一种高活性腈水合酶突变体及其应用
阅读说明：本技术 一种高活性腈水合酶突变体及其应用 (High-activity nitrile hydratase mutant and application thereof ) 是由 周哲敏 程中一 崔文璟 浦卫峰 张广林 于 2021-09-17 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种高活性腈水合酶突变体及其应用,属于生物工程技术领域。本发明通过对来源于温泉热碱芽孢杆菌TA2.A1的腈水合酶的进行改造,具体为将其β亚基的第47位氨基酸进行突变,构建得到的突变体N47F的酶活为592.92±1.12U/mg,与未进行改造的野生型腈水合酶的比酶活165.30±1.21U/mg相比,有明显提高,约为野生型的3.6倍,腈水合酶催化活性得到显著改善,有利于应用于工业上酰胺类化学品如烟酰胺、丙烯酰胺的生产,提高催化效率,降低生产成本。(The invention discloses a high-activity nitrile hydratase mutant and application thereof, belonging to the technical field of biological engineering. The invention modifies nitrile hydratase derived from thermokalite bacillus spa TA2.A1, specifically, mutation is carried out on 47 th amino acid of beta subunit, the enzyme activity of the constructed mutant N47F is 592.92 +/-1.12U/mg, compared with the specific enzyme activity 165.30 +/-1.21U/mg of wild nitrile hydratase which is not modified, the enzyme activity is obviously improved and is about 3.6 times of that of the wild nitrile hydratase, the catalytic activity of the nitrile hydratase is obviously improved, and the nitrile hydratase is beneficial to the production of amide chemicals such as nicotinamide and acrylamide in industry, the catalytic efficiency is improved, and the production cost is reduced.)
技术领域
本发明涉及一种高活性腈水合酶突变体及其应用，具体涉及一种腈水合酶的氨基酸基序、含有编码该氨基酸序列的基因的质粒、转化后含有该质粒的菌株及其在改善腈水合酶上的应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
腈水合酶(Nitrile hydratase，简称NHase，EC 4.2.1.84)，可以将腈类底物水合，从而转化为相应的酰胺类产物。玫瑰色红球菌J1(节杆菌属)来源的该酶是人们首次发现并报道的腈水合酶。目前生产腈水合酶的微生物有红球菌属(Rhodococccus)、假单胞菌属(Pseudomonas)和短杆菌属(Brevibacterium)等，且其异源表达已在大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、毕赤酵母(Pichiapastoris)等模式菌株中实现。随着对腈水合酶研究的深入，条件温和、选择性强的生物催化法正逐步替代化学合成法，成功应用于工业生产丙烯酰胺、烟酰胺和5-氰基戊酰胺等酰胺类产品。
酰胺类产品具有较高的工业价值，其中，烟酰胺是一种重要的化工生产原料，用途广泛。烟酰胺本身为维生素B12的辅酶，可以作为维生素补剂，还可用来合成多种维生素衍生物，市场前景广阔。然而，目前腈水合酶的工业应用仍然存在一定的问题。由于腈的水合是放热反应，这就要求腈水合酶具有较好的热稳定性才能在高温下维持高反应速率。与此相悖的是，大多数的腈水合酶在温度超过50℃时会迅速失活，因此，获取兼具较高酶活和良好热稳定性的腈水合酶具有重要意义。
温泉热碱芽孢杆菌(Caldalkalibacillusthermarum TA2.A1)来源的腈水合酶具有较好的热稳定性，该酶在65℃的半衰期为3h，具有优异的热稳定性，但野生型的催化酶活较低。因此，提高该腈水合酶的催化活性具有极大的应用价值和广阔的应用前景。
发明内容
针对现有的技术难点及存在的问题，本发明提供了一种来源于温泉热碱芽孢杆菌(Caldalkalibacillusthermarum TA2.A1)的腈水合酶的突变体氨基酸基序及其在底物催化生产上的应用。
本发明体提供了一种高活性腈水合酶突变体，所述腈水合酶由α亚基、β亚基以及调控蛋白组成；所述突变体是将β亚基第47位的氨基酸取代成苯丙氨酸；所述α亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述调控蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明提供了编码所述腈水合酶突变体的基因。
本发明提供了含有所述基因的表达载体。
在一种实施方式中，所述表达载体包括但不限于pET系列、Duet系列、pGEX系列、pHY300、pHY300PLK、pPIC3K或pPIC9K系列载体。
优选的，以pET-24a(+)为表达质粒载体
本发明提供了携带权利要求2所述基因或权利要求3或4所述重组载体的微生物细胞。
在一种实施方式中，所述微生物细胞以大肠杆菌为宿主。
在一种实施方式中，所述微生物细胞是以大肠杆菌BL21为宿主。
本发明提供了一种提高腈水合酶酶活力的方法，所述方法是将氨基酸序列如SEQID NO.2所示的腈水合酶β亚基第47位天冬酰胺突变为苯丙氨酸；所述腈水合酶还包含α亚基和调控蛋白；所述α亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述调控蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明提供了一种生产腈水合酶突变体的方法，其特征在于，将所述微生物细胞接种于YT培养基中，在35～37℃、180～200rpm下培养至OD600为0.6～0.8时，加入终浓度为0.1～0.4mM的IPTG和终浓度为0.0.5～0.2g/L的CoCl2·6H2O，在22～24℃诱导12～16h，即得到含有腈水合酶突变体的发酵液。
本发明提供了所述腈水合酶突变体、所述基因、所述微生物细胞在生产酰胺类物质中的应用。
在一种实施方式中，所述酰胺类物质包括但不限于烟酰胺及其衍生物或是丙烯酰胺及其衍生物。
有益效果：
本发明通过对来源于温泉热碱芽孢杆菌TA2.A1的腈水合酶的进行改造，具体为将其β亚基的第47位氨基酸进行突变，构建得到的突变体N47F的酶活为592.92±1.12U/mg，与未进行改造的野生型腈水合酶的比酶活165.30±1.21U/mg相比，有明显提高，约为野生型的3.6倍，显著改善腈水合酶催化活性，有利于应用于工业上精细化学品如烟酰胺的生产，提高催化效率，降低生产成本。
附图说明
图1为纯酶的SDS-PAGE电泳图，M：蛋白Marker，1：WT，2：N47F。
图2为Cal.t NHase野生酶WT与突变体N47F的比酶活。
具体实施方式
1、培养基：
LB培养基(L-1)：胰蛋白胨10g，NaCl 10g，酵母提取物5g，pH 7.0，配制固体培养基时添加琼脂粉20g。
无甘油TB培养基(L-1)：胰蛋白胨12g，酵母提取物24g，KH2PO4 2.31g，K2HPO412.54g。
2、缓冲液：
结合缓冲液：20mM Na2HPO4·12H2O，280mM NaCl，6mM KCl，pH 7.4
洗脱缓冲液：20mM Na2HPO4·12H2O，280mM NaCl，6mM KCl，2.5mM d-Desthiobiotin，pH 7.4。
腈水合酶的酶活力(U)：单位酶活力定义为25℃下，每分钟催化烟腈生成1μmol烟酰胺所需要的酶量。
腈水合酶的比酶活(U/mg)：每毫克腈水合酶所具有的酶活力。
实施例1：腈水合酶突变体的质粒构建
根据本实验室已有Cal.t NHase的野生型质粒pET24a(+)-Cal.t WT(具体构建步骤公开于文献张赛兰,李婷,程中一等.新型耐热腈水合酶的异源表达及其催化工艺研究[J].食品与发酵工业,2020,第46卷(14):108-113)，采用全质粒PCR的方法构建了突变体质粒pET24a(+)-N47F。首先以质粒pET24a(+)-Cal.t WT为模板，突变序列设计在引物上，通过PCR扩增出碱基序列发生突变的质粒，所用引物序列如表1所示，扩增体系如表2所示，
PCR扩增反应条件为95℃预变性3min，98℃变性15s，55℃退火30s，72℃延伸1min45s，72℃延伸5min，共30个循环。将PCR产物用DpnI消化酶消化2-3h，转化E.coli DH5α，涂布于含50mg/L卡那霉素的LB培养基平板，37℃倒置过夜培养。
挑取单菌落接种于5mL LB培养基，37℃、200rpm振荡培养过夜，使用商品化质粒抽提试剂盒获得重组质粒，由苏州金唯智生物科技有限公司进行测序验证，最终得到重构质粒pET24a(+)-N47F。
表1引物序列
(注：F代指上游引物，R代指下游引物)
表2 PCR扩增体系
实施例2：野生酶WT与各突变体的表达与纯化
步骤1：将实施例1获得的Cal.t NHase的野生型pET24a(+)-Cal.t WT及重构质粒pET24a(+)-N47F分别转化E.coli BL21(DE3)，挑取单菌落至5mL LB培养基，37℃、200rpm条件下培养7-8h。将种子液按1％(v/v)接种量转接至100mL 2×YT培养基，37℃、200rpm条件下培养至OD600至0.6-0.8，加入终浓度为0.4mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)以及0.1g/L的CoCl2·6H2O，改变培养温度为24℃，诱导表达12-16h。
步骤2：采用亲和层析的方法纯化野生型WT及N47F突变体，纯化柱为GE公司的StrepTrap HP 1mL柱。在10000rpm条件下离心3min收集菌体细胞，用20mL结合缓冲液重悬，于冰水混合物中超声破碎。破碎液在4℃、12000rpm条件下离心30min，取上清液过0.22μm有机滤膜。纯化柱在用结合缓冲液平衡后，进行上样，然后用结合缓冲液洗去杂蛋白，目的蛋白用100％的洗脱缓冲液洗脱并收集。蛋白浓度使用Bradford蛋白浓度检测试剂盒进行定量。采用SDS-PAGE检测目的蛋白的纯化质量，检测如图1所示，可见野生型及其突变体所表达的蛋白在纯化后蛋白条带单一，纯化质量高。
实施例3：Cal.t NHase的野生型及突变体催化效率检测
用10mM KPB(pH 7.4)溶液将WT及其突变体纯酶的浓度稀释至0.5mg/mL，取10μL至1.5mL离心管中，置于25℃金属浴上。向离心管中加入490μL底物(200mM烟腈溶液)，充分涡旋混匀，25℃下反应10min，然后加入500μL纯乙腈溶液进行终止。将反应液用纯乙腈溶液稀释适当倍数，过0.22μm滤膜。
液相检测方法：流动相组成为乙腈：水＝1：2(v/v)，流速为0.6mL/min，检测波长为215nm，柱温为40℃，测定反应体系中产物烟酰胺的生成量。WT及突变体的比酶活计算结果如图2所示，野生酶WT的比酶活为165.30±1.21U/mg，突变体N47F的比酶活为592.92±1.12U/mg。
突变体酶活较野生型提高了约259％，即当对该位点氨基酸残基发生突变时，腈水合酶的比酶活有较大程度地提高，说明上述这个氨基酸残基可能在两个亚基的关键结构域，对于腈水合酶的催化活性具有重要作用。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 无锡新晨宇生物工程有限公司
<120> 一种高活性腈水合酶突变体及其应用
<130> BAA211265A
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 210
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Lys Asp Asn Asn Lys Val His His His His Pro His Pro Glu Ser
1 5 10 15
Phe Trp Ser Ala Arg Ala Lys Ala Leu Glu Ser Leu Leu Ile Glu Lys
20 25 30
Gly Ile Leu Ser Ser Asp Ala Ile Asp Arg Val Val Gln His Tyr Glu
35 40 45
His Glu Leu Gly Pro Met Asn Gly Ala Lys Val Val Ala Lys Ala Trp
50 55 60
Thr Asp Pro Ala Phe Lys Gln Arg Leu Leu Glu Asp Pro Glu Thr Val
65 70 75 80
Leu Arg Glu Leu Gly Tyr Tyr Gly Leu Gln Gly Glu His Ile Arg Val
85 90 95
Val Glu Asn Thr Asp Thr Val His Asn Val Val Val Cys Thr Leu Cys
100 105 110
Ser Cys Tyr Pro Trp Pro Leu Leu Gly Leu Pro Pro Ala Trp Tyr Lys
115 120 125
Glu Pro Thr Tyr Arg Ser Arg Ile Val Lys Glu Pro Arg Lys Val Leu
130 135 140
Arg Glu Glu Phe Gly Leu Asp Leu Pro Asp Thr Val Glu Ile Arg Val
145 150 155 160
Trp Asp Ser Ser Ser Glu Met Arg Tyr Met Val Leu Pro Gln Arg Pro
165 170 175
Glu Gly Thr Glu Gly Met Thr Glu Glu Glu Leu Ala Lys Ile Val Thr
180 185 190
Arg Asp Ser Met Ile Gly Val Ala Lys Val Gln Pro Ser Ser Val Thr
195 200 205
Val Arg
210
<210> 2
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Asn Gly Ile His Asp Leu Gly Gly Met Asp Gly Phe Gly Lys Ile
1 5 10 15
Ile Arg Glu Glu Asn Glu Pro Leu Phe His Lys Asp Trp Glu Arg Ile
20 25 30
Ala Phe Gly Leu Leu Ile Gly Thr Ala Gly Gln Gly Leu Tyr Asn Leu
35 40 45
Asp Glu Phe Arg His Ala Ile Glu Arg Met Asn Pro Val Asp Tyr Leu
50 55 60
Thr Ser Gly Tyr Tyr Gly His Trp Val Ala Ser Ile Ala Thr Leu Leu
65 70 75 80
Val Glu Lys Gly Ile Leu Asp Ala Ser Glu Leu Val Ser Arg Thr Gln
85 90 95
Thr Tyr Leu Ala Gln Pro Asp Thr Lys Thr Pro Arg Arg Glu Asn Pro
100 105 110
Glu Leu Val Asn His Leu Glu Gln Val Ile Lys Val Gly Val Ser Thr
115 120 125
Val Arg Glu Val Ser Ser Ala Pro Arg Phe Asn Val Gly Asp Arg Val
130 135 140
Lys Thr Lys Asn Ile His Pro Ser Gly His Thr Arg Leu Pro Arg Tyr
145 150 155 160
Ala Arg Asp Lys Tyr Gly Val Ile Ala Met Tyr His Gly Ala His Val
165 170 175
Phe Pro Asp Ala Asn Ala His Gly Lys Gly Glu Ser Pro Gln His Leu
180 185 190
Tyr Cys Ile Arg Phe Glu Ala Asn Glu Leu Trp Gly Ile Gln Gln Gly
195 200 205
Glu Ala Val Tyr Ile Asp Leu Trp Glu Ser Tyr Leu Glu Pro Val Ser
210 215 220
His
225
<210> 3
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Met Glu Lys Asn Cys Val Ser Gln Ser Val Asp Ser Lys Ile Ala Tyr
1 5 10 15
Leu Pro Glu Ser Ala Ala Pro Pro Arg Lys Asn Gly Glu Leu Val Phe
20 25 30
Glu Glu Pro Trp Glu Arg Arg Ser Phe Gly Met Ala Leu Ala Leu Tyr
35 40 45
Glu Glu Lys Arg Tyr Thr Ser Trp Asp Asp Phe Arg Thr Arg Leu Ile
50 55 60
Gln Glu Ile Ala Lys Trp Glu Ser Ser Glu Asn Gln Asp Lys Leu Asp
65 70 75 80
Trp Asn Tyr Tyr Glu His Trp Leu Ala Ala Leu Glu Gln Leu Val Val
85 90 95
Glu Thr Gly Met Ile Asp Lys His Asp Ile Asp Ala Arg Thr Lys Glu
100 105 110
Phe Leu Ser Gly Glu Arg Asp Glu Phe Phe
115 120
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