具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明进一步说明，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，这些也应视为属于本发明的保护范围。

ND和HFD饲料均购自于南京依诺佳饲料有限公司。ND的成分包括：51.8％玉米淀粉(w/w)、24.7％酪蛋白(w/w)、12.1％蔗糖(w/w)、5.1％猪油(w/w)、4.1％矿物质混合物(w/w)、2.1％维生素混合物(w/w)、0.1％DL-蛋氨酸(w/w)。HFD的成分包括：90％基础日粮、2％的胆固醇(w/w)、0.2％的丙基硫氧嘧啶(w/w)、0.3％的胆酸钠(w/w)、7.5％的猪油(w/w)混合。

实施例1三种多肽对高脂血症小鼠脂质水平的调节作用

1、实验动物

所有的程序都是按照《江苏省中医院实验动物伦理审查办法》进行的，动物伦理批准证书编号为2019-DWNL-002。4-6周龄C57BL/6J雄性小鼠135只，购自斯贝福(北京)生物科技有限公司。

2、建立高脂模型

所有小鼠在室温(22±2℃)下维持12/12h光/暗循环，自由取水，适应性喂养5天后，所有小鼠分为两组，正常组(15只)和模型组(120只)置于同一房间，温度22±2℃，相对湿度40％-60％，分笼饲养，每笼5只，自由进食及饮水，每2天更换新粮，定期更换垫料、清洗鼠笼等，每周测量一次小鼠体重。6周后，分别从模型组和正常组中随机抽取3只小鼠，并在采血前禁食12h，通过检测小鼠血清中TC、TG、HDL-C以及LDL-C的含量，确定高脂血症模型是否建立。

3、动物实验分组

三种多肽LQPE(Leu-Gln-Pro-Glu)，VLPVPQ(Val-Leu-Pro-Val-Pro-Gln)，VAPFPE(Val-Ala-Pro-Phe-Pro-Glu)来源于牛乳源酪蛋白，纯度大于95％，由上海波泰生物科技有限公司合成。从正常组和模型组中分别选取10只和110只生长状态良好的小鼠。模型组小鼠被随机分为11组(n＝10)：高脂饮食组(HFD)+生理盐水(模型组，model)；HFD+10mg/kg bodyweight洛伐他汀；HFD+20mg/kg bw LQPE(LQPE低剂量组，L-LQPE)；HFD+40mg/kg bw LQPE(LQPE中剂量组，M-LQPE)；HFD+80mg/kg bw LQPE(LQPE高剂量组，H-LQPE)；HFD+20mg/kg bwVLPVPQ(VLPVPQ低剂量组，L-VLPVPQ)；HFD+40mg/kg bw VLPVPQ(VLPVPQ中剂量组，M-VLPVPQ)；HFD+80mg/kg bw VLPVPQ(VLPVPQ高剂量组，H-VLPVPQ)；HFD+20mg/kg bw VAPFPE(VAPFPE低剂量组，L-VAPFPE)；HFD+40mg/kg bw VAPFPE(VAPFPE中剂量组，M-VAPFPE)；HFD+80mg/kg bw VAPFPE(VAPFPE高剂量组，H-VAPFPE)。

4、灌胃方案

正常对照组给予正常饮食(ND)，其余各实验组给予HFD，ND和HFD饲料均购自于南京依诺佳饲料有限公司。治疗组给予相应的试验多肽LQPE、VLPVPQ、VAPFPE与洛伐他丁，正常组和模型组给予同等剂量的生理盐水，每天上午同一时间分别灌胃生理盐水、LQPE、VLPVPQ、VAPFPE和洛伐他汀，持续8周。每周记录一次体重，根据体重调整药物剂量。

5、动物处理及检测

5.1脏器指数

于实验结束前3天收集小鼠粪便，迅速放置于-80℃保存。实验结束前所有老鼠禁食12h，眼眶采血后，立即取出肝脏、肾脏、心脏、肾周脂肪、睾丸、附睾脂肪，并用冰冷的生理盐水清洗各脏器，用滤纸吸干水分，称重计算脏器指数，并迅速将肝脏和小肠组织放置-80℃保存便于后续检测。

脏器指数(％)＝脏器重量(g)/动物重量(g)×100 (1)

5.2血脂指标的检测

取血样于EP管中，3000×g，4℃，离心15min，收集血清。采用全自动生化分析仪测定血清中TG、TC、LDL-C、HDL-C的含量。

5.3肝脏脂代谢相关指标的检测

将冷冻的小鼠肝脏在生理盐水中均质，3000×g，4℃，离心15min，收集上清。采用全自动生化分析仪测定TG、TC、LDL-C和HDL-C的含量。

5.4肝微粒体制备

称取0.5g小鼠肝脏组织，加入1mL预冷Tris-HCl-蔗糖缓冲液(浓度0.1M，pH 7.4)后用组织匀浆器制成匀浆，将组织匀浆液在10000×g，4℃，离心10min，将样本表面浮沫吸取，其余上清转移入冰浴的超高速离心管中，加入预冷Tris-HCl-蔗糖缓冲液稀释至8.333mL后在100000×g，4℃，离心60min，待离心结束样本取出后立即放入冰中，弃上清，并轻轻沿壁加入预冷Tris-HCl-蔗糖缓冲液清洗表面并吸去，加入0.1mL预冷30％Tris-HCl-甘油缓冲液(pH7.4，20％甘油)重悬即为肝微粒体样本，分装保存于-80℃环境。

5.5肝脏HE染色

清洗肝脏并干燥，取肝脏右叶三份组织标本，用手术刀切取1cm³，将其快速放入装有甲醛固定剂的玻璃小瓶中，冷却至4℃备用。将肝脏组织块取出，经固定后，常规石蜡包埋，4μm切片；切片后用二甲苯脱蜡，依次用二甲苯洗5min、再更换新的二甲苯洗5min、100％乙醇洗2min、95％的乙醇洗1min、80％乙醇洗1min以及75％乙醇洗1min，最后用蒸馏水水洗2min即可；紧接着用苏木素染色5min，自来水冲洗至表面无残留；用盐酸乙醇分化30s后，自来水浸泡15min；取出放置于伊红液中染色2min；最终进行常规脱水和封片，脱水的步骤依次为95％乙醇脱色1min、再更换新的95％乙醇脱色1min、100％乙醇脱色1min、再更换新的100％乙醇(II)脱色1min、二甲苯石碳酸脱色1min、二甲苯(I)脱色1min以及二甲苯(II)脱色1min，最后用中性树脂封固。进行肝脏组织病理学检查。

6、结果分析

6.1高脂血症模型建立分析

由图1可知，小鼠进行持续6周的高脂饲料喂养后，相比于正常组，模型组小鼠血清TC、TG和LDL-C均有显著性的升高(P＜0.05)，证明高脂饲料引起了小鼠的脂质代谢紊乱，高胆固醇高脂血症模型已成功建立。

6.2各组小鼠的脏器指数

结果见表1，模型组与正常组相比，肝脏、睾丸、附睾脂肪系数均有显著性升高(P＜0.05)；与模型组相比，灌胃洛伐他汀和三种多肽均使睾丸和附睾脂肪系数降低，其中VAPFPE高剂量组与LQPE中剂量组的睾丸系数相比模型组显著性降低(P＜0.05)，除VLPVPQ高剂量组，其余各处理组的附睾脂肪系数显著降低(P＜0.05)，三种多肽可在一定程度上减少脂质在小鼠脏器中的沉积。

表1各组小鼠脏器指数

6.3血清与肝脏中脂质水平

从图2、3可以看出，相比于正常组，模型组小鼠血清TG、TC、LDL-C、HDL-C以及肝脏中TC和LDL-C均有显著性的升高。对比图1中的结果可知，模型组小鼠在6周的高脂饮食后HDL-C与正常组相比无显著性差异，而在第14周实验结束后，模型组小鼠在连续的高脂饲料喂养后，血脂代谢异常紊乱，HDL-C可能出现了趋炎性增高，形成了混合型高胆固醇高脂血症模型。

图2显示，经过8周的灌胃后，与模型组相比，VAPFPE中剂量和高剂量组均能显著性降低血清中TC含量(P＜0.05)，LQPE和VLPVPQ则没有；三种多肽均能降低血清中TG的含量(P＜0.05)，但VAPFPE降低效果最好；除LQPE低剂量组，其余各处理组对血清中LDL-C均有降低作用，但VAPFPE效果最好(P＜0.05)。图3显示，VAPFPE高剂量组显著降低了高脂血症小鼠肝脏中TC及LDL-C的含量，其它两种多肽则没有效果；各实验组的肝脏TG含量均没有显著性差异(P＞0.05)。

总之，相对于LQPE和VLPVPQ，VAPFPE具有更好的降低高脂血症模型小鼠血清及肝脏TC，TG，LDL-C水平。

6.4各组小鼠HE染色结果

由图4可以看出，小鼠肝脏HE染色后，正常对照组肝组织切片结构清晰，细胞与细胞之间有较明显的分界，肝细胞索呈四周发散排列，轮廓清晰，细胞核居中，细胞质较多。与正常组相比，模型组肝细胞结构破坏明显，细胞肿胀，可见大量白色脂滴，细胞核多发生偏移，无完整的肝细胞索。与高脂模型组相比，VLPVPQ高剂量组脂滴明显减少，VAPFPE中剂量组和VAPFPE高剂量组部分细胞恢复正常，细胞界限比较清晰，脂滴明显减少，细胞整体变性明显改善，相比于洛伐他汀，VAPFPE对肝脏组织结构以及肝细胞的改善更为明显。洛伐他汀作为市面上一种常见的他汀类降脂药，长时间服用可能存在一些肝肾功能损伤等副作用，而本实验用到的乳源肽VAPFPE不但对高脂饮食引起的肝脏组织病变有较好的改善作用，并且没有明显的毒副作用。

实施例2三种多肽对高脂血症小鼠肠道菌群的调节

1、DNA提取/质量控制

使用DNA提取试剂盒从小鼠粪便中提取DNA，使用dsDNA HS Assay Kit检测DNA浓度。

2、PCR扩增及文库构建

以20-30ng DNA为模板，使用金唯智设计的一系列PCR引物扩增原核生物。采用包含“CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT”序列的上游引物和包含“GGACTACNVGGGTWTCTAATCC”序列的下游引物扩增V3和V4区。另外，通过PCR向16SrDNA的PCR产物末端加上带有Index的接头，以便进行NGS测序。

表2 PCR扩增体系

PCR反应参数：预变性参数94℃，3min，变性参数94℃，5s，退火参数57℃，90s，延伸72℃，10s，终延伸参数72v，5min，共进行24个循环。

PCR扩增结果鉴定：PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。

3、上机测序

通过酶标仪检测文库浓度。将文库定量到10nM，按Illumina MiSeq/NovaSeq测序仪使用说明书进行双端测序，由仪器自带的相关软件读取序列信息。

4、数据分析

双端测序得到的正反向reads首先进行两两拼接，过滤拼接结果中含有N的序列，保留序列长度大于200bD的序列。经过质量过滤，去除嵌合体序列，最终得到的序列用于OTU聚类，使用VSEARCH进行序列聚类(序列相似性设为97％)，比对的16S rRNA参考数据库是Silva132。然后利用RDP classifier (Ribosomal Database Program)贝叶斯算法对OTU的代表性序列进行物种分类学分析，并在不同物种分类水平下统计每个样本的群落组成。

5、实验数据处理与分析

实验数据用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析，单因素方差分析检验组间显著性差异，数据用mean±SD表示，不同字母表示在P＜0.05水平存在显著性差异。

6、结果及分析

6.1各实验组在小鼠肠道菌群门分类水平上的调节

图5展示了各实验组小鼠肠道菌群在门分类水平上物种丰度的变化情况。从图中可以看出肠道微生物主要分属于厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)以及放线菌门(Actinobacteria)。与正常组相比，高脂饮食引起了小鼠肠道中厚壁菌门和变线菌门相对丰度增加，拟杆菌门的相对丰度降低，厚壁菌门(Firmicutes)增多以及拟杆菌门(Bacteroidetes)减少与脂质代谢异常和肥胖密切相关，变形菌门(Proteobacteria)中包括很多病原菌，如大肠杆菌、沙门氏菌、霍乱弧菌、幽门螺杆菌等种类，变形菌门(Proteobacteria)是肠道稳态失调的标志物之一，其丰度的升高通常与宿主的代谢紊乱、炎症反应有关。分别给予VAPFPE、VLPVPQ、LQPE三种多肽干预后，其肠道微生物的丰度发生了不同程度的变化，相比于模型组，VAPFPE高剂量组中厚壁菌门以及变形菌门相对丰度降低，拟杆菌门相对丰度增加；LQPE中剂量组中厚壁菌门相对丰度降低，拟杆菌门相对丰度增加；VLPVPQ中剂量组中变形菌门相对丰度减小。

由图6可知，与正常组相比，模型组小鼠肠道中乳杆菌属(Lactobacillus)、别样杆菌属(AlistiDes)、梭杆菌属(Clostridium_sensu_stricto_1)以及毛螺菌属(Lachnospiraceae_NK4A136_group)相对丰度增加。

有研究报导，别样杆菌属(Alistipes)增多会破坏肠道内血清素激活系统的平衡，并且可能增加肠道炎症的发生几率；Clostridium_sensu_stricto_1隶属于梭杆菌科(Clostridiaceae)，梭杆菌科中包含很多致病菌。有研究显示，相比正常人群，肠道中毛螺菌科(Lachnospiraceae)相对丰度增加可能会引起体内的糖代谢紊乱。相比模型组，LQPE低剂量组、VLPVPQ低剂量组、VLPVPQ高剂量组和VAPFPE均降低了肠道中别样杆菌属(Alistipes)的相对丰度，LQPE中剂量组、VAPFPE和VLPVPQ均降低了梭杆菌属Clostridium_sensu_stricto_1的相对丰度，VAPFPE高剂量组和LQPE高剂量组增加了小鼠肠道中瘤胃球菌属(Ruminococcaceae_UCG-014)的相对丰度，LQPE中剂量组、LQPE高剂量组、VLPVPQ低剂量组和VLPVPQ高剂量组显著增加了肠道中Ruminococcaceae_UCG-013的相对丰度，LQPE低剂量组和高剂量组增加了肠道中的Ruminococcaceae_UCG-Unclassified的相对丰度。瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)中较多细菌能够将初级胆汁酸转化为次级胆汁酸，与胆固醇的代谢密切相关。

由图7可知，VAPFPE中剂量组、LQPE低剂量组和VLPVPQ中剂量组显著增加了小鼠肠道中丹毒丝菌纲(Erysipelotrichia)、丹毒丝菌目(Erysipelotrichales)、丹毒丝菌科(ErysiDelotrichaceae)以及苏黎世杆菌属(Turicibacter)的相对丰度(P＜0.05)，据报导Erysipelotrichales与Turicibacter相对丰度显著降低，小鼠结肠炎的概率增加。VAPFPE中剂量组和LQPE低剂量组显著增加了粪栖杆菌属(Faecalibaculum)的相对丰度(P＜0.05)，Faecalibaculum是一类短链脂肪酸(SCFAs)产生菌，维持肠壁屏障的完整性并防止肠道发炎。此外，VAPFPE高剂量组使小鼠肠道中的双歧杆菌目(Bifidobacteriales)、双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)相对丰度显著增加(P＜0.05)，双歧杆菌是健康肠道的优势菌，具有胆盐水解酶活力，可通过同化吸收和菌体吸附等多种机制有效清除肠道中的胆固醇，降低血清胆固醇。综上，VAPFPE可调节高脂血症小鼠肠道菌群，促进有益于降低体内胆固醇含量的菌群增加。

实施例3 VAPFPE对小鼠胆固醇代谢相关基因表达水平的影响

通过对实施例1和实施例2的实验可以发现，在三种多肽中，VAPFPE可以显著的降低高脂血症小鼠体内TC，TG及LDL-C的含量，明显降低了高脂血症小鼠的肝脏脂肪空泡面积，减少了肝脏脂肪的蓄积，并可调节高脂血症小鼠肠道菌群紊乱，促进有益于降低体内胆固醇含量的菌群，如双歧杆菌增加，而另外两种多肽LQPE，VLPVPQ改善高脂血症小鼠脂质水平的效果不显著，且都没有增加肠道菌群双歧杆菌的数量。因此，

实施例4通过Western blot研究VAPFPE对小鼠脂质代谢的调控机制

1、组织总蛋白提取

取出-80℃保存的组织(肝脏和肠道)，迅速剪取肝脏和肠道组织样本各0.2g，分部放入置于冰上的匀浆器内，每块组织加入含有1％PMSF的RIPA裂解液0.4mL，冰上匀浆至无明显的组织残渣，其后冰上裂解1.5h，13000×g，4℃，离心30min，吸取上清液，于Nano-100测定蛋白含量，用RIPA裂解液将蛋白统一成相同浓度，加入SDS蛋白上样缓冲液，100℃变性8min，迅速置于冰上冷却，Western blot使用前离心。

2、Western blot法检测蛋白表达

按照目标蛋白的分子量配置不同浓度的SDS凝胶，每孔蛋白上样量为120μg，电泳条件为浓缩胶恒压75V，分离胶恒压135V，电泳时间约为2h。电泳结束后，剥离玻板，去除浓缩胶，按照所需的蛋白分子量裁剪合适的分离胶胶块，使用半干转膜法转膜。具体步骤如下：裁出合适的分离胶，按照从负极到正极，滤纸-胶-膜-滤纸的顺序铺好转膜“三明治”结构，小心赶去气泡，按照膜面积(cm2)乘以系数1.2(mA)计算电流，恒流转膜60～90min，将蛋白转移到PVDF膜上。全湿转膜法：裁出合适的分离胶，按照从负极到正极滤纸-胶-膜-滤纸的顺序铺好转膜“三明治”结构，夹紧架子，置入充满转膜液的转膜槽中，将转膜槽置于冰浴中，恒流300mA转膜2.5～4h；待转膜完成后，PVDF膜用浓度3％的BSA，4℃摇床上封闭2h，弃封闭液，PVDF膜用PBST清洗3次，每次10min；加入合适浓度的一抗，4℃摇床孵育过夜，隔天回收一抗，用PBST清洗3次，每次10min；加入用PBST稀释好的二抗，4℃恒温摇床孵育2h，孵育结束后弃二抗，用PBST清洗条带3次，每次10min；按比例配制新鲜的ECL发光液滴加于待检的PVDF膜上，在凝胶成像分析系统中扫膜成像，并分析Western Blot结果。

3、量化与统计学分析

量化使用imageJ软件计算灰度值，目的基因的蛋白表达量即为目的蛋白灰度值与内参灰度值的比值。

4、结果与分析

4.1VAPFPE对小鼠肝脏中胆固醇代谢途径中相关蛋白表达水平的影响

结果见图8，高脂血症模型组肝脏X受体α(LXRα)表达水平升高，LXRα在脂肪代谢中发挥重要作用，其靶基因包括胆汁酸合成、脂肪酸合成及胆固醇排出的相关酶类，说明高脂饮食影响小鼠脂质代谢，VAPFPE可使LXRα恢复至正常水平，改善血脂代谢；高脂血症模型组胆固醇7α羟化酶(CYP7A1)表达上升，VAPFPE组可使CYP7A1表达量相对于模型组恢复正常水平，也说明VAPFPE可调节肝脏的胆汁酸代谢；高脂血症模型组肝脏低密度脂蛋白受体(LDL-R)的蛋白表达降低，血液中LDL-C积累，VAPFPE组可促进LDL-C从血液中运送到肝脏重新参与代谢，从而降低血液中LDL-C水平。

4.2VAPFPE对小鼠小肠中胆固醇代谢途径中相关蛋白表达水平的影响

结果见图9，与模型组相比，VAPFPE处理组能显著提高LXRα的蛋白表达，下调小肠中肝细胞核因子4α(HNF4α)、尼曼-匹克C1型类似蛋白1(NPC1L1)的蛋白表达，减少了小肠上皮细胞对胆固醇的吸收；与模型组相比，VAPFPE处理组降低乙酰辅酶A乙酰转移酶2(ACAT2)的蛋白表达量，减少肠道中胆固醇酯的形成；与模型组相比，VAPFPE处理组能显著上调小肠中三磷酸腺苷结合转运体A1(ABCA1)、ATP转运蛋白G家族成员5(ABCG5)/ATP转运蛋白G家族成员(ABCG8)的蛋白表达量，从而促进了肠道中胆固醇的排泄。

由此可见，VAPFPE能通过调控肠道及肝脏脂质代谢相关靶向基因的表达，减少肠道对胆固醇的吸收和胆固醇酯的形成，促进肠道胆固醇的外排，调节肝脏LDL-C的逆转运及胆汁酸代谢，减少血液中TC、TL及LDL-C的含量，从而缓解高脂血症。

序列表

<110> 南京师范大学

<120> 多肽VAPFPE在改善血脂代谢并调节肠道菌群紊乱中的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 4

<212> PRT

<213> LQPE(Artificial Sequence)

<400> 2

Leu Gln Pro Glu

1

<210> 1

<211> 6

<212> PRT

<213> VLPVPQ(Artificial Sequence)

<400> 1

Val Leu Pro Val Pro Gln

1 5

<210> 3

<211> 6

<212> PRT

<213> VAPFPE(Artificial Sequence)

<400> 3

Val Ala Pro Phe Pro Glu

1 5