乳源活性肽ccl-1s在制备促睡眠产品中的应用
阅读说明：本技术 乳源活性肽ccl-1s在制备促睡眠产品中的应用 (Application of milk-derived active peptide CCL-1S in preparation of sleep-promoting product ) 是由 曹庸 梁曹雯 刘星雨 刘飞 于 2021-08-31 设计创作，主要内容包括：本发明属于促睡眠保健品领域,具体涉及乳源活性肽CCL-1S在制备促睡眠产品中的应用,本发明利用体外膜片钳技术从牛奶中分离鉴定出一种具有抑制神经细胞活性、能促进睡眠的乳源活性肽CCL-1S,该乳源活性肽具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列,分子量为934.11Da,本发明提供的促睡眠乳源活性肽安全无毒,可应用于制备促睡眠药品、促睡眠功能性食品等产品,可充分利用乳产品资源,为乳源多肽的高值化利用提供了新途径。(The invention belongs to the field of sleep-promoting health products, and particularly relates to application of milk-derived bioactive peptide CCL-1S in preparation of a sleep-promoting product, wherein the milk-derived bioactive peptide CCL-1S capable of inhibiting nerve cell activity and promoting sleep is separated and identified from milk by using an in-vitro patch clamp technology, has an amino acid sequence shown as SEQ ID NO 1 and has a molecular weight of 934.11 Da.)
技术领域
本发明属于促睡眠保健品领域，具体涉及乳源活性肽CCL-1S在制备促睡眠产品中的应用。
背景技术
失眠是一种常见的睡眠障碍，失眠患者的总睡眠时间不达标，睡眠质量不合格，且影响患者生活工作的一种亚健康状态。长期失眠容易导致工作效率低，健忘，思维能力下降，产生抑郁、焦虑、精神紧张等情绪，严重的会导致悲观厌世，形成精神病，抑郁症等。临床上常用化学合成类镇静催眠药，例如以苯二氮卓类为主的镇静促睡眠药，可治疗失眠及其他疾病引起的睡眠障碍。但此类药物在延长睡眠时间的同时会出现如头晕、乏力、困倦、注意力不集中等不同程度的副作用，并且容易产生依赖，使得并未真正起到改善睡眠质量的作用。因此，提供药效显著、副作用小、安全的改善睡眠作用的药物是医药卫生领域的一项重要任务。
牛奶具有促进睡眠的作用，睡前喝杯热牛奶更容易入睡。牛乳中含有多种生物活性多肽，但天然牛乳中活性多肽的含量较少，无法满足亚健康人们的需要。牛乳酪蛋白，是许多具有潜在生物活性物质的前体，通过蛋白酶的酶解作用，得到具有生物学功能的小肽，即乳源生物活性肽。这些小肽一般由2-20个氨基酸残基组成，能够对机体的消化系统、心血管系统、免疫系统等多方面产生积极的影响，具有调节神经系统、抗菌、抗氧化、抗高血压、免疫调节等生理活性。乳源活性肽的抗菌、抗氧化、抗高血压、免疫调节作用研究得比较多，而对乳源肽调节神经系统改善睡眠情况的研究较少。因此，挖掘更多具有调节神经系统作用的促睡眠肽对于开发安全、高效的促睡眠产品具有重要的价值。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明的首要目的是提供乳源活性肽CCL-1S在制备促睡眠产品中的应用。
本发明的第二个目的是提供一种促睡眠药品或者一种促睡眠功能性食品。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
乳源活性肽CCL-1S在制备促睡眠产品中的应用，所述乳源活性肽CCL-1S具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
上述乳源活性肽CCL-1S的氨基酸序列为：Asp-Met-Pro-Ile-Glu-Ala-Phe-Leu(DMPIQAFL)，分子量934.11，通过以乳源酪蛋白酶解物为原料，采用离心、脱盐等基础手段除杂后，利用体外膜片钳技术从牛奶中分离鉴定出一种具有抑制神经细胞动作电位发放频率、能促进睡眠的新型促睡眠乳源活性肽CCL-1S。
优选的，所述促睡眠产品包括促睡眠药品、促睡眠功能性食品。
优选的，所述促睡眠是抑制神经细胞动作电位的放电频率。
本发明还提供一种促睡眠药品，包括乳源活性肽CCL-1S，所述乳源活性肽CCL-1S具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
优选的，药物还包括药学上可接受的载体和/或辅料。
更优选的，所述促睡眠药品的剂型包括口服液、冲剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂、丸剂、膏剂和注射剂。
本发明还提供一种促睡眠功能性食品，包括乳源活性肽CCL-1S，所述乳源活性肽CCL-1S具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
优选的，所述功能性食品还包括食品上可接受的载体和/或辅料。
更优选的，所述促睡眠功能性食品的形式包括饮料、糖果、糕点、面条、肉制品。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明利用体外膜片钳技术从牛奶中分离鉴定出一种具有抑制神经细胞活性、能促进睡眠的乳源活性肽CCL-1S，该乳源活性肽具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，分子量为934.11Da，本发明提供的促睡眠乳源活性肽安全无毒，可应用于制备促睡眠药品、促睡眠功能性食品等产品，可充分利用乳产品资源，为乳源多肽的高值化利用提供了新途径。
附图说明
图1a为制备液相二次分离分段接样图，图1b为制备液相二次分离样品AP抑制率；图1c为制备液相二次分离样品Vm的变化率；
图2为样品分析液相图；
图3左侧为生理条件下诱发的VLPO的AP，图3右侧显示单体1对VLPO神经元诱发的AP抑制；
图4为CCL-1S氨基酸测序仪图谱。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
材料：广州绿萃生物科技有限公司生产的乳源酪蛋白酶解物。
试剂参见表1。
表1
实施例1睡眠肽的分离
一、原料预处理：将公司乳源酪蛋白酶解物原料经旋转蒸发去除乙醇，得到牛乳多肽饱和水样，采用真空喷雾干燥，得到多肽原料。
二、体外促睡眠活性的测定：按照申请号为201510915215.0，名称为“利用膜片钳技术筛选乳源中促睡眠肽粗提物的方法”的专利方法进行体外促睡眠活性的测定，运用膜片钳技术，制作下丘脑切片，将切片放置于循环灌流系统，制备微电极，将微电极与下丘脑切片的VLPO神经元进行封接，从而形成常规全细胞模式。首先记录一段自发放电作为实验对照，然后灌流含牛乳多肽的灌流液，以观察神经元放电形式的变化，通过评价Vm的变化率与去极化电流诱发AP的个数评估VLPO神经元兴奋性抑制率的影响，从而分析牛乳多肽的体外促睡眠活性。
三、C18柱一次分离
将牛乳多肽粉末(即多肽原料，含有大量牛乳促睡眠肽)用超纯水配置成200mg/ml的溶液，使用注射器抽取并过0.22um滤膜后，借助制备型高效液相色谱(LC-8A,Shimadzu)对牛乳促睡眠肽进行初步分离。
色谱条件：色谱柱为自装玻璃柱[20mm×450mm，C18填料(10μm,MachereyNagel,France)]；流动相：A泵为超纯水(含0.1％TFA)，B泵为乙腈(含0.1％TFA)；流速：10mL/min；进样量：5mL；检测波长：214nm，280nm；洗脱条件：10％-20％(0.01-30min)，20％-35％(30-90min)，35％-52.5％(90-110min)，52.5％-90％(110-125min)。根据初步分离情况，将其分为六段，命名为P1、P2、P3、P4、P5、P6，60℃旋转浓缩冻干后备用。
结果：原料在制备液相中分离检测的图谱如图1a。多肽常用检测波长214nm下，根据出峰时间及峰形相似度，分为6段进行接样。将这6个组分分别收集，尽快进行浓缩及真空冻干，减少多肽降解。随后测量其体外促睡眠活性，结果如图1b所示。因P5、P6样品不溶于脑脊液，故分析P1-4组分发现P3组分抑制VLPO神经元的兴奋性效果最好，其他组分抑制效果并不明显，故选择P3组分进行下一步的分离和分析。
四、C18柱二次分离
采用膜片钳模型对P3进行初步的活性评价，根据活性峰，将P3样品分为三段。
色谱条件：色谱柱为Welch C18柱子(4.6mm×250mm,5μm,Ultimate)；流动相：A泵为超纯水(含0.1％TFA)，B泵为乙腈(含0.1％TFA)；进样量：20μL；流速：1mL/min；检测波长：214nm，280nm；洗脱条件：10％-20％(0.01-10min)，20％-30％(10-40min)，30％-90％(40-48min)。
结果：根据以上研究发现P3具有较好的促睡眠活性，将P3组分进一步分离为前中后三段，继续评价体外促睡眠活性。发现经过进一步分离P3组分前段具有更好的促睡眠活性(图1c)。
五、HCLP的第三次分离
采用膜片钳模型P3的第二部分进行初步的活性评价，将其分为4个单峰。
色谱条件：色谱柱为Welch C18柱子(4.6mm×250mm,5μm,Ultimate)；流动相：A泵为超纯水(含0.1％TFA)，B泵为乙腈(含0.1％TFA)；进样量：20μL；流速：1mL/min；检测波长：214nm，280nm；洗脱条件：10％-20％(0.01-10min)，20％-30％(10-40min)，30％-90％(40-48min)。
结果：对P3中段进行探索，发现单体P1的Vm变化率为11.46±4.68％，AP的抑制率为7.5±6.25％，具有良好的促睡眠活性。
表2单体1对VLPO神经元兴奋性的影响(n＝9)
注：与正常对照组相比较，*代表p<0.05,**代表p<0.01
实施例2睡眠肽结构的确定
运用氨基酸测序仪(PPSQ)测定肽的氨基酸组成，PPSQ可测出多肽的N端绝对序列。根据氨基酸测序仪分析图(图4)，通过比对Uniprot数据库中牛乳酪蛋白蛋白序列，确定多肽的序列为Asp-Met-Pro-Ile-Glu-Ala-Phe-Leu(DMPIQAFL)，来源于牛乳酪蛋白中的β酪蛋白，这是首次从食物源天然产物中分离出此序列促睡眠肽。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 乳源活性肽CCL-1S在制备促睡眠产品中的应用
<130> ZM211206CS
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
Asp Met Pro Ile Gln Ala Phe Leu
1 5
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