阅读说明：本技术 一种寡肽在制备治疗或预防肾缺血再灌注损伤的药物中的应用 (A kind of application of oligopeptides in the drug that preparation treats or prevents renal ischemic reperfusion injury ) 是由 刘吉华 戴文玲 李姗姗 于 2019-09-27 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种寡肽在制备治疗或预防肾缺血再灌注损伤的药物中的应用。其中所述寡肽序列为SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的寡肽,或者为该寡肽所述寡肽的氨基酸经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的寡肽。在肾脏缺血再灌注小鼠模型中,所述寡肽能够明显缓解小鼠肾脏缺血再灌注损伤；显著降低肾脏缺血再灌注模型小鼠血清中的肌酐和尿素氮水平,有效改善肾脏缺血再灌注模型小鼠肾脏病理损伤。本发明的寡肽可以用于制备预防和治疗肾脏缺血再灌注损伤的治疗药物。(The present invention provides a kind of application of oligopeptides in the drug that preparation treats or prevents renal ischemic reperfusion injury.Wherein the oligopeptide sequence is the oligopeptides of amino acid sequence shown in SEQ ID No.1, or is substitution and/or deletion and/or addition obtained with the same function oligopeptides of the amino acid by one or several amino acid residues of oligopeptides described in the oligopeptides.In renal ischemia/reperfusion injury mouse model, the oligopeptides can be relieved mouse kidney ischemical reperfusion injury；The creatinine and urea nitrogen levels in renal ischemia/reperfusion injury model mice serum are significantly reduced, the damage of renal ischemia/reperfusion injury model mice Pathological is effectively improved.Oligopeptides of the invention can be used for preparing the therapeutic agent for preventing and treating ischemia-reperfusion injury of kidney.)

一种寡肽在制备治疗或预防肾缺血再灌注损伤的药物中的 应用

技术领域

本发明涉及一种寡肽的应用，尤其涉及一种寡肽在制备治疗或预防肾缺血再灌注损伤的药物中的应用。

背景技术

肾脏缺血再灌注损伤(renal ischemia reperfusion injury，RIRI)是指在肾组织缺血基础上恢复血液灌注后肾脏功能不能得到恢复，甚者出现更为彻底地、不可逆地肾脏损害或急性肾衰竭的一种常见的病理生理现象。常见于肾脏移植手术、肾脏外伤手术、体外冲击波碎石术等情况，是导致急性肾功能衰竭的主要原因之一。肾脏缺血再灌注损伤还可进一步恶化肾脏基础疾病、拖延治疗周期，极大增加了病人的死亡率。其发病率高且预后不良，作用机制尚未完全阐明，目前尚无特异有效的干预措施。所以发现预防或治疗肾脏缺血再灌注损伤的药物具有重要的临床意义。

RIRI的病理过程是一个复杂的网络级联反应，目前已知主要的病理机制涉及氧化应激、钙超载、细胞自噬、凋亡与缺血、炎症损伤、免疫系统激活等方面。肾组织在缺血再灌注过程中会产生大量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，超过了机体的清除能力，ROS因其极易与各种细胞结构成分发生反应而导致细胞氧化损伤。细胞内Ca²⁺的升高可以激活钙依赖性蛋白酶，降解细胞内蛋白，也导致焦磷酸钙络合物的生成和尿酸的形成及活性氧的产生，并促进炎症的发生；线粒体钙超载会导致线粒体通透性转换孔(mitochondrialpermeablity transition pore，MPT)的开放，MPT的开放是细胞死亡过程中的一个关键事件，最终导致肾组织的损伤及肾功能的下降。RIRI往往伴随一系列炎症损伤，主要表现为白细胞聚集并穿过微血管壁，浸润周围组织，同时伴有微血管功能紊乱及局部组织中液体和蛋白质集聚。缺血期代谢产物蓄积、组织细胞碎片等均可触发急性炎症反应，肾实质细胞和驻留的白细胞分泌多种趋化因子和细胞因子，这些炎症介质、细胞内粘附分子-1(ICM-1)和P-选择素又招募白细胞浸润到缺血组织，然后导致白细胞和内皮细胞相互作用增强，从而促进内皮细胞损伤、肿胀，阻碍血液流动。这些炎症介质还介导单核细胞、嗜中性粒细胞、T细胞、炎性树突状细胞和NKT细胞在肾脏的迁移，浸润的白细胞可进一步增加趋化因子和细胞因子的分泌，诱发炎症反应。炎症细胞浸润是RIRI发病机制和肾小管间质损伤进展的关键过程。尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)是临床上评价肾功能常用指标，BUN是体内蛋白质代谢产物，Scr是肌肉代谢产生的含氮有机物，这两种代谢产物经肾脏排出体外，其血中浓度取决于肾小球滤过能力，如果肾实质损伤，肾小球滤过率下降，降到临界点后血中BUN、Scr就会升高。因此BUN、Scr可用于评价肾脏缺血再灌注损伤后肾功能变化。

然而，目前仍不清楚启动和促进炎症的具体过程。RIRI的整体机制非常复杂，涉及不同分子途径之间的相互作用，其发病机制至今仍未完全阐明，治疗方法也未有突破，临床上尚无防治肾缺血再灌注损伤的特效药物，现有治疗方案大多是给予抗炎药物及增强免疫药物，长时间使用会产生耐药性、全身效应等问题，并且由于RIRI发病率高且预后较差，目前仍缺乏十分有效的防治手段，多是在RIRI发生前或发生时给予抗氧化剂或抗炎药等来减少炎性反应及细胞凋亡等对肾脏的损伤。因而开发对缺血再灌注肾损伤的保护药物具有重要的临床意义和价值。

专利110128506A(公开日2019-08-16)公开了氨基酸序列为Xm-Leu-Asn-Leu-Tyr-Yn的寡肽，本申请为在此基础上公开了所述寡肽以及所述寡肽的氨基酸经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的寡肽在制备治疗或预防肾缺血再灌注损伤的药物中的用途。

发明内容

发明目的：本发明的第一目的在于提供一种寡肽，本发明的第二目的在于提供所述寡肽在制备治疗或预防肾缺血再灌注损伤的药物中的应用。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供一种寡肽在制备治疗或预防肾缺血再灌注损伤药物中的应用，所述寡肽为a1)或a2)：

a1)为SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的寡肽；

a2)为a1)所述寡肽的氨基酸经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的寡肽。

其中，上述SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的寡肽即为Leu-Asn-Leu-Tyr-Pro。

优选地，所述的寡肽为a1)所述寡肽增加一个氨基酸的六肽。

优选地，所述的寡肽为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的寡肽。即该寡肽的氨基酸序列为Leu-Asn-Leu-Tyr-Pro-Tyr。

优选地，所述药物由所述寡肽和药学上可接受的载体组成。所述药学上可接受的载体，它可能具有一定生理活性，但该成分的加入不会改变上述药物组合物在疾病治疗过程中的主导地位，而仅仅发挥辅助功效，这些辅助功效仅仅是对该成分已知活性的利用，是医药领域惯用的辅助治疗方式。若将上述辅助性成分与本发明药物组合物配合使用，仍然应属于本发明保护的范围。

优选地，所述药学上可接受的载体为稀释剂、载剂或赋形剂。

进一步地，所述药物为注射制剂或口服制剂。

有益效果：本发明通过夹闭小鼠双侧肾脏肾蒂建立肾缺血再灌注损伤模型，应用寡肽给药处理，能极显著下调模型小鼠血清肌酐及尿素氮水平，肾脏病理切片显示寡肽能显著抑制模型小鼠肾小管大面积凝固性坏死及组织结构破坏，显著降低肾脏组织中炎症因子TNF-α、IL-1β及IL-10水平。显示寡肽对肾脏缺血再灌注损伤具有良好的预防及治疗作用。

附图说明

图1为LP-5对肾脏缺血再灌注模型小鼠血清Scr、BUN含量的影响。A.小鼠血清肌酐(Scr)含量；B.小鼠血清尿素氮(BUN)含量。###，p<0.001vs.sham；***，p<0.001vs.model；n＝10

图2为LP-5对肾脏缺血再灌注模型小鼠肾脏组织中TNF-α、IL-1β及IL-10的含量的影响。A.小鼠肾组织中TNF-α的含量；B.小鼠肾组织中IL-1β的含量；C.小鼠肾组织中IL-10的含量。###，p<0.001vs.sham；***，p<0.001；**，p<0.01vs.model；n＝10

图3为LP-5对肾脏缺血再灌注模型小鼠肾脏组织形态的影响(HE染色)

图4为LP-6对肾脏缺血再灌注模型小鼠血清Scr、BUN含量测定结果。A.小鼠血清肌酐(Scr)含量；B.小鼠血清尿素氮(BUN)含量。###，p<0.001vs.sham；***，p<0.001vs.model；n＝10

图5为LP-6对肾脏缺血再灌注模型小鼠肾脏组织中TNF-α、IL-1β及IL-10的含量测定结果。A.小鼠肾组织中TNF-α的含量；B.小鼠肾组织中IL-1β的含量；C.小鼠肾组织中IL-10的含量。###，p<0.001vs.sham；***，p<0.001；**，p<0.01vs.model；n＝10

图6为LP-6对肾脏缺血再灌注模型小鼠肾脏组织形态的影响(HE染色)

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。

实施例1

寡肽LP-5对小鼠肾脏缺血再灌注损伤的保护作用

1.实验材料

Leu-Asn-Leu-Tyr-Pro(简称为LP-5)，如SEQ NO ID.1所示，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；

血清BUN检测试剂盒、血清Scr检测试剂盒(南京建成生物工程研究所有限公司)；TNF-α、IL-1β、IL-10炎症因子ELISA检测试剂盒(南京建成生物工程研究所有限公司)；

清洁级健康雄性ICR小鼠，体重18-22g，由扬州大学动物实验中心提供(许可证号：SYXK(苏)2018-0019)。实验动物进行分笼饲养，环境温度24±2℃、相对湿度60％，每天12h光照和12h黑夜循环。

2.小鼠肾脏缺血再灌注模型(RIRI)建立

小鼠腹腔注射10％水合氯醛(400mg/kg)，麻醉小鼠，待翻正反射消失后俯卧位放在小鼠解剖台上，固定，无菌条件下沿双背侧纵形切口1.5cm进入腹腔，钝性分离肌肉，暴露两侧肾蒂，用无损伤血管夹阻断血流，肾脏从红色转成暗紫色表示缺血成功。缺血30min后松开动脉夹，肾脏恢复灌注后关闭腹腔，建立RIRI模型。

3.实验分组

小鼠(ICR)随机分为5组，分别为空白组(sham)、模型组(model)、LP-5组(10mg/kg)。于手术前2天、1h及术后1h，空白、模型组尾静脉注射生理盐水，给药组注射LP-5。24h后，各组小鼠麻醉，打开胸腔，用注射器采集右心房血液。血液置于加肝素钠抗凝的1.5mLEP管中，室温放置30min后4℃3000rpm/min离心10min，取血浆置于-80℃冰箱备用。取血后取双侧肾脏组织，置于冻存管中，-80℃冰箱备用，用于HE染色及组织炎症因子测定。

4.检测指标

实验各组小鼠血浆Scr和BUN浓度根据血浆肌酐与尿素氮检测试剂盒的说明进行分析。肾脏组织炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-10按照ELISA检测试剂盒说明书检测小鼠肾组织匀浆中相关炎症因子水平。小鼠肾脏组织形态学变化采用苏木精-伊红(HE)染色进行分析。

5.实验结果

5.1血浆生化指标

血浆肌酐(Scr)检测结果显示(图1A)，与sham组比较，模型组Scr显著升高(###，p<0.001vs.sham)；给予LP-5后，Scr水平显著降低，差异具有极显著统计意义(**，p<0.01vs.model)。血浆尿素氮(BUN)检测结果显示(图1B)，与sham组比较，模型组BUN显著升高(###，p<0.001vs.sham)；给予LP-5后，BUN水平显著降低，差异具有显著统计意义(**，p<0.01vs.model)。

5.2肾脏组织炎症因子水平变化

图2结果显示，与sham组比较，模型组肾脏组织炎症因子TNF-α、IL-1β及IL-10水平显著升高(###，p<0.001vs.sham)；给予LP-5后，三者水平均显著降低，差异具有极显著统计意义(***，p<0.001vs.model)。

5.3肾脏组织结构变化

由图3可知，sham组肾脏组织皮质区内可见由毛细血管缠绕而成的肾小球结构；可见细胞为矮柱状，具有明显的刷状缘的近曲小管和上皮细胞为立方上皮细胞；组织形态结构正常，未见明显病理变化。Model组的组织内可见大面积肾小管凝固性坏死，细胞结构消失，组织结构破坏，如箭头所示。LP-5给药组的组织内局部出现肾小球萎缩，肾小球内毛细血管数量略有减少，局部出现肾小球囊扩张，如箭头所示。给予LP-5后对肾脏缺血再灌注模型小鼠具有显著的肾脏保护作用。

实施例2

寡肽LP-6对小鼠肾脏缺血再灌注损伤的保护作用

1.实验材料

Leu-Asn-Leu-Tyr-Pro-Tyr(简称为LP-6)，如SEQ NO ID.2所示，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；其它材料同实施例1中实验材料项下内容。

2.小鼠肾脏缺血再灌注模型(RIRI)建立

方法同实施例1中小鼠肾脏缺血再灌注模型(RIRI)建立项下内容。

3.实验分组

小鼠(ICR)随机分为5组，分别为空白组(sham)、模型组(model)、LP-6组(10mg/kg)。于手术前2天、1h及术后1h，空白、模型组尾静脉注射生理盐水，给药组注射LP-6。24h后，各组小鼠麻醉，打开胸腔，用注射器采集右心房血液。血液置于加肝素钠抗凝的1.5mLEP管中，室温放置30min后4℃3000rpm/min离心10min，取血浆置于-80℃冰箱备用。取血后取双侧肾脏组织，置于冻存管中，-80℃冰箱备用，用于HE染色及组织炎症因子测定。

4.检测指标

实验各组小鼠血浆Scr和BUN浓度根据血浆肌酐与尿素氮检测试剂盒的说明进行分析。肾脏组织炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-10按照ELISA检测试剂盒说明书检测小鼠肾组织匀浆中相关炎症因子水平。小鼠肾脏组织形态学变化采用苏木精-伊红(HE)染色进行分析。

5.实验结果

5.1血浆生化指标

血浆肌酐(Scr)检测结果显示(图4A)，与sham组比较，模型组Scr显著升高(###，p<0.001vs.sham)；给予LP-6后，Scr水平显著降低，差异具有极显著统计意义(**，p<0.01vs.model)。血浆尿素氮(BUN)检测结果显示(图4B)，与sham组比较，模型组BUN显著升高(###，p<0.001vs.sham)；给予LP-6后，BUN水平显著降低，差异具有极显著统计意义(**，p<0.01vs.model)。

5.2肾脏组织炎症因子水平变化

图5结果显示，与sham组比较，模型组肾脏组织炎症因子TNF-α、IL-1β及IL-10显著升高(###，p<0.001vs.sham)；给予LP-6后，三者水平均显著降低，差异具有极显著统计意义(***，p<0.001vs.model)。

5.3肾脏组织结构变化

由图6可知，sham组肾脏组织皮质区内可见由毛细血管缠绕而成的肾小球结构，肾小球囊腔间隙均匀未见扩张；可见细胞为矮柱状，具有明显的刷状缘的近曲小管和上皮细胞为立方上皮细胞，组织形态结构正常，未见明显病理变化。Model组的组织内可见大面积肾小管凝固性坏死，细胞结构消失，组织结构破坏，如箭头所示。LP-6给药组的组织内局部可见肾小球萎缩，局部出现肾小球囊扩张，如箭头所示。给予LP-6后对肾脏缺血再灌注模型小鼠具有显著的肾脏保护作用。

序列表

<110> 中国药科大学

<120> 一种寡肽在制备治疗或预防肾缺血再灌注损伤的药物中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

Leu Asn Leu Tyr Pro

1 5

<210> 2

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 2

Leu Asn Leu Tyr Pro Tyr

1 5