一种活性十肽在保护听觉毛细胞方面的应用
阅读说明：本技术 一种活性十肽在保护听觉毛细胞方面的应用 (Application of active decapeptide in aspect of protecting auditory hair cells ) 是由 孙晨 张姗姗 刘可春 巴帅康 高燕 于 2020-05-14 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种活性十肽在保护听觉毛细胞方面的应用,所述十肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。检测后首次发现,该多肽化合物可以通过抑制庆大霉素在毛细胞内的过量积聚来对毛细胞起保护作用,改善耳毒性药物对听觉毛细胞的损害,且毒副作用小,是一种很有开发前景的听力保护药物,具有广阔的市场前景。(The invention relates to an application of active decapeptide in protecting auditory hair cells, wherein the amino acid sequence of the decapeptide is shown as SEQ ID NO. 1. The polypeptide compound is found for the first time after detection to play a role in protecting hair cells by inhibiting the excessive accumulation of gentamicin in the hair cells, improve the damage of ototoxic drugs to auditory hair cells, have small toxic and side effects, are hearing protection drugs with a good development prospect and have a wide market prospect.)
技术领域
本发明涉及一种活性十肽在保护听觉毛细胞方面的应用，属于生物医药技术领域。
背景技术
氨基糖苷类药物是临床上常用的一类抗生素，因其具有性质稳定、抗菌能力强、用药成本低等特点，在临床上的应用非常广泛。但是此类药物具有较强的耳毒性，能够杀死哺乳动物内耳中的听觉毛细胞，进而导致感音神经性耳聋。庆大霉素即是氨基糖苷类药物的代表之一。听觉毛细胞是氨基糖苷类药物的易感细胞。当氨基糖苷类药物作用机体时，它极易在听觉毛细胞中积聚，进而诱导其凋亡。在哺乳动物的听觉系统中，听觉毛细胞是一种退出细胞周期的终末分化型细胞，一旦受损将无法再生。因此，由于氨基糖苷类药物作用所导致的感音神经性耳聋，至今尚无有效药物可以防治。寻找一种新型化合物，使其可以抑制听觉毛细胞对氨基糖苷类药物的过量吸收，将有助于感音神经性耳聋疾病的防治，并将有助于推动其相关治疗药物的研发，具有非常重要的意义。
在耳毒性防治药物的研究领域，斑马鱼是近年来兴起的一类新型脊椎动物模式生物，它具有典型的内耳听觉毛细胞，无论是在结构功能还是分子水平，该毛细胞均与人类高度同源。除此之外，斑马鱼的侧线部位还具有大量受神经支配的侧线毛细胞。该侧线毛细胞在结构、功能和基因调控等方面，也与人类内耳中的听觉毛细胞高度同源，且对氨基糖苷类药物极为敏感。当斑马鱼发育至第4天时，其毛细胞既已发育完全。由于此时斑马鱼全身透明，因此借助荧光标记等技术，可对其毛细胞进行实时观察。目前借助斑马鱼模型，寻找对听觉毛细胞具有保护功效的新型化合物，成为治疗感音神经性耳聋的关键。
香螺(Neptunea arthritica cumingii)是一种大型捕食性腹足动物，属软体动物门(Mollusca)，腹足纲(Gastropoda)，新腹足目(Neogastropoda)，蛾螺科(Buccinida)。它在我国的黄海和渤海区域分布十分广泛。目前有关香螺的研究主要集中在基因组、营养学、生殖特征等，与其活性成分相关的报道较少。本发明人前期从香螺中得到了一种新型多肽，研究发现该多肽具有修复氧化损伤的功能。目前该多肽虽已申请相关专利(专利号：ZL201810915407.5)，但是它并未涉及该多肽在听觉保护领域，特别是在抑制听觉毛细胞过量吸收氨基糖苷类药物方面的应用。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供了一种十肽在制备听觉毛细胞保护产品中的应用。
本发明技术方案如下：
一种活性十肽，氨基酸序列SEQ ID NO.1如下：
Tyr-Ser-Gln-Leu-Glu-Asn-Glu-Phe-Asp-Arg(YSQLENEFDR)。
所述活性十肽已公开，专利号为ZL201810915407.5(申请号：201810915407.5)。
上述活性十肽作为药效成分在制备治疗耳部疾病药物中的应用。
根据本发明优选的，所述耳部疾病为因听觉毛细胞过量吸收氨基糖苷类药物所导致的耳部疾病。
上述活性十肽作为有效成分，在制备抑制听觉毛细胞过量吸收氨基糖苷类药物方面的相关保健食品中的应用。
一种减缓耳部损伤的氨基糖苷类药物，其特征在于，含有活性十肽，所述活性十肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。
有益效果
本发明首次将一含十个氨基酸残基的活性肽用于抑制听觉毛细胞对氨基糖苷类药物的过量吸收；检测后首次发现，该十肽可以有效减少听觉毛细胞对庆大霉素的吸收，进而对听觉毛细胞起保护作用，且毒副作用小，是一种很有开发前景的听力保护药物，具有广阔的市场前景。
附图说明
图1为70μg/ml活性十肽处理斑马鱼后，毛细胞照片；
图中：A为对照组；B为庆大霉素造模组；C为活性十肽处理组；方框为耳部周围的五组(O1、MI1、MI2、O2和IO4)听觉毛细胞。
图2为70μg/ml活性十肽处理斑马鱼后，毛细胞数量统计的柱状图，纵坐标表示细胞数量，单位为个；
图中：***表示p<0.001。
图3为90μg/ml活性十肽处理斑马鱼后，毛细胞照片；
图中：A为对照组；B为庆大霉素造模组；C为活性十肽处理组；方框为耳部周围的五组听觉毛细胞。
图4为90μg/ml活性十肽处理斑马鱼后，毛细胞数量统计的柱状图，纵坐标表示细胞数量，单位为个；
图中：***表示p<0.001。
图5为100μg/ml活性十肽处理斑马鱼后，毛细胞照片；
图中：A为对照组；B为庆大霉素造模组；C为活性十肽处理组；方框为耳部周围的五组听觉毛细胞。
图6为100μg/ml活性十肽处理斑马鱼后，毛细胞数量统计的柱状图，纵坐标表示细胞数量，单位为个；
图中：***表示p<0.001。
图7为100μg/ml活性十肽处理斑马鱼后，毛细胞内庆大霉素的含量照片。
具体实施方式
下面结合实施例及说明书附图对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
实施例中未注明具体条件的内容，按照常规条件进行；所用试剂或仪器未注明生成厂商的，均为普通市售产品。
试剂配制：庆大霉素标准品购自青岛生工生物科技有限公司，该标准品使用生理盐水溶解后，配制为1000M的储液。德克萨斯红染料(Texas Red,TR)购置AATYO-PRO-1染料购自赛默飞世尔科技有限公司。
胚胎培养用水组分如下：
CaCl2 0.4mM，NaCl 5mM，MgSO4 0.16mM，KCl 0.17mM，去离子水配制。
实施例1
70μg/ml活性十肽样品对斑马鱼听觉毛细胞的保护作用
实验方法
1、斑马鱼样本前处理：
健康性成熟的AB系斑马鱼按雌雄1：1的比例放入交配缸内，中间放置隔板，置于黑暗环境中，次日亮灯前抽去隔板，光照刺激使其排卵，排卵半小时后将成鱼捞出，将排卵时间控制在半小时内，以降低胚胎间发育时间的差异。收集受精卵，并对受精卵进行消毒和清洗；随后将受精卵移入干净的斑马鱼胚胎培养用水中，并加入0.2ppm亚甲基蓝，28℃下、14h光照/10h黑暗周期下，控光培养，中间每24h换1/3胚胎培养用水，并及时吸出死亡胚胎。将出生后6天的斑马鱼置于解剖镜下，选取发育正常的斑马鱼，放入6孔板中，每孔20尾，并加入适量胚胎培养用水。
2、活性十肽处理：
采用人工合成方式合成氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的活性十肽，该十肽采用刘振南所述的Fmoc固相合成法(刘振南，黄强.Fmoc固相合成法[J].广西民族学院学报,1999,5(2):110-112.)合成。
将步骤1中所述6孔板中的斑马鱼随机分成对照、庆大霉素造模及活性肽处理组，每组3个平行孔。移除6孔板中的胚胎培养水，对照组加入2ml胚胎培养水，在28℃恒温培养箱中培养1小时；庆大霉素造模组加入的2ml胚胎培养水中加入终浓度为150μM的庆大霉素，在28℃恒温培养箱中培养1h；活性十肽处理组加入的2ml胚胎培养水中首先加入70μg/ml的活性十肽，在28℃恒温培养箱中培养1小时，然后同时加入终浓度为150μM的庆大霉素和70μg/ml的活性十肽，继续在28℃恒温培养箱中培养1小时。
3、斑马鱼听觉毛细胞标记：
步骤2处理结束后，吸除6孔板中的液体，并加胚胎培养用水分别清洗各组斑马鱼。随后将终浓度为2μM的YO-PRO-1染料分别加入上述各组斑马鱼中，并在28℃条件下避光孵育20min。孵育结束后，将YO-PRO-1溶液吸除，加胚胎培养水清洗各组斑马鱼。
4、听觉毛细胞数量统计：
将上述三组斑马鱼分别置于质量浓度为0.02％的三卡因溶液中，使其麻醉。在荧光显微镜下采集显示绿色荧光的听觉毛细胞图像。根据采集图片，分别对各组斑马鱼中位于耳部周围的五组(O1、MI1、MI2、O2和IO4)听觉毛细胞进行数量统计。
上述耳部周围的五组O1、MI1、MI2、O2和IO4的听觉毛细胞已公开，参见Raible DW,Kruse GJ,Organization of the lateral line system in embryonic zebrafish[J].JComp Neurol,2000,421:189-198.
实验结果如图1、图2所示，70μg/ml活性十肽可以有效减缓庆大霉素诱导的听觉毛细胞的缺失，与庆大霉素造模组相比，具有统计学差异。上述结果证明，该浓度下的活性十肽可以在机体内部有效保护听觉毛细胞，改善氨基糖苷类抗生素诱导的耳毒性损害。
实施例2
90μg/ml活性十肽样品对斑马鱼听觉毛细胞的保护作用
斑马鱼样本前处理、斑马鱼听觉毛细胞标记与听觉毛细胞数量统计同实施例1。
活性十肽处理：
采用人工合成方式合成氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的活性十肽，该十肽采用刘振南所述的Fmoc固相合成法(刘振南，黄强.Fmoc固相合成法[J].广西民族学院学报,1999,5(2):110-112.)合成。
将6孔板中的斑马鱼随机分成对照、庆大霉素造模及活性肽处理组，每组3个平行孔。移除6孔板中的胚胎培养水，对照组加入2ml胚胎培养水，在28℃恒温培养箱中培养1小时；庆大霉素造模组加入的2ml胚胎培养水中加入终浓度为150μM的庆大霉素，在28℃恒温培养箱中培养1h；活性十肽处理组加入的2ml胚胎培养水中首先加入90μg/ml的活性十肽，在28℃恒温培养箱中培养1小时，然后同时加入终浓度为150μM的庆大霉素和90μg/ml的活性十肽，继续在28℃恒温培养箱中培养1小时。
实验结果如图3、图4所示，90μg/ml活性十肽可以有效减缓庆大霉素诱导的听觉毛细胞的缺失，与庆大霉素造模组相比，具有统计学差异。上述结果证明，该浓度下的活性十肽可以在机体内部有效保护听觉毛细胞，改善氨基糖苷类抗生素诱导的耳毒性损害。
实施例3
100μg/ml活性十肽样品对斑马鱼听觉毛细胞的保护作用
斑马鱼样本前处理、斑马鱼听觉毛细胞标记与听觉毛细胞数量统计同实施例1。
活性十肽处理：
采用人工合成方式合成氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的活性十肽，该十肽采用刘振南所述的Fmoc固相合成法(刘振南，黄强.Fmoc固相合成法[J].广西民族学院学报,1999,5(2):110-112.)合成。
将6孔板中的斑马鱼随机分成对照、庆大霉素造模及活性肽处理组，每组3个平行孔。移除6孔板中的胚胎培养水，对照组加入2ml胚胎培养水，在28℃恒温培养箱中培养1小时；庆大霉素造模组加入的2ml胚胎培养水中加入终浓度为150μM的庆大霉素，在28℃恒温培养箱中培养1h；活性十肽处理组加入的2ml胚胎培养水中首先加入100μg/ml的活性十肽，在28℃恒温培养箱中培养1小时，然后同时加入终浓度为150μM的庆大霉素和100μg/ml的活性十肽，继续在28℃恒温培养箱中培养1小时。
实验结果如图5、图6所示，100μg/ml活性十肽可以有效减缓庆大霉素诱导的听觉毛细胞的缺失，与庆大霉素造模组相比，具有统计学差异。上述结果证明，该浓度下的活性十肽可以在机体内部有效保护听觉毛细胞，改善氨基糖苷类抗生素诱导的耳毒性损害。
实施例4
100μg/ml活性十肽样品可抑制庆大霉素在听觉毛细胞中的积聚
斑马鱼样本前处理同实施例1。
活性十肽处理：
采用人工合成方式合成氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的活性十肽，该十肽采用刘振南所述的Fmoc固相合成法(刘振南，黄强.Fmoc固相合成法[J].广西民族学院学报,1999,5(2):110-112.)合成。
TR配制成2mg/ml的溶液后，将其与50mg/ml的庆大霉素溶液以22：3(体积比)的比例混合，然后避光过夜，制得德克萨斯红-庆大霉素(GTTR)共轭物。
将6孔板中的斑马鱼随机分成GTTR造模组和活性十肽处理组。移除6孔板中的胚胎培养水，GTTR造模组加入的2ml胚胎培养水中加入含终浓度为150μM庆大霉素的GTTR共轭物，并在28℃恒温培养箱中避光孵育1h；活性十肽处理组加入的2ml胚胎培养水中加入100μg/ml的活性十肽，在28℃恒温培养箱中孵育1h，然后同时加入含终浓度为150μM庆大霉素的GTTR共轭物和100μg/ml的活性十肽，并在28℃恒温培养箱中继续避光孵育1h。结束后用胚胎培养水清洗斑马鱼，并利用激光共聚焦显微镜采集呈现红色荧光的毛细胞图像。
实验结果如图7所示，GTTR造模组中，在斑马鱼残存的毛细胞中可检测到大量被红色荧光标记的庆大霉素。但是在活性十肽处理组中，毛细胞中被红色荧光标记的庆大霉素与GTTR造模组相比，明显减少。该结果表明活性十肽能够抑制庆大霉素在毛细胞中的大量积聚，进一步证实了该活性十肽的听觉毛细胞保护作用。
通过实施例1-4，本发明首次发现，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的活性十肽可抑制听觉毛细胞对庆大霉素的过量吸收，进而在此基础上对庆大霉素诱导型的药源性听觉毛细胞损伤起到保护作用。由上述实验结果得出，上述活性十肽具有以下应用前景，所述活性十肽作为药效成分在制备治疗耳部疾病药物中的应用，进一步的所述耳部疾病为因听觉毛细胞过量吸收氨基糖苷类药物所导致的耳部疾病；所述活性十肽作为有效成分，在制备抑制听觉毛细胞过量吸收氨基糖苷类药物方面的相关保健食品中的应用。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东省科学院生物研究所
齐鲁工业大学
<120> 一种活性十肽在保护听觉毛细胞方面的应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Tyr Ser Gln Leu Glu Asn Glu Phe Asp Arg
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