阅读说明：本技术 利用CRISPR/Cas9敲除文库技术筛选JEV抗性基因的方法与靶点 (Method and target for screening JEV resistance gene by using CRISPR/Cas9 knockout library technology ) 是由 赵书红 谢胜松 李新云 赵长志 刘海龙 肖天贺 王子畅 聂雄伟 韩晓松 阮进学 于 2019-10-29 设计创作，主要内容包括：本发明提供了利用CRISPR/Cas9敲除文库技术筛选JEV抗性基因的方法与靶点。具体地,本发明提供了一种基于全基因组CRISPR/Cas9敲除文库策略,筛选JEV抗性相关基因的方法及候选靶基因。本发明方法先利用一个包含有针对猪全基因组的sgRNA质粒库包装慢病毒,感染Cas9稳定表达的猪体细胞,通过流式细胞术富集获得全基因组基因敲除细胞库。再利用JEV感染敲除细胞库,收集存活细胞,提取基因组DNA并进行PCR扩增,建库和高通量测序,最后利用生物信息学分析获得数十个JEV抗性候选功能基因。本发明建立了基于全基因CRISPR/Cas9敲除文库策略筛选猪的JEV抗病基因的方法,所鉴定的候选基因靶点可用于抑制JEV复制的靶向药物开发与抗病育种研究。(The invention provides a method and a target for screening JEV resistance genes by using CRISPR/Cas9 knockout library technology. Specifically, the invention provides a method for screening JEV resistance-related genes based on a whole genome CRISPR/Cas9 knockout library strategy and a candidate target gene. According to the method, a sgRNA plasmid library containing a pig complete genome is used for packaging lentivirus, a pig somatic cell stably expressed by Cas9 is infected, and a complete genome gene knockout cell library is obtained through enrichment by flow cytometry. And infecting a knockout cell library by using JEV, collecting the survival cells, extracting genome DNA, carrying out PCR amplification, establishing a library and high-throughput sequencing, and finally analyzing by using bioinformatics to obtain tens of JEV resistance candidate functional genes. The invention establishes a method for screening the JEV disease-resistant gene of a pig based on a whole-gene CRISPR/Cas9 knockout library strategy, and the identified candidate gene target can be used for targeted drug development and disease-resistant breeding research for inhibiting JEV replication.)

利用CRISPR/Cas9敲除文库技术筛选JEV抗性基因的方法与 靶点

技术领域

本发明涉及动物抗病育种领域，具体地涉及利用CRISPR/Cas9敲除文库技术筛选JEV抗性基因的方法与靶点。

背景技术

动物疾病不仅危害畜牧产业，同样危害着人类健康。如SARS、禽流感和乙型脑炎等人畜共患病，对动物和人类都是一种极大的威胁。如何控制病原微生物感染与传播是近年来一直被关注的热点问题。

对于已经有预防性疫苗的传染病，给易感猪群接种疫苗是最为保险的方法。但有些病毒变异快，疫苗防控困难。从遗传上提高畜禽本身的抗病能力从而改善畜禽的健康和畜产品的安全，是当前动物遗传育种学者亟须解决的重大问题，也是国家重视的畜禽种业技术难题。

目前利用基因编辑抗病育种手段改造宿主基因，从而提高宿主的抗病能力，实现阻止病毒感染已有成功的案例报道。如基因编辑抗蓝耳病猪和抗结核病转基因牛。但这种方法的关键之处在于发现病原微生物感染必需的关键宿主基因。因此，如何在动物细胞中实现高通量筛选与病原微生物互作的宿主关键基因是亟需解决的核心技术问题。

流行性乙型脑炎(简称乙脑病)是由日本脑炎病毒(Japanese encephalitisvirus,JEV)感染引起的一种人畜共患病，属于国家二类动物疫病。猪场中暴发猪乙型脑炎后，公猪睾丸肿大，***可带毒通过配种传染；怀孕母猪流产、死胎、木乃伊胎；初生仔猪脑炎、共济失调、发热、死亡。目前该种疾病还没有特效治疗药物，发病后要及时采取措施，需将患病猪扑杀进行无害化处理。

尽管乙脑疫苗是预防流行性乙型脑炎的有效措施，但由于JEV感染机制尚不清楚，目前尚无有效的治疗药物，尤其缺乏有效分子靶点。

因此，本领域迫切需要开发新的能实现高通量筛选JEV抗性基因的方法及用于提高动物尤其是猪的流行性乙型脑炎抗病性的靶点。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种全基因组无偏的高通量地筛选猪的JEV抗性基因的新颖方法。

本发明的另一目的就是提供可用于提高动物尤其是猪的流行性乙型脑炎抗病性的靶点及其应用。本发明的这些通过CRISPR文库筛选并鉴定的参与介导JEV复制的关键宿主基因，可作为乙型脑炎药物治疗或构建抵抗JEV复制细胞或动物模型的分子靶标。

在本发明的第一方面，提供了一种确定潜在的JEV抗性相关基因的方法，包括步骤：

(a)提供稳定表达Cas9并经重组病毒感染并存活的猪体细胞(较佳地为肾细胞，更佳地为PK-15-Cas9)作为第一细胞库，以及不表达Cas9的猪体细胞作为对照细胞，其中所述第一细胞库的细胞和对照细胞属于同一类型的体细胞；

其中，所述的重组病毒是可感染所述猪体细胞的病毒，并且分别用于表达靶向猪基因的不同的敲除sgRNA所构成的sgRNA集(sgRNA)，其中sgRNA集包括N种靶向不同的猪基因的重组病毒，其中N为≥1000(较佳地N≥5000，更佳地≥20,000或10,000-100,000个)的正整数；

(b)在对照组中，用日本脑炎病毒(JEV)感染所述的对照细胞；和在测试组中，用日本脑炎病毒(JEV)感染所述的第一细胞库的猪体细胞(即测试细胞)，其中对照组和测试组的实验条件是相同或本质上相同的；

(c)观察所述对照组中对照细胞的存活情况，并在对照组的细胞死亡率D1达到预定值(如D1≥90％，较佳地≥95％，更佳地≥99％，最佳地为100％)时，收集在测试组中存活的猪体细胞；

(d)将所述的存活细胞用作下一轮测试过程中测试组的测试细胞，重复步骤(b)和(c)，进行下一轮的测试，从而获得第R轮的存活细胞，其中，R为2-10的正整数(较佳地R为3-6，如3、4或5)；

(e)对于第j轮的存活细胞，其中2≤j≤R，确定在所述存活细胞中富集的敲除sgRNA的种类；

(f)基于所述确定的经富集的敲除sgRNA的种类，从而相对应的靶基因，即为潜在的JEV抗性相关基因。

在另一优选例中，所述方法还包括：

(g)对上一步骤中确定的潜在的JEV抗性相关基因，进行功能验证。

在另一优选例中，所述的潜在的JEV抗性相关基因是富集度排名前m％的敲除sgRNA所对应的靶基因，其中，m≤5(较佳地，m为2，1，0.5，0.1)。

在另一优选例中，潜在的JEV抗性相关基因选自组A的基因(表1中列出的基因)：ACP7、ARID5B、B3GAT3、B4GALT7、BHLHE41、BTAF1、CALR、CAVIN3、CCNB1IP1、CDK5R2、DAPK1、DMGDH、DOK1、DR1、EMC3、EMC6、EPB41L3、ERBB4、EXT1、EXT2、EXTL3、FAM205A、GAA、GLCE、GNA11、GOSR1、GPT2、GSTO2、HS6ST1、KCNQ3、LRRC23、MICALL2、ORAOV1、PKP3、PRKCSH、RNF145、SEC63、SERP1、SLC25A36、SLC26A7、SLC35B2、SMOX、TAF5L、TRBV24-1、TRHR、UBE2J1、UGDH、XYLT2、ZIC3、ZNF33B、ZNF596。

在另一优选例中，潜在的JEV抗性相关基因选自下组B：SEC63、PRKCSH、SLC35B2、RNF145、SMOX、CALR、DMGDH、EXT2、B3GAT3和GSTO2。(第3轮)

在另一优选例中，潜在的JEV抗性相关基因选自下组C：SLC35B2、SMOX、RNF145、DMGDH、SEC63、EXT2、CALR、B3GAT3、EXT1和PRKCSH。(第4轮)

在另一优选例中，潜在的JEV抗性相关基因选自下组D：SEC63、PRKCSH、SLC35B2、RNF145、SMOX、CALR、DMGDH、EXT2、B3GAT3。(第3和4轮中重复的)

在另一优选例中，潜在的JEV抗性相关基因来自选自下组的通路：内质网蛋白质加工通路、糖胺聚糖(GAG)与合成硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)通路、糖胺聚糖(GAG)与合成硫酸软骨素通路、代谢信号通路、或其组合。

在另一优选例中，潜在的JEV抗性相关基因包括HSPG通路相关基因。

在另一优选例中，潜在的JEV抗性相关基因选自下组：SLC35B2、HS6ST1、B3GAT3、GLCE、或其组合。

在另一优选例中，所述的重组病毒选自下组：慢病毒、腺病毒、AAV病毒、或其组合。

在另一优选例中，所述的重组病毒通过包括以下步骤的方法制备：

(v1)制备猪的全基因组CRISPR/Cas9敲除sgRNA病毒文库质粒；

(v2)用所述sgRNA病毒文库质粒，包装所述感染性病毒，从而形成所述重组病毒；和

(v3)任选地，对所述重组病毒进行效价(或滴度)测定。

在另一优选例中，所述的感染性病毒选自下组：慢病毒、腺病毒、AAV病毒、或其组合；更佳地为慢病毒。

在另一优选例中，所述的体细胞包括：肾细胞、ST睾丸细胞、神经细胞。

在另一优选例中，所述的第一细胞库是稳定表达Cas9并经重组病毒感染并存活的猪体细胞所构成的细胞群，并且在所述的第一细胞库的细胞中存在基于敲除sgRNA的基因编辑而导致的基因敲除。

在另一优选例中，所述的第一细胞库通过包括以下步骤的方法制备：

(w1)提供稳定表达Cas9的猪体细胞和所述的重组病毒；

(w2)用所述的重组病毒感染所述的稳定表达Cas9的猪体细胞(如PK-15-Cas9)，从而获得经病毒转染的猪体细胞；

(w3)分选经重组病毒转染并存活的猪体细胞,从而获得第一细胞库(即突变体细胞库)。

在另一优选例中，在步骤(w3)中，通过流式分选和富集GFP阳性细胞，从而制备突变体细胞库。

在另一优选例中，确定在所述存活细胞中富集的敲除sgRNA的种类是通过测序和生物信息分析而获得的。

在另一优选例中，在所述方法中，进行了4轮JEV攻毒，并对突变体细胞库(第一细胞库)的细胞、第3轮和第4轮JEV感染的存活细胞，进行PCR扩增和构建高通量测序文库，随后通过生物信息学分析鉴定富集的sgRNA。

在另一优选例中，所述方法为体外方法。

在另一优选例中，所述方法是非诊断和非治疗的方法。

在本发明的第二方面，提供了一种JEV抗性促进剂的用途(制药用途)，它被用来制备抗流行性乙型脑炎的化合物或药物组合物，或用于制备抗流行性乙型脑炎模型动物的制剂，

其中，所述的JEV抗性促进剂为JEV抗性相关基因或其编码蛋白(即JEV抗性相关蛋白)的抑制剂，

所述的JEV抗性相关基因是用本发明第一方面所述的方法确定的或者所述JEV抗性相关基因选自组A的基因。

在另一优选例中，所述抑制剂选自下组：靶向JEV抗性相关蛋白的抗体或小分子抑制剂、靶向JEV抗性相关基因的核酸分子或基因编辑器、或其组合。

在另一优选例中，所述基因编辑器包括DNA基因编辑器和RNA基因编辑器。

在另一优选例中，所述基因编辑器包括gRNA和基因编辑蛋白。

在另一优选例中，所述gRNA是引导基因编辑蛋白特异性结合JEV抗性相关基因的RNA。

在另一优选例中，所述gRNA引导基因编辑蛋白特异性结合于JEV抗性相关基因的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述基因编辑蛋白选自下组：Cpf1、Cas9、Cas13a、Cas13b、Cas13c、或其组合。

在另一优选例中，在另一优选例中，JEV抗性相关基因选自组B或组C的基因。

在另一优选例中，JEV抗性相关基因来自选自下组的通路：内质网蛋白质加工通路、糖胺聚糖(GAG)与合成硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)通路、糖胺聚糖(GAG)与合成硫酸软骨素通路、代谢信号通路、或其组合。

在另一优选例中，JEV抗性相关基因包括HSPG通路相关基因。

在另一优选例中，JEV抗性相关基因选自下组：SLC35B2、HS6ST1、B3GAT3、GLCE、或其组合。

在本发明的第三方面，提供了一种组合物，包括：

(a)基因编辑蛋白或其表达载体，所述基因编辑蛋白选自下组：Cpf1、Cas9、Cas13a、Cas13b、Cas13c、或其组合；和

(b)gRNA或其表达载体，其中所述gRNA是引导所述基因编辑蛋白特异性结合JEV抗性相关基因的RNA，

其中，所述的JEV抗性相关基因是用本发明第一方面所述的方法确定的；或者所述JEV抗性相关基因选自组A的基因。

在另一优选例中，所述gRNA引导基因编辑蛋白特异性结合于所述JEV抗性相关基因的核苷酸序列。

在另一优选例中，JEV抗性相关基因选自组B或组C的基因。

在另一优选例中，JEV抗性相关基因来自选自下组的通路：内质网蛋白质加工通路、糖胺聚糖(GAG)与合成硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)通路、糖胺聚糖(GAG)与合成硫酸软骨素通路、代谢信号通路、或其组合。

在另一优选例中，JEV抗性相关基因包括HSPG通路相关基因。

在另一优选例中，JEV抗性相关基因选自下组：SLC35B2、HS6ST1、B3GAT3、GLCE、或其组合。

在另一优选例中，所述组合物包括药物组合物。

在另一优选例中，所述组合物还包括：

(c)其他预防和/或治疗流行性乙型脑炎的药物活性成分。

在另一优选例中，所述组分(a)和/或(b)中的所述表达载体包括病毒载体。

在另一优选例中，所述的病毒载体选自下组：腺相关病毒(AAV)、腺病毒、慢病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、SV40、痘病毒、或其组合。

在另一优选例中，所述的病毒载体选自下组：慢病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、或其组合，较佳地，所述载体为腺相关病毒(AAV)。

在另一优选例中，所述组合物的剂型选自下组：冻干制剂、液体制剂、或其组合。

在另一优选例中，所述组合物的剂型为液体制剂。

在另一优选例中，所述组合物的剂型为注射剂型。

在另一优选例中，所述基因编辑蛋白的表达载体和gRNA的表达载体为同一载体或不同载体。

在另一优选例中，所述组分(a)与组分(b)的重量比为100:1-0.01:1，较佳地，10:1-0.1:1，更佳地，2:1-0.5:1。

在另一优选例中，所述组合物中，所述组分(a)的含量为0.0001-99wt％，较佳地，0.1-90wt％，更佳地，1-70wt％。

在另一优选例中，所述组合物中，所述组分(b)的含量为0.0001-99wt％，较佳地，0.01-90wt％，更佳地，0.1-70wt％。

在另一优选例中，所述组合物中，所述组分(c)的含量为0.1-99wt％，较佳地，10-90wt％，更佳地，30-70wt％。

在另一优选例中，所述组合物中，所述组分(a)和组分(b)和任选的组分(c)占所述组合物总重的0.01-99.99wt％，较佳地0.1-90wt％，更佳地1-80wt％。

在本发明的第四方面，提供了一种药盒，包括：

(a1)第一容器，以及位于所述第一容器中的基因编辑蛋白或其表达载体，所述基因编辑蛋白选自下组：Cpf1、Cas9、Cas13a、Cas13b、Cas13c、或其组合；

(b1)第二容器，以及位于所述第二容器中的gRNA或其表达载体，所述gRNA是引导基因编辑蛋白特异性结合于JEV抗性相关基因的核苷酸序列，

其中，所述的JEV抗性相关基因是用本发明第一方面所述的方法确定的；或者所述JEV抗性相关基因选自组A的基因。

在另一优选例中，所述药盒还包括：

(c1)第三容器，以及位于所述第三容器中的其他预防和/或治疗流行性乙型脑炎的药物活性成分。

在另一优选例中，所述的第一容器、第二容器、和第三容器是相同或不同的容器。

在另一优选例中，在所述的第三容器中，所述的药物活性成分以药物制剂形式(包括单方制剂或复方制剂)存在。

在另一优选例中，所述药物的剂型选自下组：冻干制剂、液体制剂、或其组合。

在另一优选例中，所述药物的剂型为口服剂型或注射剂型。

在另一优选例中，所述的试剂盒还含有说明书。

在本发明的第五方面，提供了一种本发明第三方面所述的组合物或第四方面所述的药盒的用途(制药用途)，它们用于制备(i)用于预防和/或治疗流行性乙型脑炎的药物、或(ii)抑制JEV病毒感染的药物。

在另一优选例中，所述的药物被施用于人或非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述的非人哺乳动物包括猪、啮齿动物。

在另一优选例中，所述预防和/或治疗流行性乙型脑炎,包括提高人或非人哺乳动物对JEV病毒感染性疾病的抗病性，改善所述JEV病毒感染性疾病的症状。

在另一优选例中，所述的JEV病毒感染性疾病包括人流行性乙型脑炎、和/或猪流行性乙型脑炎，尤其是猪流行性乙型脑炎。

在另一优选例中，所述抑制JEV病毒感染包括阻断或减少日本脑炎病毒(Japaneseencephalitis virus,JEV)在宿主细胞中复制。

在另一优选例中，所述宿主细胞的来源选自猪、小鼠、大鼠和/或猴。

在另一优选例中，所述宿主细胞的来源选自猪。

在另一优选例中，所述细胞包括体细胞。

在另一优选例中，所述宿主细胞选自猪源肾细胞(例如PK-15)。

在另一优选例中，所述的JEV病毒包括野生型和突变型。

在本发明的第六方面，提供了一种分离的对JEV病毒感染有抗性的基因工程化细胞，所述细胞为体细胞，并且所述细胞中内源性的JEV抗性相关基因被敲除或敲减，从而使得内源性JEV抗性相关蛋白的表达或活性下降，

其中，所述的JEV抗性相关基因是用本发明第一方面所述的方法确定的；或者所述JEV抗性相关基因选自组A的基因。

在另一优选例中，所述基因工程化细胞中JEV抗性相关蛋白完全不表达或基本上不表达。

在另一优选例中，所述细胞包括人或猪的细胞。

在另一优选例中，所述细胞选自猪源肾细胞(例如PK-15)。

在另一优选例中，在所述基因工程化细胞的基因组中，JEV抗性相关基因的核酸序列存在移码突变或提前中止。

在另一优选例中，所述细胞的JEV抗性相关基因的ORF核酸序列***或缺失3n-1、或3n-2个碱基，n为正整数。

在另一优选例中，所述细胞的JEV抗性相关基因R的ORF核酸序列存在1、2、4或5个碱基***和/或缺失。

在另一优选例中，所述细胞用选自下组的方法进行基因敲除：巨型核酸酶(Meganuclease)方法、锌指核酸酶(ZFN)法、转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)方法、和成簇规律间隔短回文重复(CRISPR/Cas9)基因编辑方法。

在另一优选例中，所述方法为利用CRISPR/Cas9直接对JEV抗性相关基因进行移码突变。

在另一优选例中，JEV抗性相关基因选自组B或组C的基因。

在另一优选例中，JEV抗性相关基因来自选自下组的通路：内质网蛋白质加工通路、糖胺聚糖(GAG)与合成硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)通路、糖胺聚糖(GAG)与合成硫酸软骨素通路、代谢信号通路、或其组合。

在另一优选例中，JEV抗性相关基因包括HSPG通路相关基因。

在另一优选例中，JEV抗性相关基因选自下组：SLC35B2、HS6ST1、B3GAT3、GLCE、或其组合。

在本发明的第七方面，提供了一种抗流行性乙型脑炎的培养体系，所述培养体系包括：

(a)JEV病毒；以及

(b)本发明第六方面所述的分离的对JEV病毒感染有抗性的基因工程化细胞。

在另一优选例中，所述培养体系中还包含培养基。

在本发明的第八方面，提供了一种抗流行性乙型脑炎的非人哺乳动物的制备方法，包括以下步骤：

(m1)提供一种非人哺乳动物的细胞，将所述细胞中的JEV抗性相关蛋白失活，得到CALR蛋白失活的非人哺乳动物细胞；和

(m2)利用步骤(m1)中得到的CALR蛋白失活的细胞，制备得到JEV抗性相关蛋白失活的抗流行性乙型脑炎的非人哺乳动物。

在另一优选例中，步骤(m1)中的细胞为体细胞，较佳地，成纤维细胞。

在另一优选例中，步骤(m1)还包括：筛选JEV抗性相关基因位点存在纯合失活的单克隆细胞株。

在另一优选例中，所述筛选纯合子的单克隆细胞株的方法包括手工挑选，优选地通过流式分选技术。

在另一优选例中，所述方法还包括：(m3)对步骤(m2)获得的非人哺乳动物进行杂交，从而获得CALR失活的纯合子代。

在另一优选例中，所述的非人哺乳动物为猪。

在本发明的第九方面，提供了一种抗流行性乙型脑炎的工程化的非人哺乳动物，所述非人哺乳动物的体细胞中，内源性的JEV抗性相关基因被敲除或敲减，从而使得内源性JEV抗性相关蛋白的表达或活性下降。

在另一优选例中，所述的非人哺乳动物是用本发明的第八方面所述的方法制备的。

在另一优选例中，所述非人哺乳动物选自下组：猪、啮齿动物(如小鼠、大鼠)。

在另一优选例中，所述非人哺乳动物为猪。

在本发明的第十方面，提供了一种筛选预防和/或治疗流行性乙型脑炎的候选化合物的方法，所述方法包括步骤：

(a3)测试组中，在细胞的培养体系中添加测试化合物，并观察所述测试组的细胞中JEV抗性相关蛋白的表达量(E1)和/或活性(A1)；在对照组中，在相同细胞的培养体系中不添加测试化合物，并观察对照组的所述细胞中JEV抗性相关蛋白的表达量(E0)和/或活性(A0)；

其中，如果测试组中细胞的JEV抗性相关蛋白的表达量(E1)和/或活性(A1)显著低于对照组，就表明该测试化合物是对JEV抗性相关蛋白的表达和/或活性有抑制作用的预防和/或治疗流行性乙型脑炎的候选化合物。

在另一优选例中，所述的JEV抗性相关蛋白的表达量是通过qPCR法测定。

在另一优选例中，所述的JEV抗性相关蛋白包括选自组A、组B、或组C的JEV抗性相关基因所编码的蛋白。

在另一优选例中，JEV抗性相关蛋白选自下组：SLC35B2蛋白、HS6ST1蛋白、B3GAT3蛋白、GLCE蛋白、或其组合。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤：

(b3)对于步骤(a3)中获得的候选化合物，在宿主细胞中，进一步测试其对日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)复制是否有抑制作用。

在另一优选例中，所述的方法包括步骤(c3)：将步骤(a3)中所确定的候选化合物施用于非人哺乳动物模型，测定所述候选化合物对日本脑炎病毒感染哺乳动物的是否有抑制作用。

在另一优选例中，所述非人哺乳动物患有流行性乙型脑炎，或所述非人哺乳动物接种过或待接种日本脑炎病毒。

在另一优选例中，所述“显著低于”指E1/E0≤1/2,较佳地，≤1/3，更佳地≤1/4。

在另一优选例中，所述“显著低于”指A1/A0≤1/2,较佳地，≤1/3，更佳地≤1/4。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了基于猪全基因组CRISPR/Cas9敲除文库策略筛选JEV抗性基因流程图。大致流程为：包装猪的全基因组sgRNA慢病毒，其中sgRNA数量为85,674条。感染Cas9稳定表达的PK-15细胞(PK-15-Cas9)；感染2天后，通过流式细胞仪筛选GFP阳性细胞，继续培养7天获得突变体细胞库后，其中取部分细胞提取基因组DNA，取一定量细胞感染乙脑病毒JEV，取存活细胞并进行连续4轮JEV攻毒实验，分别提取细胞基因组DNA，进行PCR扩增和制备DNA测序文库，对高通量测序数据进行生物信息学分析，鉴定富集的sgRNA及靶基因信号通路分析。

图2显示了评估JEV在PK-15细胞中的最佳感染水平。A.比较不同感染复数MOI的乙脑病毒JEV感染PK-15细胞的致细胞病变效应；B.利用间接免疫荧光实验检测JEV编码的NS3蛋白在PK-15细胞中表达。

图3显示了采用猪的全基因组CRISPR/Cas9敲除文库策略鉴定JEV抗性基因。A.第3轮JEV攻毒后存活细胞中显著富集sgRNA靶基因分析；B.第4轮JEV攻毒后存活细胞中显著富集sgRNA靶基因分析；C.第3轮与第4轮JEV攻毒后存活细胞中排名前0.1％显著富集sgRNA靶基因的韦恩图分析；D.第3轮与第4轮JEV攻毒后存活细胞中排名前0.5％显著富集sgRNA靶基因的韦恩图分析。

图4显示了第3轮与第4轮JEV攻毒后存活细胞中排名前0.5％显著富集sgRNA靶基因的信号通路分析

图5显示了显著富集的sgRNA靶基因与HSPG合成和代谢途径有关。A.显著富集的sgRNA靶基因与GAG、HSPG合成与代谢通路基因韦恩图分析；B.HSPG信号通路相关基因的差异倍数分析；C.参与HSPG合成通路的靶基因模式图；D.参与HSPG硫基化修饰通路的模式图。

图6显示了敲除HSPG通路相关基因SLC35B2，HS6ST1，B3GAT3或GLCE能显著抑制JEV在PK-15细胞中的复制。A.SLC35B2，HS6ST1，B3GAT3或GLCE敲除细胞系测序结果；B.病毒空斑实验评估SLC35B2，HS6ST1，B3GAT3或GLCE敲除细胞抑制JEV复制效果；C.间接免疫荧光实验评估SLC35B2，HS6ST1，B3GAT3或GLCE敲除细胞抑制JEV复制效果；D.绝对定量PCR实验评估SLC35B2，HS6ST1，B3GAT3或GLCE敲除细胞抑制JEV复制效果；E.间接免疫荧光实验评估SLC35B2和HS6ST1敲除细胞中HSPG硫基化修饰水平变化。DAPI：细胞核；标尺：100μm。

图7显示了敲除SLC35B2，HS6ST1，B3GAT3或GLCE基因不影响PK-15细胞的正常增殖。DAPI：细胞核；标尺：100μm.

具体实施方式

经过广泛而深入的研究，本发明人首次开发了一种高通量筛选猪的病毒抗性基因的方法。具体地，本发明采用猪的全基因组CRISPR/Cas9敲除文库策略，在优化的JEV感染条件下进行了JEV抗性基因的高通量筛选，从而高效地确定出了可调控(尤其是提高)猪的病毒抗性的基因。实验表明，通过本发明方法筛选出的基因，可抑制JEV的复制从而提高猪对JEV的抗性，因此可作为抑制JEV复制的分子新靶点。在此基础上，发明人完成了本发明。

术语说明

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。

流行性乙型脑炎与日本脑炎病毒

流行性乙型脑炎(简称乙脑病)是由日本脑炎病毒(Japanese encephalitisvirus,JEV)感染引起的一种人畜共患病，属于国家二类动物疫病。流行性乙型脑炎是严重危害人畜健康的神经性传染疾病。蚊虫是该种疾病的中间传播媒介，主要通过带毒的蚊虫叮咬患病猪传播疾病，以蚊虫、猪、蚊虫的形式在猪场中广泛传播。因此猪乙型脑炎有着典型的季节性，多发生于蚊虫较多，大量繁殖的夏秋季节，属于自然疫源性疾病。猪场中暴发猪乙型脑炎后，公猪睾丸肿大，***可带毒通过配种传染；怀孕母猪流产、死胎、木乃伊胎；初生仔猪脑炎、共济失调、发热、死亡。

日本脑炎病毒属于披盖病毒科黄病毒科(Flaviridae)黄病毒属。JEV为单股正链RNA病毒，病毒呈球形，有囊膜，全长约为11kb，有3432个氨基酸组成，编码3个结构蛋白，分别为囊膜糖蛋白E，非糖基化囊膜蛋白M(PrM膜前体)和衣壳蛋白C(核心蛋白)；7个非结构蛋白(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5)，其中PrM蛋白和E蛋白具有免疫源性，能诱导机体产生持久的抗体和T记忆细胞，囊膜蛋白E有8种抗原决定簇，能够显示乙脑的特性。

基因失活

对于功能未知基因的研究可采用许多方法，例如使有待研究的基因失活，分析所得的遗传修饰的表型变化，进而获得该基因的功能信息。这一研究方法的另一优点是可以将基因功能和疾病进行关联，从而在获得基因功能的同时也能获得该基因作为潜在药物或者药物靶点所能治疗的疾病信息和疾病动物模型。基因失活的方法可通过基因剔除、基因中断或基因***的方式来完成。其中，基因剔除技术是研究人类基因在整体中的功能的非常强有力的手段。

如本文所用，术语“基因失活”、“基因敲除”可互换使用，指通过对某一目的基因进行中断、敲除等遗传操作，从而使得该目的基因的表达和/或活性大幅下降甚至完全丧失。

基因编辑器

在本发明中，所述基因编辑器包括DNA基因编辑器和RNA基因编辑器。在一优选实施方式中，本发明的基因编辑器包括基因编辑蛋白和任选的gRNA。

基因编辑蛋白

在本发明中，基因编辑蛋白的核苷酸可以通过基因工程技术来获得，如基因组测序、聚合酶链式反应(PCR)等，其氨基酸序列可由核苷酸序列推导而得到。在本发明的一个优选例中，所述基因编辑蛋白包括，但并不限于Cas13、Cpf1、SaCas9、Cas13a、Cas13b、Cas13c。

表达

如本文所用，术语“表达”包括mRNA从基因或基因部分的产生，并且包括由RNA或基因或基因部分所编码的蛋白质的产生，还包括与表达相关的检测物质的出现。例如，cDNA，结合配体(如抗体)与基因或其它寡核苷酸、蛋白质或蛋白质片段的结合以及结合配体的显色部分都包括在术语“表达”的范围内。因此，在免疫印迹如western印迹上半点密度的增加也处于以生物学分子为基础的术语“表达”的范围内。

CRISPR/Cas系统

CRISPR/Cas系统(Clustered regularly interspaced short palindromicrepeats/CRISPR-associated protein)是原核生物中一种抵抗外源基因侵入的获得性免疫防御机制。由细菌和古生菌在抵御外来病毒和噬菌体入侵的过程中不断进化而来。该系统能够整合外援侵入宿主的DNA片段到CRISPR位点，然后通过相应的CRISPR RNAs(crRNAs)引导Cas核酸内切酶对外源DNA序列进行切割，从而抵抗病毒或者噬菌体的入侵。CRISPR/Cas基因簇由一系列Cas蛋白(Cas1、Cas2、Cas4和效应蛋白如Cas9、Cpf1等)的编码基因和一段CRISPR序列组成，

CRISPR序列由一段前导序列(leader)、众多短而保守的重复序列区(repeat)和间隔区(spacer)组成。重复序列区含有回文序列，能够形成发卡结构。而间隔区就是被宿主俘获的外源DNA序列。这些被俘获的外源DNA序列相当于免疫系统的“黑名单”，当这些外源的遗传物质再次入侵宿主时，细菌开始转录CRISPR，形成初级转录产物pre-crRNA，再由核糖核酸酶或Cas蛋白在重复序列位点内切割形成成熟的crRNA，与特异的CRISPR效应蛋白形成核糖核蛋白复合体，识别并切割能与crRNA互补配对的外源DNA，造成双链断裂，引发宿主细胞的自我修复。

根据Cas基因的组成和效应蛋白的数量，CRISPR被分为了2类5型，共16种亚型。1类为利用多个效应蛋白复合物干扰靶基因的CRISPR/Cas系统，包括Ⅰ、Ⅲ和IV型；2类为利用单一的效应蛋白干扰靶基因的CRISPR/Cas系统，包括Ⅱ型和Ⅴ型。目前研究和利用最广泛的为2类Ⅱ型，即为CRISPR/Cas9系统。该系统2013年在哺乳动物细胞中成功实现了基因编辑。Ⅱ型系统可以通过crRNA的引导利用单个Cas9核酸酶对DNA靶位点进行精确充分地切割。该系统操作简单，实验周期短，效率高，且广泛适用于多个物种。该系统需要设计一段特殊的引导RNA，即sgRNA(single guide RNA)，sgRNA的序列设计是在基因组序列中的PAM(NGG)区的一段20nt左右核苷酸序列。在sgRNA的引导下，Cas9蛋白可以对基因组实现定点切割，引起DNA双链断裂，激活细胞的非同源末端连接(Non-homologous end joining，NHEJ)或同源重组(Homologous recombination，HR)两种修复机制，从而实现基因的敲除、随机的片段缺失或***，或者利用特定的模板修复，从而实现对基因组的永久性修饰。

CRISPR/Cas9敲除文库

利用功能缺失型(Loss-of-function)或者功能获得型(Gain-of-function)策略高通量筛选功能基因，是快速寻找调控特定表型的重要或关键基因的主要方法，而基于CRISPR/Cas9系统敲除文库高通量筛选功能基因是最佳策略之一。结合病毒感染阳性筛选，对成功整合sgRNA的细胞文库施加一定的筛选压力，仅使少数目的表型的细胞能够存活，可达到富集关键基因的目的。

JEV抗性相关基因和蛋白

用本发明方法，首次高效地筛选了多种JEV抗性相关基因及其编码蛋白(即JEV抗性相关蛋白)

典型地，在本发明方法中，选出的潜在的JEV抗性相关基因是富集度排名靠前的敲除sgRNA所对应的靶基因，例如排名如前m％的种类，其中，m≤5(较佳地，m为2，1，0.5，0.1)

典型的JEV抗性相关基因包括选自组A、组B或组C的JEV抗性相关基因。

本发明的研究表明，潜在的JEV抗性相关基因大多来自选自下组的通路：内质网蛋白质加工通路、糖胺聚糖(GAG)与合成硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)通路、糖胺聚糖(GAG)与合成硫酸软骨素通路、代谢信号通路、或其组合。

在本发明中，一些潜在的JEV抗性相关基因通过功能实验得到了进一步证实，这表明本发明方法的有效性。

优选的JEV抗性相关基因选自下组：SLC35B2、HS6ST1、B3GAT3、GLCE、或其组合。

JEV抗性促进剂和药物组合物

利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与JEV抗性相关基因基因或蛋白发生相互作用的物质，尤其是抑制剂等。

可用于本发明的用于提高JEV抗性的抑制剂(或拮抗剂)包括任何可以抑制JEV抗性相关基因或其编码蛋白的表达和/或活性的物质。

例如，所述抑制剂包括：抗体、JEV抗性相关基因的反义RNA、siRNA、shRNA、miRNA、基因编辑器、或JEV抗性相关蛋白的活性抑制剂。一种优选的抑制剂指的是能够抑制JEV抗性相关基因表达的基因编辑器。

优选的，本发明的抑制剂包括靶向JEV抗性相关基因序列的抑制剂。本发明抑制剂所作用的对象包括体细胞，尤其是JEV抗性相关基因高表达的体细胞。

在一种优选的实施方式中，一种提高JEV抗性或抑制JEV复制的方法包括步骤：利用特异性抗体中和JEV抗性相关蛋白，或利用病毒(如腺相关病毒)携带的shRNA或siRNA或基因编辑器，对JEV抗性相关基因进行沉默或敲除。

对JEV抗性相关基因的抑制率一般为达到至少50％以上的抑制，优选为60％、70％、80％、90％、95％的抑制，可以基于常规技术，例如流式细胞术、荧光定量PCR或Western blot等方法对抑制率进行控制和检测。

本发明JEV抗性相关蛋白的抑制剂(包括抗体、反义核酸、基因编辑器以及其他抑制剂)，当在治疗上进行施用(给药)时，可抑制JEV抗性相关蛋白的表达和/或活性，进而抑制JEV病毒复制，从而预防和/或治疗流行性乙型脑炎。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：局部、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、局部给药、自体细胞提取培养后回输等。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明抑制剂(如抗体、基因编辑器、反义序列(如siRNA)、或抑制剂)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克-10毫克/千克体重。

在本发明中，合适的给药方式包括(但并不限于)：口服、静脉注射、腹腔注射、皮下注射、椎管给药或直接脑内注射。

本发明的技术方案具有如下主要的有益效果：

1.本发明首次提供了一种基于猪全基因组CRISPR/Cas9敲除文库策略，高通量且高效地筛选JEV抗性基因的方法。

2.本发明基于猪全基因组CRISPR/Cas9敲除文库策略，首次筛选并鉴定了51个参与介导JEV复制的候选基因，这些候选基因(包括进一步经验证的基因)可作为药物开发或制备基因编辑抗病动物模型的分子靶点。

3.本发明首次验证了，通过敲除SLC35B2，HS6ST1，B3GAT3或GLCE基因，可显著抑制JEV的复制。

下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1：利用猪的全基因组CRISPR/Cas9敲除文库技术筛选JEV的抗性基因实验流程

为了采用全基因组无偏策略筛选参与介导JEV感染进而诱导细胞死亡的宿主因子，制定的实验流程如图1所示，包括步骤：

(1)制备猪的全基因组CRISPR/Cas9敲除sgRNA慢病毒文库质粒，包装慢病毒并测定滴度；

(2)用适量的sgRNA慢病毒感染稳定表达Cas9的PK-15细胞(PK-15-Cas9)；

(3)通过流式分选富集GFP阳性细胞，制备突变体细胞库；

(4)利用JEV分别感染未经任何处理的PK-15-Cas9(对照组)和突变体细胞，观察细胞病变，待对照组细胞全部死亡后，收集存活细胞；对于上一轮获得的存活细胞，进行第2轮、第3轮和第4轮JEV攻毒实验；

(5)对突变体细胞库、第3轮和第4轮JEV感染的存活细胞，进行PCR扩增和构建高通量测序文库，随后通过生物信息学分析鉴定富集的sgRNA；

(6)对筛选到的sgRNA对应的靶基因进行功能验证。

值得指出的是，本实施例中采用的猪的CRISPR/Cas9敲除文库共含85,674条sgRNA，包含针对17,743个蛋白编码基因，11,053个lncRNA和551个miRNA的sgRNA，以及1,000个阴性对照sgRNA(参见CN201710533398.9)。

实施例2：乙脑病毒JEV在PK-15细胞上最佳感染条件优化

2.1感染实验

分别将感染复数MOI为0.01，0.05和0.1的JEV乙脑病毒接种于单层汇合的PK-15细胞，在37℃培养箱中培养3天。

由图2A可见，与未感染对照组相比，接种JEV的细胞均发生细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)，且病变程度随病毒滴度增加程度增强。而随着时间变长，不同感染剂量组的PK-15细胞均发生死亡。这表明JEV感染并导致PK-15细胞病变和死亡为剂量依赖型。

2.2间接免疫荧光实验

检测JEV接种PK-15细胞后，JEV编码的NS3的蛋白表达情况，以评估JEV的感染效率。实验前一天将PK-15细胞接种到六孔板培养板中，待细胞密度生长至70～80％时接种JEV，设置不加病毒感染的阴性对照组；接种JEV后，每个孔加入1mL无血清的DMEM培养基，37℃培养1.5h；随后吸除旧培养基，更换为含有1％双抗，2％FBS的DMEM低糖新鲜培养基，继续培养4天；待细胞出现明显病变后，开展间接免疫荧光实验。

实验步骤为：(1)用预冷的PBS清洗细胞2次，加入预冷的4％多聚甲醛，室温静置15min；(2)吸出多聚甲醛，用预冷的PBS清洗细胞2次，加入预冷的0.3％TritonX-100，室温静置10min后吸出TritonX-100；(3)加入预冷的PBS，室温摇床孵育5min，重复此步骤3次；(4)吸出PBS，加入封闭液，室温孵育1-2h；(5)吸出封闭液，清洗细胞，同步骤3；(6)参考NS3抗体说明书进行稀释。加入NS3抗体稀释液，4℃孵育过夜；(7)吸出抗体稀释液，清洗细胞，同步骤3；(8)根据二抗说明书进行稀释。加入二抗稀释液，室温摇床避光孵育1-2h；(9)吸出二抗稀释液，清洗细胞，同步骤3；(10)细胞核染色：加入DAPI，室温避光染色10min；(11)吸出DAPI，PBS清洗细胞，同步骤3；(12)加入1mL PBS，荧光显微镜下观察荧光。

结果表明(图2B)：JEV感染PK-15细胞后，NS3蛋白表达与细胞核DAPI染色完全重叠，显示所有细胞里均含有乙脑病毒JEV，表明JEV感染效率高。

实施例3：对经过多轮JEV感染后存活的突变体细胞进行高通量测序与生信分析

3.1包装sgRNA慢病毒文库慢病和制备PK-15突变体细胞库

依据实施例1所述实验流程。先抽提猪的全基因组sgRNA慢病毒质粒，然后采用三质粒系统包装sgRNA慢病毒文库。目标质粒骨架为lenti-sgRNA-eGFP，辅助系统质粒为pspax2和pmd2.g。所有质粒均采用OMEGA公司的无内毒素质粒小提中量试剂盒(Endo-freePlasmid DNA Mini Kit II，货号#D6950-01)进行提取。慢病毒包装采用的细胞转染试剂为细胞株为HEK293T细胞。

sgRNA慢病毒包装实验流程如下：(1)取3代左右生长状态良好的HEK293T细胞进行慢病毒包装。转染前一天将细胞接种至10cm培养皿，待细胞长至90％-95％汇合度时进行转染。(2)转染前吸弃除旧培养基，加入5mL新鲜无抗生素2％FBS培养基继续放回培养箱培养。(3)对于一个10cm培养皿，慢病毒包装时质粒总量为24μg，三者的比例为pmd2.g：pspax2：目的质粒＝1：2：3；(4)向500μl Jetprime Buffer依次加入对应体积的质粒，轻轻吹打混匀后，加入40μl Jetprime regent，轻轻吹打混匀，室温静置10min；小心加入到培养皿中，轻轻摇匀放回培养箱。(5)质粒转染6-8h后，补加5ml含有1％双抗的2％FBS培养基，混匀后放回培养箱；第一次补液后24h观察细胞状态，再补加10ml含有1％双抗的2％FBS培养基,混匀后放回培养箱。(6)质粒转染第60h观察细胞状态及荧光表达情况，显微镜拍照记录；(7)收集细胞上清液(每2盘于一管)，封口膜密封后4℃，3,000rpm离心10min，使用0.45μm滤器过滤，然后30,000rpm，4℃超高速离心2.5h。(8)倒尽上清液，倒扣于吸水纸上吸尽残液，每管再加入120μL预冷的PBS重悬，混匀后将同种病毒浓缩液转至同一收集管中4℃过夜溶解病毒颗粒；之后将病毒悬液分装并置于-80℃长期保存。

利用感染复数MOI为0.3的sgRNA慢病毒文库感染稳定表达Cas9的PK-15细胞(PK-15-Cas9)，感染2天后，用流式细胞仪分选富集GFP阳性细胞并扩大培养，制备全基因组突变体细胞库。

3.2乙脑病毒JEV接种PK-15突变体细胞库收集存活细胞，制备测序文库与上机测序

依据实施例1所述实验流程，采用感染复数MOI为0.03的乙脑病毒JEV，分别接种PK-15-Cas9和全基因组突变体细胞。感染一定天数后，可观察到JEV接种PK-15-Cas9细胞时导致其全部死亡，而接种全基因组突变体细胞时，有少量细胞存活。更换新鲜的高浓度(20％)胎牛血清培养基扩大培养，再分别进行第2轮、第3轮和第4轮JEV攻毒实验，且各轮JEV接种的MOI均为0.03。最后分别收集感染前的突变体细胞，以及第3轮和第4轮JEV感染的突变体细胞，提取基因组DNA和PCR扩增，再制备测序文库并上机进行高通量测序。

对收集的细胞，参考DNA提取试剂盒Blood&Cell Culture DNA Midi Kit(QIAGEN)的说明书提取细胞基因组DNA。其中PCR扩增引物对的序列为：Lib-cell-F:GTGGAAAGGACGAAACACCG(SEQ ID No.:23)和Lib-cell-R:GCGGTACCTCTAGAGCCATT(SEQ IDNo.:24)。

PCR扩增反应体系为：

组份	反应体积
		Q5 High-Fidelity 2X Master Mix	25μL
Lib-cell-F(10μM)	2.5μL
		Lib-cell-R(10μM)	2.5μL
基因组DNA	1.0μg
		补充灭菌双蒸水	to 50μL

对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，确定为扩增阳性带后，使用PCR产物纯化试剂盒MinElute PCR Purification Kit(QIAGEN)进行纯化。将制备好的PCR纯化产物送公司构建测序文库并进行高通量测序。

3.3对高通量测序数据进行生物信息学分析

接着，利用MAGeCK软件(https://sourceforge.net/projects/mageck/)对不同样品来源的高通量测序数据进行sgRNA富集分析。

设定测序数排名前0.5％的sgRNA为富集的sgRNA(表1)。而分析结果如图3A和B可见，第3轮乙脑病毒JEV攻毒后存活细胞中鉴定的富集倍数最高的排名前10的sgRNA对应的靶基因为SEC63、PRKCSH、SLC35B2、RNF145、SMOX、CALR、DMGDH、EXT2、B3GAT3和GSTO2，而第4轮中鉴定的富集倍数排名前10的sgRNA对应的靶基因为SLC35B2、SMOX、RNF145、DMGDH、SEC63、EXT2、CALR、B3GAT3、EXT1和PRKCSH。值得注意的是，这些基因是高度重合的，有9个基因是在第3轮和第4轮中重复出现，除了EXT1(在第4轮中列第9位)和GSTO2(在第三轮中列第10位)。

接着，对第3轮和第4轮JEV感染而存活的宿主细胞中富集sgRNA的靶基因进行韦恩图分析，发现两种共有的基因有44个(重叠率为86.3％)，而第3轮筛选独有的为3个，第4轮筛选独有的为4个，这些靶基因排名前0.1％。

再对排名前0.5％的进行韦恩图分析，发现两种共有的基因有231个(重叠率为89.9％)，而第3轮筛选独有的为12个，第4轮筛选独有的为14个。

上述结果表明，经过第3轮和第4轮JEV攻毒后鉴定存活细胞中的sgRNA靶基因重叠率相对高，基本可达到稳定筛选的目的，这为今后采用类似的策略筛选其它致病微生物提供了重要的参考依据。

在表1中，列举了基于第3轮和第4轮JEV感染宿主细胞筛选存活细胞获得的sgRNA对应的测序数和靶基因数量。这些筛选到的候选功能基因，将可作为抑制JEV复制或感染的重要分子靶标。

表1.利用CRISPR/Cas9敲除文库鉴定排名前0.1％的sgRNA及靶基因

注：表1中，以下基因出现了2次或更多：B3GAT3、EXT1、EXT2、EXTL3、GLCE、HS6ST1、PRKCSH、RNF145、SEC63。

实施例4：对显著富集的sgRNA靶基因进行信号通路分析

4.1KEGG分析

基于实施例3所述，通过第3轮和第4轮JEV攻毒鉴定存活细胞中，对排名前0.5％的sgRNA的靶基因，利用DAVID软件(https://david.ncifcrf.gov/)进行KEGG分析。

结果如图4所示，第3轮JEV攻毒存活细胞中，富集的sgRNA靶向基因参与的信号通路为：内质网蛋白质加工、糖胺聚糖(GAG)与合成硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)，糖胺聚糖(GAG)与合成硫酸软骨素(chondroitin sulfate,ChS)；而第4轮JEV感染的宿主细胞，除了跟第3轮相同外，还与代谢信号通路相关。

4.2韦恩图分析

将第3轮和第4轮JEV攻毒存活细胞中鉴定的共有的排名前0.5％的sgRNA的靶基因，分别与GAG信号通路，HSPG代谢及合成通路进行韦恩图分析。

结果如图5A所示，其中富集到HSPG合成代谢通路的基因有10个，分别为：EXT1、EXT2、GLCE、HS6ST1、B3GAT3、B4GALT7、XYLT2、EXTL3、SLC35B2和GAA。

4.3sgRNA测序数分析

进一步与全部筛选获得的sgRNA对应的测序数进行分析。

结果表明(图5B)，有3条sgRNA分别对应EXT1和HS6ST1，有2条sgRNA分别对应B3GAT3,EXT2，EXTL3和GLCE，这表明筛选的靶基因较为可靠。

如图5C和D可见，EXT1和EXT2等参与HSPG的生物合成，而SLC35B2和HS6ST1参与HSPG的硫酸基转运和修饰。这提示，筛选富集的基因可能在猪中PK-15细胞中参与HSPG的生物合成与硫基化修饰，从而参与介导JEV的复制进程。

实施例5：利用CRISPR/Cas9技术敲除HSPG通路相关基因后显著抑制JEV复制

5.1构建sgRNA表达载体

选取实施例4中参与HSPG生物合成和修饰的SLC35B2，HS6ST1，B3GAT3或GLCE，利用CRISPR/Cas9慢病毒技术，分别构建基因敲除细胞系。

从sgRNA慢病毒文库中选取靶向SLC35B2、HS6ST1、B3GAT3和GLCE的sgRNA，序列和载体构建引物如表2和表3所示：

表2sgRNA序列

基因名称	sgRNA序列(5'-3'-NGG)	SEQ ID No:
			SLC35B2	GTCTCTGCTGGCTCTGACCG<u>GGG</u>	1
HS6ST1	AACCTGTCCTTCATCCCCGA<u>GGG</u>	2
			B3GAT3	GGACCGCCAGATGTGTGAAG<u>AGG</u>	3
GLCE	TTGAAGCCACCAACAACAGG<u>GGG</u>	4

注：下划线为PAM。

表3构建sgRNA表达载体所用的引物对

sgRNA表达载体构建流程为：sgRNA退火：稀释sgRNA正反向引物浓度至10μM；吸取左右引物各5μL，混匀；PCR仪上95℃，10min；65℃，1h，然后与酶切线性化的sgRNA表达载体进行连接。

sgRNA表达载体酶切体系：

组份	反应体积
		Lenti-sgRNA-GFP	2μg
10x Fast Digest buffer	2μL
		BpiI(BbsI)	2μL
补水至	20μL

配置好酶切反应液后，置于37℃，水浴3h酶切；随后对酶切产物进行凝胶电泳与纯化回收，再与退火的sgRNA引物对进行连接。

sgRNA表达载体连接体系：

组份	反应体积
		Ligation Mix(Takara)	5μL
线性化的sgRNA慢病毒质粒	50ng
		退火的sgRNA	1ng
补水至	10μL

5.2包装sgRNA慢病毒和制备基因敲除细胞

对于构建好靶向SLC35B2、HS6ST1、B3GAT3和GLCE的sgRNA表达载体后，通过测序进行验证。

对经过测序验证的菌液扩大培养，利用无内毒素质粒提取试剂盒(OMEGA,#D6950-01)分别提取质粒并测定浓度。

随后进行sgRNA慢病毒的包装，实验步骤为：(1)取新复苏的HEK293T细胞，培养3代左右进行转染。在转染前一天细胞接种至10cm细胞培养皿。(2)待细胞达到80～90％汇合度时进行转染。转染前弃除旧培养基，PBS冲洗一遍，加入5mL新鲜2％FBS DMEM培养基(无抗生素)，置于培养箱中继续培养；(3)一个10cm细胞培养皿需要转染质粒总量为24μg，用500uLJetPrime Buffer稀释质粒DNA(PMD2.G：PSPAX：目的＝1:2:3)，混匀；(4)加入40μLJetPrime(PolyPlus,#B180306)，混匀；(5)室温放置10min，小心加入细胞培养基中，轻轻摇匀；(6)转染后6-8h，补加5mL含有1％双抗，2％FBS的DMEM培养基，混匀继续培养；(7)24h后再补加10mL含有1％双抗，2％FBS的DMEM培养基；(8)60h后收集全部上清液至50mL离心管中，用0.45μm滤器过滤；(9)过滤后的上清液在4℃，30000rpm离心2.5h；(10)离心结束，倒尽上清液，用吸水纸吸干残液。病毒浓缩在管底，每管加入100μL预冷的1％双抗，10％FBS的DMEM培养基或预冷的PBS重悬病毒；(11)4℃过夜溶解病毒，最后置于-80℃保存。

测定纯化慢病毒的滴度，感染PK-15-Cas9细胞后，分别通过流式细胞分选与挑取不同基因编辑的单克隆细胞进行扩大培养。随后取部分细胞，参考DNA提取试剂盒的说明书(TIANGEN,#DP304)分别提取基因组DNA，再进行PCR扩增，其中特异的PCR引物为见表4。

表4.PCR扩增引物对

引物名称	引物序列(5'-3')	SEQ ID No.:
			SLC35B2-F	ACGCTGTAAGGTCAGCATCTC	13
SLC35B2-R	GGAAAGGGTGGGTAAGTGTGTT	14
			HS6ST1-F	GTCAGGTTGTCCCTCCCAAG	15
HS6ST1-R	GCATGAAAGGCCGGATGAAC	16
			B3GAT3-F	AGCGTGAAGTTGACAGGCAAG	17
B3GAT3-R	CATCCCAGGACTCACCTCCTCA	18
			GLCE-F	AAATGTCAGTAGTACACCTTGGC	19
GLCE-R	GCCATCGTACTGAACCACCT	20

对PCR产物进行测序，测序结果如图6A可见，4种单克隆基因编辑细胞均存在3的非整数倍碱基缺失或***，由此会造成阅读框的移码突变，达到基因敲除的效果。

5.3评估基因敲除细胞抑制JEV复制的能力

5.3.1病毒空斑实验

通过病毒的空斑实验，分别比较基因敲除和野生型细胞，在JEV的MOI分别为0.03和0.1的条件下，对JEV病毒复制的影响。实验流程如下：首先制备病毒上清液：(1)前一天接种PK-15细胞至6孔培养板中；(2)待生长至70％时，接种JEV-RP9，设置对照组；(3)每个孔加入1mL无血清的DMEM培养基，37℃培养1.5h；(4)吸掉旧培养基，更换为含有1％双抗，2％FBS的DMEM低糖培养基继续培养；(5)感染48h后，将培养板置于-80℃反复冻融2次；(6)收集病毒上清液冻存在-80℃。

随后，开展空斑形成实验，实验流程为：(1)前一天将BHK细胞接种至12孔细胞培养板中；(2)细胞生长至30～40％，接种病毒上清液。病毒稀释液配制：取900μL DMEM和100μL病毒原液，做连续10倍稀释(10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7，10^-8)，轻轻吹打混匀；(3)将细胞从培养箱内取出，吸掉孔内的培养基，用PBS洗1-2次。吸取上述稀释的病毒液800μL加至培养板中，再补加200μL DMEM，每个孔做3个重复。摇匀放至37℃培养箱2h，期间每隔15-20min轻摇混匀；(4)2h后，吸掉旧培养基，换为1mL含2％FBS、1％双抗和50％低熔点琼脂糖的DMEM(2×)培养基；(5)4℃冰箱放置几分钟至琼脂糖凝固，然后于37℃5％CO₂培养箱继续培养。(6)48h后倒掉琼脂糖。加10％中性甲醛固定4h以上，每孔加满，放置通风橱内，打开风机；(7)冲洗10％中性甲醛。加结晶紫染色30min以上，用自来水冲洗至无紫色，倒立烘干；(8)空斑计数。

结果如图6B所示，在不同的感染复数MOI的乙脑病毒JEV的接种条件，与野生型相比，当SLC35B2，HS6ST1，B3GAT3或GLCE的基因敲除后，能显著抑制JEV的复制。

5.3.2间接免疫荧光实验

通过间接免疫荧光实验，分别检测了不同MOI的JEV感染条件下，JEV编码的NS3蛋白的表达。实验流程同实施例2所述。

结果如图6C所示，在不同的感染复数MOI的乙脑病毒JEV的接种条件，与野生型相比，当SLC35B2，HS6ST1，B3GAT3和GLCE的基因敲除后，能显著抑制JEV编码的NS3蛋白表达。

5.3.3绝对定量PCR实验

参考病毒RNA提取试剂盒说明书，分别提取野生型细胞和SLC35B2，HS6ST1，B3GAT3和GLCE的基因敲除细胞中的病毒RNA，通过绝对定量PCR方法，检测JEV编码的C基因的拷贝数。实验流程为：(1)敲除细胞系接种JEV，方法同实施案例2；(2)提取病毒上清液RNA。参照病毒核酸纯化试剂盒(Takara，#9766)；(3)反转录成cDNA。参照PrimeScript^TM II 1stStrand cDNA Synthesis Kit(Takara，#6210)；(4)PCR扩增JEV-RP9的C基因，克隆至PMD-19T载体上，测序鉴定正确后提取PMD19-T-C质粒，测定浓度，计算出拷贝数；其中定量PCR扩增引物序列为：JEV-RP9-C-F:GAGCTTGTTGGACGGCAGAG(SEQ ID No.:21)和JEV-RP9-C-R:CACGGCGTCGATGAGTGTTC(SEQ ID No.:22)。将质粒连续做10倍的倍比稀释，作为标准质粒，用于制作标准曲线；最后根据标准质粒制作的标准曲线计算样品的拷贝数。

PCR反应体系为：

组份	反应体积
		SYBRGreen	10μL
JEV-RP9-C-F	0.6μL
		JEV-RP9-C-R	0.6μL
cDNA	1μL
		H<sub>2</sub>O	7.8μL

绝对定量PCR的结果如图6D所示：与野生型相比，SLC35B2，HS6ST1，B3GAT3和GLCE的基因敲除后，JEV编码C基因的拷贝数显著降低。

5.3.4对HSPG硫基化修饰的影响

通过间接免疫荧光实验，检测了SLC35B2和HS6ST1基因敲除细胞中，对HSPG硫基化修饰的影响。采用的抗体为：Heparan sulfate(HS)(USBiological,H1890)。实验方法同实施例2所述。

结果如图6E所示，敲除SLC35B2或HS6ST1基因后，能显著抑制HSPG的硫基化修饰水平，表明HSPG的硫基化修饰对介导JEV的复制至关重要。

实施例6利用EdU实验评估基因敲除对细胞正常增殖的影响

在本实施例中，通过EdU细胞增殖实验，进一步检测敲除SLC35B2，HS6ST1，B3GAT3和GLCE基因后对细胞增殖的影响。

实验步骤为：(1)前一天接种细胞至12孔培养板中；(2)待细胞生长至30～50％时，进行EdU染色；(3)用细胞培养基按1000：1的比例稀释EdU溶液，制备适量50μM EdU培养基；(4)每孔细胞样品加入500μL 50μM EdU培养基孵育2h，弃培养基；(5)预冷的PBS清洗细胞3次，每次5min。(6)每孔细胞样品加入500μL细胞固定液(即含4％多聚甲醛的PBS)室温孵育30min；(6)预冷的PBS清洗细胞3次，每次5min；(7)每孔细胞样品加入500μL渗透剂(0.3％TritonX-100的PBS)脱色摇床孵育10min；PBS清洗3次，每次5min。(8)每孔加入500μL的1X染色反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30min后，弃染色反应液；(8)PBS脱色摇床清洗3次，每次5min。然后进行细胞核染色：加入DAPI，室温避光染色10min；弃去DAPI，PBS脱色摇床清洗3次，每次5分钟；加入1mL PBS，尽快在荧光显微镜下观察荧光。

如图7可见，敲除SLC35B2，HS6ST1，B3GAT3和GLCE基因后，与野生型相比，EdU染色的荧光信号与DAPI重叠。这表明，敲除这些基因后不影响细胞的正常增殖。

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