgacc aggaagttaa aggcaaagag 1200
ctgaataagc agtggacacc gaaaaacgtc acggttgaaa acaacaccat ggtggatgtt 1260
gaattcggta tggtgcacgg caatcagggc caccgtgtca gcctattcga taacagccag 1320
gtagaagcta tcttcactgg caataacatc accttcagta gcaatgtggt gtttaacctc 1380
gatgaaaccc tgcaggcatt gcgtgccgat ccggccacac cactaacggg ccctacctac 1440
agcgatgagc tttactttgg tcaggttcac ggtattgatg gggttccagc aggtgtttcc 1500
caacaaaaac caacctatac caaagtgggt gatttttatc agttcgcaga aggcggtgcc 1560
gatgtgtcga aacttcacgt actgaccgct gatgaaatcg gcccaagcta ccgtttgcag 1620
gttgcaccga agagctag 1638
<210> 2
<211> 2043
<212> DNA
<213> 褐藻胶裂解酶基因alypb2(Photobacterium sp)
<400> 2
atgaagctgg agaatgatac ttcagcaggt aaccttgtag acctactccc tatcgaagta 60
caaaagcgtg acttcgatct atcattccta ggcaacttga gcgaagagcg tcctcgtctt 120
ctggttcaag ctacagatct agcagaattt aaagccaacg ttcaggcaga tgaatcacac 180
tgcatgttcg atgacttttt caacaactct acggttaaat tcctagagac ggcaccgtat 240
gaagagcctc agccttaccc agaagagaca gtaggcaaag catcactatg gcgcccttac 300
tggcgccaaa tgtacgttga ctgccagatg gctcttaacg caacgcgtaa cctagcaatc 360
gcgggtatcg tgaaagaaga cgaagagcta atcgcgaaag caaaagcgtg gacgctaaaa 420
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tctgcgatca tcccaacttg tattgcgcta taccatgacc acccgaaagc gggcgagtac 720
attgcctacg cgctagagta ctacgcagtg cattacccgc catggggcgg tgaagacggc 780
ggttgggctg aaggtcctga ctactggaac acccaaactg cattcctagg cgaagcattc 840
gatttgctga aagcctactg tggcgtagat atgttcaata aaacattcta cgaaaacacc 900
ggtgacttcc cgctttactg tatgcctgtt cactctaagc gtgcgagctt ctgtgaccag 960
tcttcaatcg gtgatttccc aggcctgaaa ctggcttaca acatcaagca ctacgcaggg 1020
gttaaccaga agccagagta cgtttggtac tacaaccagc taaaaggtcg tgatactgaa 1080
gcacacacta agttctacaa cttcggttgg tgggacttcg gctacgacga tcttcgcttc 1140
aacatcctat gggatgcacc agaagagaaa gcaccgtcta acgatccact gctgaaagtc 1200
ttcccaatca cgggttgggc ggcgttccac aacaagatga ccgagcgtga taaccacatc 1260
cacatggtct tcaagtgttc accgtttggc tcaatcagcc actcgcacgg tgaccagaac 1320
gcattcaccc tgcacgcatt cggcgaaacc ctagcagcta tcaccggcta ctacggtggc 1380
tttggtgttg atatgcacac caagtggcgt cgtcaaacgt tctctaagaa cctgcctctc 1440
ttcggtggca agggccagta cggcgagaat aagaacacgg gctatgaagg tcaccaagac 1500
cgtttctgta tcgaagcagg cggtaacatc actgactacg acactgagtc tgatgtgaaa 1560
atggttgaag gtgatgcaac ggcttcttac aagtatttcg tacctgaaat cgagtcttac 1620
aagcgtaaga tttggttcgt acagggtaaa gtattcgtca tgcaagacaa ggctacgctt 1680
tctgaagaga aagacatgac ttggctaatg cataccactt tcgctaacga agtggctgat 1740
aagtcgttca ctatccgcgg tgagaaagca cacctagacg tgaacttcat caacccgtca 1800
gcagacaaca tcctttctgt gaagaatgtt gaaggcttcg gcgaggttga cccgtacgag 1860
taccaagatc tagaagtaca ccgccacgtt gaagttgaat tcaaagcggc aaaagagcac 1920
aacatcctat cgctgcttgt gcctaataag aacagcggtg agcaagttga agtcactcac 1980
aagcttgaag gcaacatgtt aatgctgact gttgacggcg agttagtgac tatcgagctg 2040
taa 2043
<210> 3
<211> 545
<212> PRT
<213> 褐藻胶裂解酶AlyPB1(Photobacterium sp)
<400> 3
Met Lys Lys His Thr Pro Ile Ala Leu Ala Leu Leu Ala Ala Met Ser
1 5 10 15
Phe Asn Val His Ala Ser Thr Gln Asp Thr Pro Val Pro Val Gln Leu
20 25 30
Pro Glu Val Ala Thr Trp Pro Ser Ile Ala Glu Val Ser Leu Gln Ser
35 40 45
Leu Thr Ala Glu Gln Leu Val Glu Ala Ala Ser Arg Glu Val Val Asn
50 55 60
Thr Thr Lys Val Asp Val Ala Ser Asp Thr Ala Val Glu Ala Leu Lys
65 70 75 80
Gln Gln Leu Glu Asn Ala Lys Pro Gly Glu Val Ile Ser Ile Ala Pro
85 90 95
Gly Arg Tyr Ala Asn Leu Gly Val Val Glu Leu Thr Ala Asp Asp Ile
100 105 110
Thr Val Lys Ala Asp Gln Pro Gly Thr Val Leu Leu Thr Gly Leu Val
115 120 125
Gln Leu Val Val Lys Gly Asp Asp Ile Thr Leu Asp Ser Ile Val Phe
130 135 140
Thr Glu Gly Gly Pro Ala Glu Arg Phe Gly Gly Val Arg Leu Glu Gly
145 150 155 160
Met Arg Asn Thr Leu Gln Asn Ser Thr Phe Tyr Tyr Phe Asn Asp Asp
165 170 175
Tyr Glu Tyr Glu Pro Asp Glu Arg Arg Ser Glu Tyr Pro Arg Tyr Leu
180 185 190
Trp Val Ser Leu Trp Gly Lys Asp Gly Lys Val Ile Asn Asn Arg Phe
195 200 205
Glu Gly Lys His Lys Arg Gly Thr Leu Ile Gly Ile Gln Lys Asn Ile
210 215 220
Asp Asp Lys Ala Asp Asn His Leu Ile Glu Gly Asn Ile Phe Tyr Ser
225 230 235 240
Gln Lys Lys Asn Arg Tyr Asn Glu Leu Ala Ile Glu Glu Ala Val Arg
245 250 255
Tyr Asn Gly Asn Ser Trp Glu Ala Ile Arg Ile Gly Asp Ser Lys Ser
260 265 270
Ser Gln Trp Pro Ser Arg Thr Gln Phe Val Asn Asn Leu Leu Val Asp
275 280 285
Ser Asp Gly Glu Arg Glu Leu Ile Ser Val Lys Ser Gly Glu Asn Arg
290 295 300
Ile Ala Gly Asn Thr Ile Phe Glu Ser Ala Ser Met Ile Ser Leu Arg
305 310 315 320
His Gly Lys Ala Asn Leu Val Glu Asn Asn Val Ile Ile Gly Asn Ser
325 330 335
Lys Gln Asp Thr Gly Gly Ile Arg Ile Tyr Asp Glu Asp His Val Val
340 345 350
Arg Asn Asn Tyr Leu Val Gly Leu Arg Gly Ser Gly Gly Gln Ile Ala
355 360 365
Gly Asn Ala Asp Val Arg Gly Gly Val Val Ile Asn Thr Gly Ile Ile
370 375 380
Asp Val Lys Asn Asn Glu Gln Leu Asp Gln Glu Val Lys Gly Lys Glu
385 390 395 400
Leu Asn Lys Gln Trp Thr Pro Lys Asn Val Thr Val Glu Asn Asn Thr
405 410 415
Met Val Asp Val Glu Phe Gly Met Val His Gly Asn Gln Gly His Arg
420 425 430
Val Ser Leu Phe Asp Asn Ser Gln Val Glu Ala Ile Phe Thr Gly Asn
435 440 445
Asn Ile Thr Phe Ser Ser Asn Val Val Phe Asn Leu Asp Glu Thr Leu
450 455 460
Gln Ala Leu Arg Ala Asp Pro Ala Thr Pro Leu Thr Gly Pro Thr Tyr
465 470 475 480
Ser Asp Glu Leu Tyr Phe Gly Gln Val His Gly Ile Asp Gly Val Pro
485 490 495
Ala Gly Val Ser Gln Gln Lys Pro Thr Tyr Thr Lys Val Gly Asp Phe
500 505 510
Tyr Gln Phe Ala Glu Gly Gly Ala Asp Val Ser Lys Leu His Val Leu
515 520 525
Thr Ala Asp Glu Ile Gly Pro Ser Tyr Arg Leu Gln Val Ala Pro Lys
530 535 540
Ser
545
<210> 4
<211> 680
<212> PRT
<213> 褐藻胶裂解酶AlyPB2(Photobacterium sp)
<400> 4
Met Lys Leu Glu Asn Asp Thr Ser Ala Gly Asn Leu Val Asp Leu Leu
1 5 10 15
Pro Ile Glu Val Gln Lys Arg Asp Phe Asp Leu Ser Phe Leu Gly Asn
20 25 30
Leu Ser Glu Glu Arg Pro Arg Leu Leu Val Gln Ala Thr Asp Leu Ala
35 40 45
Glu Phe Lys Ala Asn Val Gln Ala Asp Glu Ser His Cys Met Phe Asp
50 55 60
Asp Phe Phe Asn Asn Ser Thr Val Lys Phe Leu Glu Thr Ala Pro Tyr
65 70 75 80
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85 90 95
Trp Arg Pro Tyr Trp Arg Gln Met Tyr Val Asp Cys Gln Met Ala Leu
100 105 110
Asn Ala Thr Arg Asn Leu Ala Ile Ala Gly Ile Val Lys Glu Asp Glu
115 120 125
Glu Leu Ile Ala Lys Ala Lys Ala Trp Thr Leu Lys Leu Ser Thr Tyr
130 135 140
Asp Pro Asp Gly Val Thr Ser Arg Gly Tyr Asn Asp Glu Ala Ala Phe
145 150 155 160
Arg Val Ile Ala Ala Met Ala Trp Gly Tyr Asp Trp Leu His Ala His
165 170 175
Phe Thr Asp Glu Glu Arg Gln Gln Val Gln Asp Ala Leu Ile Glu Arg
180 185 190
Leu Asp Glu Ile Met His His Leu Lys Val Thr Val Asp Leu Leu Asn
195 200 205
Asn Pro Leu Asn Ser His Gly Val Arg Ser Ile Ser Ser Ala Ile Ile
210 215 220
Pro Thr Cys Ile Ala Leu Tyr His Asp His Pro Lys Ala Gly Glu Tyr
225 230 235 240
Ile Ala Tyr Ala Leu Glu Tyr Tyr Ala Val His Tyr Pro Pro Trp Gly
245 250 255
Gly Glu Asp Gly Gly Trp Ala Glu Gly Pro Asp Tyr Trp Asn Thr Gln
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Thr Ala Phe Leu Gly Glu Ala Phe Asp Leu Leu Lys Ala Tyr Cys Gly
275 280 285
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Leu Tyr Cys Met Pro Val His Ser Lys Arg Ala Ser Phe Cys Asp Gln
305 310 315 320
Ser Ser Ile Gly Asp Phe Pro Gly Leu Lys Leu Ala Tyr Asn Ile Lys
325 330 335
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340 345 350
Gln Leu Lys Gly Arg Asp Thr Glu Ala His Thr Lys Phe Tyr Asn Phe
355 360 365
Gly Trp Trp Asp Phe Gly Tyr Asp Asp Leu Arg Phe Asn Ile Leu Trp
370 375 380
Asp Ala Pro Glu Glu Lys Ala Pro Ser Asn Asp Pro Leu Leu Lys Val
385 390 395 400
Phe Pro Ile Thr Gly Trp Ala Ala Phe His Asn Lys Met Thr Glu Arg
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Asp Asn His Ile His Met Val Phe Lys Cys Ser Pro Phe Gly Ser Ile
420 425 430
Ser His Ser His Gly Asp Gln Asn Ala Phe Thr Leu His Ala Phe Gly
435 440 445
Glu Thr Leu Ala Ala Ile Thr Gly Tyr Tyr Gly Gly Phe Gly Val Asp
450 455 460
Met His Thr Lys Trp Arg Arg Gln Thr Phe Ser Lys Asn Leu Pro Leu
465 470 475 480
Phe Gly Gly Lys Gly Gln Tyr Gly Glu Asn Lys Asn Thr Gly Tyr Glu
485 490 495
Gly His Gln Asp Arg Phe Cys Ile Glu Ala Gly Gly Asn Ile Thr Asp
500 505 510
Tyr Asp Thr Glu Ser Asp Val Lys Met Val Glu Gly Asp Ala Thr Ala
515 520 525
Ser Tyr Lys Tyr Phe Val Pro Glu Ile Glu Ser Tyr Lys Arg Lys Ile
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Trp Phe Val Gln Gly Lys Val Phe Val Met Gln Asp Lys Ala Thr Leu
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Ser Glu Glu Lys Asp Met Thr Trp Leu Met His Thr Thr Phe Ala Asn
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Glu Val Ala Asp Lys Ser Phe Thr Ile Arg Gly Glu Lys Ala His Leu
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Asp Val Asn Phe Ile Asn Pro Ser Ala Asp Asn Ile Leu Ser Val Lys
595 600 605
Asn Val Glu Gly Phe Gly Glu Val Asp Pro Tyr Glu Tyr Gln Asp Leu
610 615 620
Glu Val His Arg His Val Glu Val Glu Phe Lys Ala Ala Lys Glu His
625 630 635 640
Asn Ile Leu Ser Leu Leu Val Pro Asn Lys Asn Ser Gly Glu Gln Val
645 650 655
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660 665 670
Gly Glu Leu Val Thr Ile Glu Leu
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<210> 5
<211> 34
<212> DNA
<213> 正向引物alypb1-F(Artificial Sequence)
<400> 5
catatgtcga cccaagatac accagtaccg gtac 34
<210> 6
<211> 34
<212> DNA
<213> 反向引物alypb1-R(Artificial Sequence)
<400> 6
ctcgaggctc ttcggtgcaa cctgcaaacg gtag 34
<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213> 正向引物alypb2-F(Artificial Sequence)
<400> 7
catatgaagc tggagaatga tacttcagca gg 32
<210> 8
<211> 33
<212> DNA
<213> 反向引物alypb2-R(Artificial Sequence)
<400> 8
ctcgagcagc tcgatagtca ctaactcgcc gtc 33