阅读说明：本技术 用于抑制细胞粘附至rgd结合位点或引导诊断剂或治疗剂至 rgd结合位点的方法 (Methods for inhibiting cell adhesion to RGD binding sites or for directing diagnostic or therapeutic agents to RGD binding sites ) 是由 M·J·麦克尔 J·帕克 于 2010-11-10 设计创作，主要内容包括：本发明涉及用于抑制细胞粘附至RGD结合位点或引导诊断剂或治疗剂至RGD结合位点的组合物和方法。本发明公开了包括R-G-磺基丙氨酸(即R-G-NH-CH(CH<Sub>2</Sub>-SO<Sub>3</Sub>H)COOH或Arg-Gly-NH-CH(CH<Sub>2</Sub>-SO<Sub>3</Sub>H)COOH)和其衍生物(包括药学上可接受的盐、水合物、立体异构体、多聚体、环状形式、线性形式、药物缀合物、前药及其衍生物)的化合物。还公开了制备和使用这种化合物的方法,包括在人或动物受试者中抑制细胞粘附到RGD结合位点上或将其它诊断剂或治疗剂递送到RGD结合位点的方法。(The present invention relates to compositions and methods for inhibiting cell adhesion to RGD binding sites or directing diagnostic or therapeutic agents to RGD binding sites. The present invention discloses compositions comprising R-G-cysteic acid (i.e., R-G-NH-CH (CH) 2 ‑SO 3 H) COOH or Arg-Gly-NH-CH (CH) 2 ‑SO 3 H) COOH) and its derivatives (including pharmaceutically acceptable salts, hydrates, stereoisomers, and polyacids)Mer, cyclic form, linear form, drug conjugate, prodrug, and derivatives thereof). Also disclosed are methods of making and using such compounds, including methods of inhibiting cell adhesion to RGD binding sites or delivering other diagnostic or therapeutic agents to RGD binding sites in a human or animal subject.)

用于抑制细胞粘附至RGD结合位点或引导诊断剂或治疗剂至 RGD结合位点的方法

本申请是国际申请日为2010年11月10日的国际申请PCT/US2010/056277进入中国、申请号为201080061074.6的题为“用于抑制细胞粘附至RGD结合位点或引导诊断剂或治疗剂至RGD结合位点的组合物和方法”的发明专利申请的分案申请。

相关申请

根据35 U.S.C.119(e)，本申请要求2009年11月10日提交的题名为Compositions AndMethods For Inhibiting Cellular Adhesion To RGD Binding Sites(用于抑制细胞粘附至RGD结合位点的组合物和方法)的美国临时专利申请顺序号61/259,748的优先权，其完整公开内容通过引用明确结合到本文中。

技术领域

本发明总的来说涉及化学和医学领域，更具体地讲涉及可用于抑制细胞粘附至Arg-Gly-Asp(“RGD”三肽)结合位点的组合物和方法以及以下病症的相关治疗：例如炎症、伤口愈合、防止瘢痕形成、血栓形成、癌症转移和肿瘤、增殖性或非增殖性糖尿病视网膜病、玻璃体液液化、诱导玻璃体视网膜后部脱离(PVD)、玻璃体视网膜疾病的发病机制，例如飘浮物、特发性黄斑裂孔、玻璃体黄斑牵引、年龄相关性黄斑变性、湿性黄斑变性、脉络膜新生血管形成、玻璃体视网膜手术、静脉闭塞、角膜新生血管形成、缺血性视神经、虹膜发红(rubiosis iridis)和青光眼手术中防止瘢痕形成。

背景技术

RGD三肽序列存在于许多蛋白质中，其中其在细胞粘附中发挥作用。其中存在RGD三肽序列的蛋白质的实例包括胶原、纤连蛋白、玻连蛋白、冯维勒布兰德因子(VWF)、某些解联蛋白和某些网柄菌凝素。

整联蛋白是异二聚体细胞表面受体，其通过与具有暴露的RGD序列的配体结合而介导细胞与胞外基质(ECM)间的粘附。认为正常的整联蛋白-RGD结合在参与细胞生长、迁移和存活的基因表达中起作用。这种细胞生长、迁移和存活的错误调节可导致许多疾病状态，包括血栓形成、炎症和癌症。因此，作为细胞粘附蛋白潜在模拟物研究了RGD肽，并针对其与整联蛋白结合的能力、针对治疗目的(例如抑制细胞凋亡、血管生成、肿瘤发生)、针对以其多聚体形式作为内部放射治疗药以及癌症成像剂的用途及其携带抗癌药物的能力进行了研究。

在眼中，整联蛋白影响包括眼发育、细胞迁移、愈合在内的许多过程和一些病理过程。整联蛋白还可在眼组织中介导炎症和血栓形成。另据报道，在动物模型中，玻璃体内注射RGD 肽引起玻璃体视网膜后部脱离，因此，可用于治疗某些视网膜病症和/或在玻璃体切除术中促进玻璃体的摘除。[参见Olivera，L.B.等，RGD Peptide-Assisted Vitrectomy toFacilitate Induction of a Posterior Vitreous Detachment：a New Principle inPharmacological Vitreolysis(有利于诱导玻璃体后部脱离的RGD肽辅助的玻璃体切除术：药理学玻璃体溶解的新原理)；Current Eye Research(8)：333-40(2002年12月25日)]。

发明内容

本发明提供包括R-G-磺基丙氨酸(即R-G-NH-CH(CH₂-SO₃H)COOH或 Arg-Gly-NH-CH(CH₂-SO₃H)COOH)及其衍生物(包括药学上可接受的盐、水合物、立体异构体、多聚体、环状形式、线性形式、药物缀合物、前药及其衍生物)的新的化合物。

本发明还提供用于在人或动物受试者中抑制细胞粘附至RGD结合位点或将其它诊断剂或治疗剂递送到RGD结合位点的组合物，和用于通过将有效量的包含R-G-磺基丙氨酸肽或其衍生物(包括药学上可接受的盐、水合物、立体异构体、多聚体、环状形式、线性形式、药物缀合物、前药及其衍生物)的组合物给予受试者，而在人或动物受试者中抑制细胞粘附至 RGD结合位点或将其它诊断剂或治疗剂递送到RGD结合位点的方法。本发明的R-G-磺基丙氨酸肽的具体实例包括Arg-Gly-NH-CH(CH₂-SO₃H)COOH的线性形式(在本文称为化合物1的实例) 和Arg-Gly-NH-CH(CH₂-SO₃H)COOH)的环状形式(在本文称为化合物2的实例)。

本发明的R-G-磺基丙氨酸衍生物的通式包括但不限于具有下列通式I-VII的化合物：

通式I：

其中X选自：H、C₁-C₆烷基、Ph或SO₃H，Y＝OH或NH₂。

通式II：

其中X选自：H、C₁-C₆烷基、Ph或SO₃H。

通式III：

其中X选自：H、C₁-C₆烷基、Ph或SO₃H，其中Z选自：H或SO₃H。

通式IV：

其中X选自：H、C₁-C₆烷基、Ph或SO₃H；Y选自OH或NH₂。

通式V：

其中X选自：H、C₁-C₆烷基、Ph或SO₃H。

通式VI：

其中X选自：H、C₁-C₆烷基、Ph或SO₃H。

通式VII：

X₁-R-G-磺基丙氨酸-X

其中X和X₁选自：环状或线性的-Phe-Val-Ala、-Phe-Leu-Ala、-Phe-Val-Gly、-Phe-Leu-Gly、 -Phe-Pro-Gly、-Phe-Pro-Ala、-Phe-Val或以下氨基酸的D-异构体或L-异构体的任何组合的任何盐：Arg、Gly、磺基丙氨酸、Phe、Val、Ala、Leu、Pro、Thr。

通式VII的环状形式的实例包括但不必限于：

其中X’选自：H、C₁-C₆烷基、Ph或SO₃H；Z选自H或Me；Y选自OH、NH₂。

磺酸是强于相应羧酸的酸类。磺酸基团的这种较高极性导致较强的分子间结合。例如， R-G-磺基丙氨酸(其具有更极化的O-H键)可与整联蛋白结合位点中蛋白质的酰胺基团形成比 R-G-天冬氨酸(RGD肽)(其具有相对较不极化的O-H键)强的氢键和/或与整联蛋白结合位点中络合的金属离子具有较强的相互作用。

如本文其它部分更详细描述的一样，合成了通式VII的一个具体实例甘氨酰(Glycinyl)- 精氨酰-甘氨酰-磺基丙氨酸-苏氨酰-脯氨酸-COOH(GRG磺基丙氨酸TP；下文称为化合物1)，并在动物中进行了测试，发现其通过抑制整联蛋白-胞外基质(ECM)相互作用，而有效地诱导视网膜表面上的玻璃体后部脱离(PVD)。另如本文其它部分更详细描述的一样，使用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，在伤口愈合模型中对化合物1进行了试验，并且表明其与环状-RGD肽抑制(40％)相比，在12小时内抑制细胞粘附达74％。这些研究表明和证实了甘氨酰-精氨酰-甘氨酰-磺基丙氨酸-苏氨酰-脯氨酸-COOH甚至可比RGD肽本身更强地与整联蛋白结合的基本原理。

可呈L-形式或D-形式的R-G-磺基丙氨酸肽序列是整联蛋白-ECM相互作用的竞争性抑制剂。R-G-磺基丙氨酸肽序列可以是蛋白酶抗性衍生物或环状衍生物或前药衍生物或与药物递送系统有关或为单克隆抗体。

本发明的组合物可用于抑制血管生成，其可用于治疗炎症、伤口愈合、血栓形成、癌症转移和肿瘤。其它有益的应用可存在于眼科学中，包括增殖性或非增殖性糖尿病视网膜病、玻璃体液化、诱导玻璃体视网膜后部脱离(PVD)、玻璃体视网膜疾病的发病机制，例如特发性黄斑裂孔、玻璃体黄斑牵引、年龄相关性黄斑变性、湿性黄斑变性、脉络膜新生血管形成、玻璃体视网膜手术、静脉闭塞和青光眼手术中防止瘢痕形成。再者，本发明的多聚体组合物和/或放射性标记的组合物可用作检测肿瘤的诊断/成像剂和***的放射治疗剂及因其肿瘤定向性质而用作抗癌药物载体。

掺入R-G-磺基丙氨酸肽的生物材料还可为细胞长期存活和生长及为应用于组织工程学和再生医学的活组织工程提供合成的粘性微环境。通过其结合整联蛋白粘附受体的性质，R-G- 磺基丙氨酸肽当与生物材料或支架连接时，可提供促粘附信号。基于R-G-磺基丙氨酸的材料介导细胞粘附、细胞扩散和迁移。此外，整联蛋白介导的细胞粘附促进细胞增殖和存活，并在多细胞结构和组织的装配和组构中起关键作用。

用于治疗黄斑变性的药物像Lucentis和阿瓦斯丁以抑制VEGF为基础，否则VEGF引用新血管生长、血管生成，随之造成黄斑水肿。已知小肽RGD可通过竞争性结合，通过抑制细胞与胞外基质¹附着来诱导细胞凋亡，如Brooks等人的美国专利号6,500,924中所示。

RGD肽结合基序或识别基序可存在于胞外基质的蛋白质中和通过识别RGD粘附表位而连接细胞的胞内细胞骨架与ECM的整联蛋白中。参见例如Foos，R Y.，Invest.Opthalmol.Vis.Sci. (1972)11，801-808。不与ECM附着的细胞通常进行细胞凋亡。

一般而言，成纤维细胞和胞外基质的糖蛋白组分间的相互作用引起主要通过在细胞表面整联蛋白上相互作用的含RGD氨基酸序列介导的严重瘢痕形成。还已知RGD序列在炎症反应和稳态反应期间参与细胞-ECM相互作用(参见Hershkoviz，S.M.等，Invest.Ophthalmol.Vis. Sci.，(1994)，35，2585-2591)，且整联蛋白在伤口愈合或病理过程中的细胞迁移中以及在调节炎症和血栓形成中起重要作用。因此，有效的整联蛋白拮抗剂，像RGD肽，作为药理剂如抗炎剂、抗转移剂或抗血栓剂可以是非常有用的(参见Elner，S.G.和Elner，V.M.，IOVS(1996) 37：696-701。文献中还报道了透明质酸的CD44受体通过其对透明质酸的亲和力，以及可能还通过其对其它配体(例如骨桥蛋白、胶原和基质金属蛋白酶(MMP))的亲和力，介导细胞-细胞和细胞-基质相互作用。

与乙酰透明质酸的粘附在细胞迁移、肿瘤生长和进展中起重要作用，还参与淋巴细胞活化、再循环和归巢以及血细胞生成。表达改变或功能障碍引起多种致病表型(参见例如Jiang D.，Annu.Rev.Cell.Dev.Biol.(2007)23：435-461；以及Knudson，W.等，MatrixBio.(2002)，21： 15-23)。

最近，研究表明CD44和细胞基质组分(例如HA)的相互作用在各种炎性疾病的发生中起重要作用，乙酰透明质酸-CD44相互作用的中断可导致脉络膜新生血管形成的改善(参见 Hiroshi Mochimaru等，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.(2009)50：4410-4415)。

这些证据表明，细胞-细胞和细胞-ECM相互作用中的粘附分子像RGD肽或CD44在各种病原性疾病的发生中起重要作用，相互作用的抑制中可以是治疗和治愈疾病方面的新的治疗靶标。

合成肽还显示与整联蛋白和生长因子结合。已经发现，含环化五肽的RGD序列抑制玻连蛋白与α_vβ₃整联蛋白(integin)的结合(参见Michael A.Dechantsreiter等，J.Med.Chem.(1999) 42：3033-3040)和玻连蛋白和纤连蛋白两者与α_vβ₃和α_IIbβ₃整联蛋白的结合(参见Roland Haubner等，J.Am.Chem.Soc.，(1996)118：7461-7472)。已经表明这种抑制可用于治疗多种无关联的疾病。在仓鼠研究中，与对照动物相比，环状五肽延迟肿瘤的生长和转移(参见M.A. Buerkle等，British J.Cancer(2002)86：788-795)。五肽还显示降低镰刀形红细胞与血管内皮的结合并改进血液动力学行为(参见Eileen M.Finnegan等，Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.，(2007) 293：H1038-H1045)。另一种含RGD序列的环状肽表明与α4β1的强烈结合，α4β1是已知在炎症反应和免疫应答中的白细胞结合中起作用的整联蛋白(参见Pina M.Cardarelli等，J.Biol. Chem.(1994)269：18668-18673)。研究表明一种合成的硫酸化四肽与VEGF强烈结合(参见 Maynard，J.A.Hubbell，ActaBiomaterialia(2005)1：451-459)。

此外，在一个重要和有用的应用中，二聚RGD肽-药物缀合物显示可用于肿瘤靶向的靶向整联蛋白的药物递送(参见Chen等，J.Med.Chem.，(2005)48(4)：1098-1106)。

在另一个同样重要和有用的应用中，已显示多聚体放射性标记的RGD肽可通过靶向整联蛋白α_vβ₃而用作肿瘤检测的诊断/成像剂，和用作肿瘤特异性靶向和治疗的放射治疗剂(参见Zi-Bo Li等，J.Nucl.Medicine，(2007)48：1162-1171)。

在眼科学中，在伤口愈合中(特别是在青光眼中)通过成纤维细胞形成瘢痕是主要问题之一。这起因于成纤维细胞和ECM的糖蛋白组分之间的相互作用。ECM糖蛋白的识别通过对粘附表位(例如Arg-Gly-Asp(或RGD)序列)特异的细胞表面整联蛋白而发生。存在于血浆蛋白质 (包括纤连蛋白(FN)和玻连蛋白(VN))的若干基质中的RGD序列，参与在炎症反应和稳态反应期间发生的细胞-ECM相互作用。抑制成纤维细胞与ECM的糖蛋白之间的相互作用缓解瘢痕形成(参见Rami Hershkoviz等，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.(1994)35：2585-2591)。

玻璃体后皮质的胶原原纤维粘附至玻璃体视网膜界面，准确说是视网膜表面的内界层(inner limiting lamina)上(参见Sebag J.，Eye(1992)，6：541-552)。沿主要的视网膜血管并以表面方式，在玻璃体基底、视神经盘上与整个后极的粘附在以下玻璃体视网膜疾病的发病机制中起重要作用：例如特发性黄斑裂孔、玻璃体黄斑牵引、增殖性糖尿病视网膜病等(Akiba J. Quiroz M.A.等，Ophthalmol.(1990)97，1619-1655)。

血管生成抑制为糖尿病视网膜病和黄斑变性显示了早期希望，所述两种病症均由眼血管增生引起。在这些病症中，血管干扰眼中的正常结构，或者它们阻断光线达到眼后。新血管本身就是主要病理，终止血管生长可防止失明。因此，血管抑制(angioinhibition)不仅可导致治疗这些病症；它还可导致治愈。此外，已假定玻璃体与视网膜相分离可减轻黄斑牵引，降低了黄斑裂孔形成的风险。因此，通过抑制纤连蛋白和层粘连蛋白与玻璃体视网膜界面上的整联蛋白结合而引起的玻璃体后部脱离，可在患有糖尿病视网膜病和视网膜静脉闭塞的眼中防止视网膜新血管形成(参见Akiba J.Quiroz MA，Ophthalmol.(1990)97，1619-1655；Kelly N.E. 等，Arch.Ophthalmol.(1991)109，654-659；以及Kado M等，Am.J.Ophthalmol.(1988)105： 20-24)。

近年来，玻璃体手术操作大大改进，减轻了玻璃体视网膜牵引并减少视网膜水肿。尽管手术技术和仪器不断改进，但在一些患者中，特别是在糖尿病视网膜病和儿科患者中，由于视网膜断裂、视网膜脱离和视网膜神经纤维损伤等并发症所致，仍难以实现玻璃体皮质的无创取出(参见Sebag J.，Arch.Clin.Exp.Ophthalmol.(1987)225：89-93；以及HanD.P.等，Arch. Ophthalmol.(1998)106：998-1000)等。因此，十分需要选择性切割玻璃体界面而又不损伤视网膜的较少创伤的方法。近年来，文献中出现有关用于分离玻璃体视网膜界面的多种药理剂的报道(参见Trese M.T.，Eye.(2002)16：365-368；Gandorfer A.等，Am.J.Ophthalmol.(2002)133： 156-159；以及Hesse L.等，Eye Res.(2000)70：31-39)。在过去，已开发出使用酶例如透明质酸酶(参见Karageozian等人的美国专利号6,863,886)和自体纤溶酶(Sakuma T等，Nippon Ganka Gakkai Zassi(2003)107：709-718)的药理学玻璃体溶解，以促进胞外基质的消化，并诱导玻璃体后部脱离。然而，邻近组织被所用酶非特异性破坏阻碍了其治疗应用的成功。最近几年来，通过集中于玻璃体视网膜界面的分离，对使用非酶药理剂像脲(参见Nickerson，C.等，载于J. Biomechanics，(2008)41：1840-1846和载于Macromol.Symp.(2005)：183-189)和RGD肽(参见 Leonardo B.Oliviera等，Curr.EyeRes.(2002)25：333-340)的新方法进行了研究。研究表明，RGD 肽的合成类似物与ECM蛋白的RGD基序竞争以破坏整联蛋白-ECM相互作用，并且在体外 (Williams J.A.，Pathol.Bio.(1992)40：813-821；Gehlsen K.R.等，J.Cell.Biol.(1988)106：925-930； Pierschbacher，M.D.等，J.Biol.CHem.，(1987)262：17294-17298；以及Zhon L.L.等，IOVS.(1996) 37：104-113)和在体内松开附着。因此，在兔模型中，玻璃体内注射可溶性RGD肽导致从视网膜表面的可溶性ECM蛋白上释放出RGD-表位，因此有利于非酶促PVD。显然，这些结果表明，玻璃体视网膜界面参与整联蛋白与ECM的RGD基序连接以及玻璃体皮质胶原与内界层(innerlimiting lamella，ILL)的粘附。RGD肽及其衍生物在伤口中促进上皮细胞的迁移(参见P.M.Mertz 等，J.Burn Care Res.(1996)17：199-206)，并且当掺入合成生物材料例如水凝胶(参见MP Lutolf 等，Proc.Nat.Acad.Sci.(2003)100：5413-5418；以及MP Lutolf等，Nature Biotechnol.(2003)21： 513-518)、其它聚合物基质(参见Horng-Ban Lin等，J.Biomed.Material.Res.(2004)28：329-342) 或作为硬基底上的表面膜(D.M.Ferris等，Biomaterials(1999)20：2323-2331)时，保持其生物活性。RGD肽还促进上皮或内皮细胞与用肽序列包覆的血管假体(参见K.Walluscheck等，Eur.J. Vascular and EndovascularSurgery(1996)12：321-330)和其它人工器官(参见Jeschke，Brigette， Biomaterials(2002)23：3455-3463)的粘附增强，并表明支持神经再生长(参见M.Rafiuddin Ahmed等，Brain Res.(2003)993：208-216)。假体的生物活性表面可含有合成树脂纤维或聚合物。

附图说明

图1表示3种肽即环状-RGD-肽、R-G-磺基丙氨酸肽(化合物1)和RGE肽对伤口愈合动力学的作用；

图2表示R-G-磺基丙氨酸肽(化合物1)的HPLC色谱图；

图3表示R-G-磺基丙氨酸肽(化合物1)的电喷雾质量色谱图；

图4表示环状-R-G-磺基丙氨酸肽(化合物2)的HPLC色谱图；和

图5表示环状-R-G-磺基丙氨酸肽(化合物2)的电喷雾质量色谱图。

具体实施方式

本发明提供新的化合物，包括上述通式I-VII的化合物。具体实例包括 Arg-Gly-NH-CH(CH₂-SO₃H)COOH的线性形式(在本文称为化合物1的实例)和 Arg-Gly-NH-CH(CH₂-SO₃H)COOH)的环状形式(在本文称为化合物2的实例)及其衍生物，包括药学上可接受的盐、水合物、立体异构体、多聚体(mutimer)、环状形式、线性形式、多聚体形式、药物缀合物、前药及其衍生物。

化合物1和2的合成

可进行本领域普通技术人员已知的常规固相肽合成(SPPS；参见R.B.Merrifield，J.Am.Chem.Soc. (1963)85(14)：2149-2154)。SPPS因高产量而是合成的优选方法。总的来讲，固相肽合成技术的第一阶段包括聚合物支持体上具有受保护的氨基酸衍生物的肽链装配。该技术的第二阶段是将肽从树脂支持体上切割下来，其中所有侧链保护基被同时切割，得到粗制游离肽。SPPS 的普遍原理是偶联-脱保护重复循环的原理。固相连接的肽的游离N端胺与单个N保护的氨基酸单元偶联。然后使该单元脱保护，这就暴露出另一个氨基酸可与之连接的新的N端胺。对于合成、保护和脱保护策略参见Von G.M.Coppola和H.F.Schuster的Asymmetric Synthesis； John Wiley&Sons，New York 1987，对于保护和脱保护策略参见Peter G.M.Wuts和Theodora W. Greene的Greene′s Protective Groups in OrganicSynthesis，(第2版)J.Wiley&Sons，1991。

固相肽合成的两种主要使用形式-Fmoc(9-芴基甲基氧基羰基；碱不稳定α-氨基保护基)和t-Boc(叔丁基氧基羰基；酸不稳定保护基)，在本发明肽合成中可优选使用Fmoc。各方法包括不同的树脂和氨基酸侧链保护，及随后的切割/脱保护步骤。在从树脂上裂解后，通常通过使用C-18、C-8和C-4等柱的反相HPLC纯化肽。

固相肽合成的一个实例

以下是使用碱不稳定的9-芴基甲基氧基羰基(Fmoc)保护基，在作为固相支持体的Wang树脂上，进行肽合成的合成步骤的概述。

Fmoc脱保护

将0.08mmol Fmoc-Pro-Wang树脂加载到配备塑料盖的烧结柱中。树脂用2×3-ml份的DMF (二甲基甲酰胺)洗涤各1分钟。接下来，加入约3ml 20％哌啶/DMF，允许Fmoc脱保护持续 15分钟。在此期间，将柱轻轻旋转或搅动以确保完全混合。在反应完成后(约15分钟)，使反应柱流干，树脂用DMF(4×3ml)再次洗涤。

酰胺键偶联

然后将所需要的Fmoc保护的氨基酸Fmoc-Thr-tBu(3当量；相对于由供应商表明的树脂负载) 和DIEA(6当量)/DCM(0.5M，相对于氨基酸)加入树脂中。使混合物在-20℃下冷却20分钟。接下来，将用于固相肽合成的肽偶联试剂六氟磷酸苯并***-1-基-氧基三吡咯烷(PyBOP) (3当量)加到反应物中。在-20℃下振荡8小时后，使反应混合物流干，树脂用DCM洗涤(3×)。

在使用20％哌啶/DMF(15分钟)进行Fmoc脱保护和用DMF洗涤(3×)后，将下一个Fmoc 保护的氨基酸(3当量；相对于树脂负载)以与上述相同的方式进行PyBop偶联。

裂解

为了得到游离酸形式的肽，使用强酸性条件例如TFA(三氟乙酸)裂解酯键。树脂用2-3ml三氟乙酸和水95∶5的溶液处理。在25分钟时间内轻轻搅动树脂。接下来，使柱流干，小心地将滤液收集到玻璃收集容器中。

化合物1(GRG磺基丙氨酸TP)的合成：

化合物1

步骤1.树脂加载：预载有脯氨酸的邻氯三苯甲基树脂用作起始原料。

步骤2.肽装配：使用Fmoc合成装配肽。受保护的氨基酸用PyBOP激活，用20％哌啶/DMF脱去末端Fmoc基团。按其出现的顺序使用下列受保护的氨基酸：

a.Fmoc-Thr-tBu(Fmoc苏氨酸-叔丁酯)

b.Fmoc-磺基丙氨酸-Pfp(Fmoc磺基丙氨酸-五氟苯酯)

c.Fmoc-Gly(Fmoc甘氨酸)

d.Fmoc-Arg-Pbf(Nα-Fmoc-Nω-(2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基)-L-精氨酸)

e.Fmoc-Gly(Fmoc甘氨酸)

步骤3.从树脂上裂解肽：从固相支持体上裂解所得肽，用85.5％TFA、5％苯酚、2％水、5％苯硫基甲烷和2.5％乙二硫醇的溶液脱去保护基。

步骤4.纯化：使用高效液相色谱法(HPLC)纯化所得到的R-G-磺基丙氨酸肽。

如上所述制备的化合物1的量通过高效液相色谱法分析纯度为＞98％面积/面积[HPLC条件：缓冲液A：0.1％三氟乙酸(TFA)/水，缓冲液B：0.1％TFA/乙腈，流动相(MP)A：97％缓冲液 A和3％缓冲液B，流动相B：79％缓冲液A和21％缓冲液B，流动相C：50％缓冲液A和50％缓冲液B；有关梯度参见下表1；流速：1.0mL/分钟；柱：WatersC18，5μ，4.6× 250mm；柱温：30℃；检测器：[email protected]；样品注射体积：20.0μL；样品制备：用1.0mL 流动相A稀释的20μL样品(约0.5mg/mL)]。相应的HPLC色谱图见图2。此外，根据用于合成肽序列的相应氨基酸的逐步加入，通过电喷雾质谱法测定纯化的化合物1的分子量为 638.3amu(理论质量：637.7amu)，证实了化合物1的身份。化合物1的电喷雾质谱图见图3。

表1：通过HPLC检测化合物1的泵梯度程序

化合物2(环状-R-G-磺基丙氨酸fN(CH₃)V)的合成：

化合物2

步骤1.加载树脂：邻氯三苯甲基树脂用作起始原料。将Fmoc-N-甲基-L-Val与树脂连接。

步骤2.肽装配：2.Fmoc合成用于肽装配。受保护的氨基酸用PyBOP激活，用20％哌啶/DMF脱去末端Fmoc基团。以其出现的顺序使用下列受保护的氨基酸：

a.Fmoc-Phe(Fmoc-苯丙氨酸)

b.Fmoc-磺基丙氨酸-PfP(Fmoc-磺基丙氨酸五氟苯酯)

c.Fmoc-Gly(Fmoc-甘氨酸)

d.Fmoc-Arg-Pbf(N_α-Fmoc-Nω-(2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基)-L-精氨酸)

步骤3.从树脂上裂解肽：使用乙酸/TFA/DCM(1∶3∶3)从固相支持体上裂解肽

步骤4.环化和脱保护成所需环状肽：在高稀释度下，使用二苯基磷酰基叠氮化物和碳酸氢钠通过原位活化进行环化。使用85.5％TFA、5％苯酚、2％水、5％苯硫基甲烷、2.5％乙二硫醇使侧链脱保护。

步骤5.纯化：HPLC用于纯化。

如上制备的化合物2的量通过高效液相色谱法分析纯度为＞99％面积/面积(HPLC条件：流动相A：0.1％三氟乙酸/水，B：0.1％TFA/(80％乙腈加20％水)；20分钟内的梯度26％-36％B；流速：1.0mL/分钟；柱：Phenomenex C18(2)4.6×150mm，5μ，100A；检测器：[email protected]；样品注射体积：100.0μL)。相应的HPLC色谱图见图4。此外，根据用于肽序列合成的相应氨基酸的逐步加入，通过电喷雾质谱法测定纯化的化合物2的分子量为625.3amu(理论质量： 625.77amu)，证实了化合物2的身份。化合物2的电喷雾质谱图见图5。

抑制细胞粘附的方法

本发明还提供通过给予受试者有效量的R-G-磺基丙氨酸(即R-G-NH-CH(CH₂-SO₃H)COOH的线性形式或R-G-NH-CH(CH₂-SO₃H)COOH的环状形式)或其衍生物(包括药学上可接受的盐、水合物、立体异构体、多聚体、环状形式、线性形式、药物缀合物、前药及其衍生物)而在人或动物受试者中抑制细胞粘附至RGD结合位点的方法。

申请人发现，本发明的合成R-G-磺基丙氨酸肽通过竞争性抑制细胞与ECM组分附着而诱导细胞凋亡。因此，本发明的合成R-G-磺基丙氨酸肽及其衍生物可用作有效的整联蛋白拮抗剂，如针对血管生成、炎症、癌症转移、血栓形成、预防和治疗瘢痕形成的治疗剂以及药理学玻璃体溶解剂。此外，在本发明的一个重要方面，设想使用多聚化和放射性标记的R-G- 磺基丙氨酸肽的α，β整联蛋白的改进靶向法用作检测肿瘤(诊断剂或成像剂)和***的内部放射治疗剂。在另一个重要方面，改进的R-G-磺基丙氨酸肽缀合物或多聚体R-G-磺基丙氨酸肽缀合物起药物载体的作用，例如作为有效靶向肿瘤的抗癌药物载体。

如本文其它部分的描述一样，与RDG-肽中的相应羧酸相比，R-G-磺基丙氨酸-肽中的磺酸是较强酸。磺酸基团的这种较高极性导致较强的分子间结合。例如，R-G-磺基丙氨酸(其具有更极化的O-H键)，可与整联蛋白结合位点中蛋白质的氨基酸的酰胺基和/或侧链形成比R-G- 天冬氨酸(其具有相对较不极化的O-H键)强的氢键和/或与整联蛋白结合位点中络合的金属离子有较强的相互作用。因此，本发明的新的R-G-磺基丙氨酸肽及其衍生物提供在整联蛋白受体识别和结合方面优于相应RGD肽的改良的化合物和组合物。

此外，在患有慢性高血糖症伴发IOP升高的糖尿病患者中，特别报道了开角型青光眼与纤连蛋白在小梁网组织中蓄积有关，且认为纤连蛋白过量抑制房水流出(参见Oshitari，T等， Am.J.Ophthalmol.(2007)143：363-365)。纤连蛋白在小梁网中参与细胞-ECM相互作用表明原发性开角型青光眼(参见Mark S.Filla等，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.(2002)43：151-161；以及 Cheryl R.Hann等，OphthalmicRes.(2001)33：314-324)。另据报道，在影响流出能力方面，巩膜静脉窦的内皮细胞与胞外基质相互作用(参见Cindy K.Bahler等，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. (2004)45：2246-2254)。根据房水流出受存在的过量胞外基质组分(例如纤连蛋白)抑制，应用 R-G-磺基丙氨酸肽及其衍生物治疗糖尿病患者的IOP升高可能极有益于糖尿病患者。

优选的R-G-磺基丙氨酸肽可以是融合多肽、环状或线性多肽、衍生化多肽(包括用/与药物递送系统或其它药物(例如抗癌药物)衍生化或缔合或偶联的R-G-磺基丙氨酸肽)、多聚化 R-G-磺基丙氨酸肽、与整联蛋白的结合位点或其功能片段免疫反应的含有R-G-磺基丙氨酸序列的单克隆抗体。

含有R-G-磺基丙氨酸的多肽可具有与天然整联蛋白粘附结合区的氨基酸残基序列相当的序列，所述结合区为例如血纤蛋白原、纤连蛋白、玻连蛋白、冯维勒布兰德因子、层粘连蛋白、血小板反应蛋白等配体中存在的结合区。

本发明的肽序列由具有末端胍基、磺酸基和羧基的3个氨基酸及其与药物递送系统偶联和/或缔合的衍生物组成，所述药物递送系统包括肽片段、糖蛋白和聚合物基团(例如PEG、Pluronic和其它聚合物基团)以及脂质体和纳米粒。包含所述肽序列以治疗各种病理病症的药物组合物包括可注射剂、凝胶剂、混悬剂、软膏剂、固体剂型和液体剂型。

与细胞粘附基序(例如纤连蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白、血纤蛋白原、血小板反应蛋白和冯维勒布兰德因子)缔合的整联蛋白受体是R-G-磺基丙氨酸肽及其衍生物的靶表位。已经发现三肽R-G-磺基丙氨酸为可被细胞结合结构域识别的最小氨基酸序列。该序列还可干扰与整联蛋白无关的免疫功能。因此，发现合成的R-G-磺基丙氨酸序列模拟RGD细胞结合结构域，且天冬氨酸α-碳的取代提供与靶标整联蛋白更强的结合亲和力。与RDG-肽中的相应羧酸相比， R-G-磺基丙氨酸-肽中的磺酸是较强的酸。磺酸基团的这种较高极性导致更强的分子间结合。例如R-G-磺基丙氨酸(其具有更极化的O-H键)可与整联蛋白结合位点的氨基酸的酰胺基和/或侧链形成比R-G-天冬氨酸(其具有相对较不极化的O-H键)强的氢键和/或与整联蛋白结合位点中络合的金属离子具有较强的相互作用。

本发明的R-G-磺基丙氨酸序列的大部分通式如下：

式A：

其中X＝-CH(R₁)-S(＝O)₂-Y；

-CH(R₁)-SH；

-CH(R₁)-OZ；

-CH(R₁)S(＝O)Y；

-CH(R₁)-O-S(＝O)₂-OX₁；和

-CH(R₁)-O-P(＝O)₂-OX₁；和

其中Y＝OX₁、NH₂；X₁＝-H、C₁-C₆直链烷基、苯基；

R₁＝H、C₁-C₆直链烷基、苯基或SO₃H

Z＝H、SO₃H

式B：

其中X＝-CH(R₁)-S(＝O)₂-Y；

-CH(R₁)-SH；

-CH(R₁)-OZ；

-CH(R₁)S(＝O)Y；

-CH(R₁)-O-S(＝O)₂-OX₁；和

-CH(R₁)-O-P(＝O)₂-OX₁；和

其中Y＝OX₁、NH₂；X₁＝-H、C₁-C₆直链烷基、苯基；

R₁＝H、C₁-C₆直链烷基、苯基或SO₃H

Z＝H、SO₃H；和

A₂选自：-Phe-Val-Ala、-Phe-Leu-Ala、-Phe-Val-Gly、-Phe-Leu-Gly、-Phe-Pro-Gly、-Phe-Pro-Ala、 -Phe-Val或其盐或N-烷基化衍生物。可以使用Arg、Gly、磺基丙氨酸、Phe、Val、Ala、Leu、 Pro、Thr的D-形式或L-形式的任何组合以及上述序列的环状形式。

环状形式的实例包括：

式C：

其中X’选自：H、C₁-C₆烷基、Ph、SO₃H；Y＝OH、NH₂；Z＝H、CH₃。

环状形式还包括五肽和七肽，例如通式C的具体化合物即化合物2(环状-R-G-磺基丙氨酸fN(CH₃)V)，表示如下：

化合物2

式A包括本文其它部分描述的通式I-VI。式B包括本文其它部分描述的通式VII。

式D：

A₁-Arg-Gly-NH-CH(X)-CO-A₂

其中X＝-CH(R₁)-S(＝O)₂-Y；

-CH(R₁)-SH；

-CH(R₁)-OZ；

-CH(R₁)S(＝O)Y；

-CH(R₁)-O-S(＝O)₂-OX₁；和

-CH(R₁)-O-P(＝O)₂-OX₁；和

其中Y＝OX₁、NH₂；X₁＝-H、C₁-C₆直链烷基、苯基；

R₁＝H、C₁-C₆直链烷基、苯基或SO₃H

Z＝H、SO₃H；和

A₁和A₂选自：-Phe-Val-Ala、-Phe-Leu-Ala、-Phe-Val-Gly、-Phe-Leu-Gly、-Phe-Pro-Gly、-Phe-Pro-Ala、 -Phe-Val或其盐或N-烷基化衍生物。可以使用Arg、Gly、磺基丙氨酸、Phe、Val、Ala、Leu、Pro、Thr的D-形式或L-形式的任何组合以及上述序列的环状形式。

取代R-G-磺基丙氨酸序列包括环状R-G-磺基丙氨酸类似物。

可通过使用药物递送系统或注射制剂或固体制剂或软膏制剂的任何药学上可接受的剂型，经皮下、皮肤、眼和全身进行R-G-磺基丙氨酸及其衍生物的施用。

本发明的化合物可通过适于产生预期治疗效果的任何途径给予，包括但不限于：口服、直肠、静脉内、动脉内、真皮内、皮下、肌内、鞘内、舌下、口腔、鼻内、经粘膜、经皮、局部、眼内、玻璃体内、其它肠内、其它胃肠外和/或其它可行的给药途径。

可以提供预期治疗效果同时避免不当作用或毒性作用的任何剂量给予本发明的化合物。可给予人受试者的本发明化合物的典型剂量的范围为约1ng/kg-约1.0g/kg。

如可行和适当时，本发明的化合物可任选以脂质体或纳米粒的形式(例如纳米囊)制备。脂质体的形成和使用一般为本领域技术人员所知。脂质体由磷脂形成，所述磷脂分散在含水介质中，使得它们自发地形成多层同心双层囊泡，有时称为多层囊泡(MLV)。MLV的直径通常为25nm-4μm。超声处理时，MLV形成直径约200-500埃的小多层囊泡(SUV)，具有含有水溶液的核心。一般而言，当分散在含水介质中时，磷脂可形成非脂质体的各种结构，这取决于脂质与水的摩尔比率。在脂质与水的低摩尔比率下，可形成脂质体。脂质体的物理特性取决于pH、张力和二价阳离子存在与否。脂质体可通过不同机制与细胞相互作用，所述机制包括1)胞吞(例如脂质体被巨噬细胞和嗜中性粒细胞等细胞吞噬)、吸附在细胞表面，2)与细胞- 表面组分相互作用，3)通过将脂质体的脂质双层***血浆膜中而与血浆细胞膜融合，或4)脂质体脂质转移到细胞膜或亚细胞膜，反之亦然。改变脂质体制剂可改变脂质体赖以与鼻旁窦、鼻黏膜等中的细胞相互作用的机制。

纳米囊是由壳和在其中可置入所需物质的空间组成的任何纳米粒。用于形成纳米囊的技术是本领域已知的。可以特殊尺寸和形状制备聚合物纳米囊。它们可作为单分散粒子产生，所述粒子具有精确界定的理化性质，因此，可以订制成在响应特定的双分子引发机制时利于治疗物质或诊断物质的释放，所述引发机制为例如鼻旁窦或其中植入了装置的耳、鼻或喉的其它区域内存在的pH、粘液流量或其它条件。纳米囊可用于本发明，作为具有可与特定靶细胞(例如癌细胞或炎症病况相关细胞)结合的特异性化学受体或结合位点的“聪明药(smart drug)”。

下面是含有本发明化合物的药物制备物的非限制性制剂实例。还包括在抑制细胞粘附中使用示例性R-G-磺基丙氨酸肽或衍生物证实的安全性和/或功效的实例。本文所用术语“R-G- 磺基丙氨酸肽”、“RGCys-肽”和“本发明的化合物”应同义地意指含有序列R-G-磺基丙氨酸及其衍生物的组合物，包括但不限于本文所述通式I-VII和化合物1和3-5界定的组合物。

实施例1

药物制剂

下面是药物制剂I-X的实例，其含有本发明的R-G-磺基丙氨酸肽，例如本文所述通式I-VII或化合物1-5任一种界定的任何R-G-磺基丙氨酸肽。

制剂I

R-G-磺基丙氨酸肽(RGCys-肽) 0.0001mg-10g

NaCl 0.01mg-0.9g

水 适量至100.0mL

制剂II

制剂III

制剂IV

制剂V

制剂VI

制剂VII

防腐剂

pH 4.0-8.0

水 适量至100.0mL

制剂VIII

防腐剂

pH 4.0-8.0

水 适量至100.0mL

制剂IX

防腐剂

pH 3.0-8.0

水 适量至100.0mL

制剂X

防腐剂

pH 3.0-8.0

水 适量至100.0mL

实施例2：

兔中RGD肽和甘氨酰-精氨酰-甘氨酰-磺基丙氨酸-苏氨酰-脯氨酸-COOH(GRG磺基丙氨 酸TP；化合物1)的PVD诱导作用的比较

在本实施例中，对RGD肽和甘氨酰-精氨酰-甘氨酰-磺基丙氨酸-苏氨酰-脯氨酸-COOH(R-G-磺基丙氨酸肽；GRG磺基丙氨酸TP；化合物1)在兔中的PVD诱导作用进行了比较。本项研究的方案如下：

方案：

动物模型

a)20只雄性和雌性兔

b)重约1.5-2.5kg

c)分成2组

i)10只兔用pH＝6.5的2.5％RGD溶液玻璃体内注射

a)10只右眼用2.5％RGD溶液注射

b)5只左眼用作BSS对照

c)5只左眼用pH＝6.5的2.5％RGD+0.02％EDTA注射

ii)10只兔用pH＝6.5的2.5％R-G-磺基丙氨酸溶液玻璃体内注射

a)10只右眼用pH＝6.5的2.5％R-G-磺基丙氨酸溶液注射

b)10只左眼pH＝6.5的2.5％R-G-磺基丙氨酸溶液+0.02％EDTA注射

活性化学物质

a)EDTA钠-99.0-100.5％，得自Spectrum Chemical Corp.

b)R-G磺-基丙氨酸-cGMP供应商(纯度＞98％)。

c)RGD-cGMP供应商(纯度＞98％)。

d)BSS溶液

将R-G-磺基丙氨酸、RGD、R-G-磺基丙氨酸+EDTA钠、RGD+EDTA钠和BSS溶液都在手术前24小时注射至玻璃体腔。肌内注射2.0ml 1∶1组合的赛拉嗪(100mg/ml)和盐酸***(100mg/ml) 使兔(10mg/kg体重)麻醉。用局部盐酸环喷托酯1％和盐酸去氧肾上腺素10％散瞳。

所有动物最初用裂隙灯活组织显微镜检查法和检眼镜间接检查法检查，排除预先存在玻璃体视网膜异常情况的任何动物。使用与1.0cc注射器连接的30规针，在鼻上象限中的缘后部2mm处给予玻璃体内注射0.10cc。必须小心以避免损伤晶状体或视网膜。

注射后24小时和临开始机械玻璃体切除术之前，进行B型扫描超声检查(B-scanultrasonography)，以确定玻璃体后部状态以及玻璃体的液化。使用与玻璃体切除术设备连接的输注纤维光学管(infusion fiberoptic)和玻璃体切除器，进行两切口经睫状体平坦部玻璃体切除术(two-port pars plana vitrectomy)。在30秒钟核心玻璃体切除术之后，将玻璃体切除器对准视***周围的视网膜表面，在此处采用低吸(low aspiration)(＜30mmHg)，尝试在4个象限中将玻璃体后皮质与视网膜表面相分离。对巩膜切开处进行缝合，并进行术后B型扫描超声检查以确定各象限中存在的任何PVD的存在情况和程度。用心脏内戊巴比妥钠注射使动物安乐死，立即摘出各眼。

根据术后B型扫描超声检查，按照以下这种分级系统对玻璃体液化和PVD的分类进行分级，以评价PVD的程度；

0级.a)未观察到玻璃体后部脱离。

b)玻璃体液化

1级.a)由其中玻璃体在2个以下象限中脱离的眼组成。

b)玻璃体液化

2级.a)由其中玻璃体在3个以上象限中脱离，但沿髓放线保持局部附着的眼组成

b)玻璃体液化

3级.a)由其中玻璃体从视网膜表面完全脱离的眼组成

b)玻璃体液化

所有眼在摘出后立即在几乎接近(sub-adjacent)睫状体平坦部的上极(superiorpole)处经受锋利剃刀穿通以确保固定液的快速穿透。要小心避免损伤邻近的视网膜和晶状体。在4摄氏度下，将眼浸入2％低聚甲醛加2.5％戊二醛最少24小时。取出单个后半球(posterior calotte)，在甲醇中脱水，在二氧化碳中干燥至临界点，用金溅射包覆后，使用扫描电子显微镜拍照。

结果：

注射：2.5％R-G-磺基丙氨酸

第1组.基线上所有动物双眼均无PVD

注射：2.5％RGD

第2组.基线上所有动物双眼均无PVD

注射：2.5％R-G-磺基丙氨酸+0.02％NaEDTA

第3组.基线上所有动物双眼均无PVD

注射：2.5％RGD+0.02％NaEDTA

第4组.基线上所有动物双眼均无PVD

本项研究实施例4的动力学研究结果表明，RGD和R-G-磺基丙氨酸(GRG磺基丙氨酸TP；化合物1)具有类似性质，玻璃体内注射2.5％R-G-磺基丙氨酸在24小时内引起玻璃体与视网膜完全分离，另外，RGD和R-G-磺基丙氨酸兔两者的玻璃体完全液化。

总之，在兔中在诱导完全PVD和液化玻璃体方面，R-G-磺基丙氨酸的活性等于或略好于RGD的活性。这可能是因其对整联蛋白的结合位点-胞外基质相互作用的竞争性结合能力强于RGD所致。如本文其它部分的描述一样，磺酸是比相应羧酸强的酸。磺酸基团的这种较高极性导致较强的分子间结合。例如，R-G-磺基丙氨酸(其具有更极化的O-H键)可与整联蛋白结合位点中的氨基酸的酰胺基和/或侧链形成比R-G-天冬氨酸(其具有相对较不极化的O-H键)强的氢键和/或与在整联蛋白结合位点中络合的金属离子具有较强的相互作用。

结果还表明，当这些化合物与0.02％乙二胺四乙酸钠一起给予时，RGD以及R-G-磺基丙氨酸两者的活性均不改变。

结果还表明，玻璃体内注射R-G-磺基丙氨酸化合物化合物1或RGD化合物没有不良作用或不良安全性作用。

实施例3

兔眼中多次注射R-G-磺基丙氨酸肽化合物1(GRG磺基丙氨酸TP)的安全性研究

在本实施例中，将R-G-磺基丙氨酸肽化合物1多次注射给予重约1.5-2.5kg的5只雄性和 4只雌性新西兰兔眼部，按照以下段落所述检查眼。

于是研究方案如下：

A)基线检查：在基线上，用裂隙灯活组织显微镜检查法和检眼镜间接检查法检查全部9只兔的右眼和左眼，以证实动物均无预先存在的玻璃体视网膜异常情况。另外还对全部9只动物的左眼和右眼进行了β型扫描超声检查(β-scan ultrasonography)以及ERG扫描，以获得基线读数。

B)实验治疗：然后，全部9只兔接受玻璃体内注射R-G-磺基丙氨酸溶液或盐水(对照)。治疗溶液如下制备：

R-G-磺基丙氨酸溶液：2.5mg/100μl R-G-磺基丙氨酸化合物1溶液，其含有0.02mgEDTA二钠 +0.80mg氯化钠和USP无菌注射用水，pH调节至6.5。

盐水(对照)：pH调节至6.5的USP等渗无菌盐水溶液。

如下进行给药：

1)9只兔每只的右眼玻璃体内注射100μl的2.5mg/100μl R-G-磺基丙氨酸溶液(递送剂量＝2.5mg的化合物1)

2)9只兔每只的左眼玻璃体内注射100μl的盐水(对照)。

3)初始玻璃体内注射后一天，通过裂隙灯活组织显微镜检查法和检眼镜间接检查法检查全部9只兔的右眼和左眼，以查明任何兔是否因注射而有任何不良作用。

4)第1次注射后第7天，再次通过裂隙灯活组织显微镜检查法和检眼镜间接检查法检查全部9只兔的右眼和左眼，以确定任何兔是否因注射而有不良作用。另外，对全部动物的右眼和左眼进行了ERG扫描，以确定是否自基线有任何变化。

5)然后随机选出一组3只兔，编号901、904和909，对所选的3只动物的右眼和左眼进行了机械玻璃体切除术以确定玻璃体后部的状态。

6)3只随机选择的动物，编号901、904和909，用心脏内戊巴比妥钠注射使之安乐死，立即摘出眼。所有眼在摘出后立即在几乎接近睫状体平坦部的上极处经受锋利剃刀穿通以确保固定液的快速穿透。要小心以避免损伤邻近的视网膜和晶状体。在4摄氏度下，将眼浸入 2％低聚甲醛加2.5％戊二醛(gluteraldehyde)中最少24小时。取出单个后半球，在甲醇中脱水，在二氧化碳中干燥至临界点，用金溅射包覆后，使用扫描电子显微镜拍照。其它样品进行组织病理学检查。

第一次注射后7天给其余的6只兔(编号902、903、905、906、907和908)第二次注射。

1)其余6只兔每只的右眼再次用100μl的2.5mg/100μl R-G-磺基丙氨酸溶液(递送第二次2.5mg剂量的化合物1)玻璃体内注射。

2)其余6只兔每只的左眼再次用100μl的盐水(对照)玻璃体内注射。

3)第二次玻璃体内注射后1天，通过裂隙灯活组织显微镜检查法和检眼镜间接检查法检查其余全部6只兔的右眼和左眼，以检查任何兔是否因注射而有任何不良作用。

4)在第2次注射后第7天，通过裂隙灯活组织显微镜检查法和检眼镜间接检查法检查其余全部6只兔的右眼和左眼，以查明注射的任何不良作用。另外，对全部动物的左眼和右眼进行了ERG扫描，以确定是否自基线有任何改变。

5)然后随机从其余6只动物中选出3只兔，编号902、903和907，对随机选出的3 只动物的右眼和左眼进行了机械玻璃体切除术以确定玻璃体后部的状态。

6)3只随机选择的动物(编号902、903和907)然后用心脏内戊巴比妥钠注射使之安乐死，立即摘出眼。所有眼在摘出后立即在几乎接近睫状体平坦部的上极处经受锋利剃刀穿通以确保固定液的快速穿透。要小心以避免损伤邻近的视网膜和晶状体。在4摄氏度下，将眼浸入2％低聚甲醛加2.5％戊二醛中最少24小时。取出单个后半球，在甲醇中脱水，在二氧化碳中干燥至临界点，用金溅射包覆后，使用扫描电子显微镜拍照。其它样品进行组织病理学检查。

然后在第一次注射后14天，如下给剩余组的3只兔(编号905、906和908)第三次注射：

1)其余3只兔每只的右眼再次用100μl的2.5mg/100μl R-G-磺基丙氨酸溶液(递送第三次 2.5mg剂量的化合物1)玻璃体内注射。

2)其余3只兔每只的左眼再次用100μl的盐水(对照)玻璃体内注射。

3)第3次玻璃体内注射后1天，通过裂隙灯活组织显微镜检查法和检眼镜间接检查法检查其余全部6只兔的右眼和左眼，以查明任何兔是否因注射而有任何不良作用。

4)第3次注射后第7天，其余全部3只兔的右眼和左眼再次通过裂隙灯活组织显微镜检查法和检眼镜间接检查法检查，以查明注射的任何不良作用。另外，对全部动物的左眼和右眼进行了ERG扫描以确定是否自基线有任何改变。

5)对其余3只动物(编号905、906和908)的右眼和左眼进行了机械玻璃体切除术以确定玻璃体后部的状态。

6)其余3只动物(编号905、906和908)用心脏内戊巴比妥钠注射使之安乐死，立即摘出眼。所有眼在摘出后立即在几乎接近睫状体平坦部的上极处经受锋利剃刀穿通以确保固定液的快速穿透。要小心以避免损伤邻近的视网膜和晶状体。在4摄氏度下，将眼浸入2％低聚甲醛加2.5％戊二醛中最少24小时。取出单个后半球，在甲醇中脱水，在二氧化碳中干燥至临界点，用金溅射包覆后，使用扫描电子显微镜拍照。其它样品进行组织病理学检查。

3)活性化学物质

用于本项研究的活性化学物质如下：

a.EDTA二钠-99.0-100.5％，得自Spectrum Chemical Corp.

b.R-G-磺基丙氨酸肽(化合物1)

c.USP无菌等渗盐水溶液

4)研究制剂

a)R-G-磺基丙氨酸溶液：2.5mg/100μl的R-G-磺基丙氨酸溶液，其含有0.02mg EDTA二钠+ 0.80mg氯化钠和USP无菌注射用水，调节至pH＝6.5。通过0.22μ过滤器无菌过滤入2.0mL 小瓶中。

b)盐水(对照)：调节至pH 6.5的USP等渗无菌盐水溶液。通过0.22μ过滤器无菌过滤入无菌小瓶中。

5)用于注射准备的麻醉

a)肌内注射2.0mL赛拉嗪(100mg/ml)和盐酸***(100mg/ml)的1∶1组合

b)用局部盐酸环喷托酯1％和盐酸去氧肾上腺素10％散瞳

6)玻璃体内注射准备：

提供装有调节至pH 6.5的含2.5mg/100μl的R-G-磺基丙氨酸溶液和等渗无菌盐水溶液的无菌小瓶。

注射前，研究人员确认1.0cc注射器中有0.10cc(1D0微升)的溶液。

7)注射方法：

由于玻璃体内注射不会引起足以破坏兔的正常日常活动的某种水平的视力伤残，因此按照视力与眼科学研究协会(Association for Research in Vision andOphthalmology)指引的动物决议，这不被视为重大生存手术。

在对兔完成裂隙灯活组织显微镜检查法、检眼镜检查和ERG的基线检查之后，将R-G- 磺基丙氨酸溶液以及无菌盐水溶液两者注射入玻璃体腔中。通过肌内注射2.0mi赛拉嗪(100mg/ml)和盐酸***(100mg/ml)的1∶1组合，使兔(10mg/kg体重)麻醉。用局部盐酸环喷托酯1％和盐酸去氧肾上腺素10％散瞳。

所有动物最初用裂隙灯活组织显微镜检查法和检眼镜直接检查法检查，以排除预先存在玻璃体视网膜异常情况的任何动物。使用与1.0cc注射器连接的30规针，在鼻上象限(supronasal quadrent)中的缘后部2mm处给予玻璃体内注射0.10cc。要小心以避免损伤晶状体或视网膜。

注射后七(7)天，对动物进行机械玻璃体切除术。使用与玻璃体切除术设备连接的输注纤维光学管和玻璃体切除器，进行两切口经睫状体平坦部玻璃体切除术。在30秒钟核心玻璃体切除术后，将玻璃体切除器对准视***周围的视网膜表面，在此处采用低吸(＜30mmHg)，尝试在4个象限中使玻璃体后皮质与视网膜表面相分离。用心脏内戊巴比妥钠注射便动物安乐死，立即摘出各眼。

所有眼在摘出后立即在几乎接近睫状体平坦部的上极处经受锋利剃刀穿通以确保固定液的快速穿透。要小心以避免损伤邻近的视网膜和晶状体。在4摄氏度下，将眼浸入2％低聚甲醛加2.5％戊二醛中最少24小时。取出单个后半球，在甲醇中脱水，在二氧化碳中干燥至临界点，用金溅射包覆后，使用扫描电子显微镜拍照。

结果分析

采用下列技术，针对安全性对用R-G-磺基丙氨酸溶液和无菌盐水溶液治疗的各眼间的安全性数据进行了分析：

i)裂隙灯活组织显微镜检查法；

ii)检眼镜检查；

iii)ERG；

iv)组织病理学；和

v)电子显微镜检查。

安全性概况：

第一次玻璃体内给予编号为901、902、903、904、905、906、907、908、909的一组9只兔100μl 2.5％R-G-磺基丙氨酸溶液，在所有时间点上均不与任何明显毒性有关。在2.5％R-G-磺基丙氨酸组和等渗盐水溶液组之间经报告的不良作用无显著差异。通过临床检查、检眼镜间接检查法和超声β型扫描及机械玻璃体切除术确定了没有这种毒性。

在所有研究访查中进行了裂隙灯活组织显微镜检查法，并集中在眼睑、结膜和巩膜、角膜、内皮改变、前房反应、虹膜、晶状体与囊以及前部玻璃体的炎症迹象，以证实对于玻璃体内注射100μl 2.5％R-G-磺基丙氨酸溶液组和等渗盐水溶液组几乎完全没有炎性反应。在所有研究点和在所有研究组中，似乎没有由试验物引起的明显毒性的任何迹象。

亦在整个研究中接着后段的临床评价，以确保不存在明显的视网膜毒性。在各个评价时间点上进行了检眼镜间接检查法以及裂隙灯眼底评价，其中特别留意视网膜毒性的任何迹象。针对玻璃体密度、玻璃体液化、玻璃体附着的任何变化和可能发生的出血对后段进行评价。针对RPE毒性、视网膜血管损害、视网膜出血、渗出物、视网膜撕裂、破裂或脱离的任何迹象对视网膜进行评价。在治疗前的基线上没有RPE改变，在所有研究点上和在所有研究组中，没有出现由试验物引起的明显的后段改变的任何迹象。重要的是注意到，在玻璃体内注射前对9只动物进行的ERG扫描以及注射后1天和7天对所有动物进行的ERG扫描，似乎没有产生由试验物引起的明显改变或毒性的任何迹象。

第二次玻璃体内给予编号为902、903、905、906、907、908的一组6只兔100μl 2.5％R-G-磺基丙氨酸溶液，在所有时间点上均不与任何明显毒性有关。在2.5％R-G-磺基丙氨酸组和等渗盐水溶液组之间经报告的不良作用无显著差异。通过临床检查、检眼镜间接检查法和超声β型扫描及机械玻璃体切除术确定了没有这种毒性。

在所有研究访查中进行了裂隙灯活组织显微镜检查法，并集中在眼睑、结膜和巩膜、角膜、内皮改变、前房反应、虹膜、晶状体与囊以及前部玻璃体的炎症迹象，以证实对于玻璃体内注射100μl 2.5％R-G-磺基丙氨酸溶液组和等渗盐水溶液组几乎完全缺乏炎性反应。在所有研究点和在所有研究组中，似乎没有由试验物引起的明显毒性的任何迹象。

亦在整个研究中接着后段的临床评价，以确保不存在明显的视网膜毒性。在各个评价时间点上进行了检眼镜间接检查法以及裂隙灯眼底评价，其中特别留意视网膜毒性的任何迹象。针对玻璃体密度、玻璃体液化、玻璃体附着的任何变化和可能发生的出血对后段进行评价。针对RPE毒性、视网膜血管损害、视网膜出血、渗出物、视网膜撕裂、破裂或脱离的任何迹象对视网膜进行评价。在第2次治疗前7天的基线上没有RPE改变，在所有研究点上和在所有研究组中，没有出现由试验物引起的明显的后段改变的任何迹象。重要的是注意到，在玻璃体内注射后第二次对6只动物进行的ERG扫描，以及注射后8天和14天对所有动物进行的ERG扫描，似乎没有产生由试验物引起的明显改变或毒性的任何迹象。

第三次玻璃体内给予编号为905、906、908的一组6只兔100μl 2.5％R-G-磺基丙氨酸溶液，在所有时间点上均不与任何明显毒性有关。在2.5％R-G-磺基丙氨酸组和等渗盐水溶液组之间经报告的不良作用无显著差异。这种毒性的缺乏通过临床检查、检眼镜间接检查法和超声β型扫描及机械玻璃体切除术确定。

在所有研究访查中进行了裂隙灯活组织显微镜检查法，并集中在眼睑、结膜和巩膜、角膜、内皮改变、前房反应、虹膜、晶状体与囊以及前部玻璃体的炎症迹象，以证实对于玻璃体内注射100μl 2.5％R-G-磺基丙氨酸溶液组和等渗盐水溶液组几乎完全缺乏炎性反应。在所有研究点和在所有研究组中，似乎没有由试验物引起的明显毒性的任何迹象。

亦在整个研究中接着后段的临床评价，以确保不存在明显的视网膜毒性。在各个评价时间点上进行了检眼镜间接检查法以及裂隙灯眼底评价，其中特别留意视网膜毒性的任何迹象。针对玻璃体密度、玻璃体液化、玻璃体附着的任何变化和可能发生的出血对后段进行评价。针对RPE毒性、视网膜血管损害、视网膜出血、渗出物、视网膜撕裂、破裂或脱离的任何迹象对视网膜进行评价。在第3次治疗前14天的基线上没有RPE改变，在所有研究点上和在所有研究组中，没有出现由试验物引起的明显的后段改变的任何迹象。重要的是注意到，玻璃体内注射后第3次对3只动物进行的ERG扫描，以及注射后15天和21天对所有动物进行的ERG扫描似乎没有产生由试验物引起的明显改变或毒性的任何迹象。

实施例4

R-G-磺基丙氨酸肽的抗粘附性质：用化合物1(GRG磺基丙氨酸TP)、环状-RGD和RGE进行 的伤口愈合的动力学研究

在本实施例中，在伤口愈合模型中，证实了R-G-磺基丙氨酸肽具有抗粘附性质，因此可防止许多病理性玻璃体视网膜疾病的发生，并可抑制人黑素瘤和结肠癌细胞的转移。

为了测试R-G-磺基丙氨酸肽的体外抗粘附性质，用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)进行了伤口愈合试验。将HUVEC接种在纤连蛋白包被的表面上，并使之生长成汇合的单层。将小的移液管尖端横越HUVEC单层拖动来产生伤口(划痕裂缝)。然后将细胞在含有R-G-磺基丙氨酸肽(化合物1；10mM)的新鲜生长培养基中孵育，在不同时间点(0、4、8、12、16、20、24小时)对5个不同视野中的伤口区拍照，以测定伤口闭合的动力学。通过测定经HUVEC通过细胞粘附、迁移和增殖重新占据的起始伤口区的分数，来量化伤口闭合水平。

在对照研究中，用下列肽替换R-G-磺基丙氨酸(化合物1)：环状-RGD肽(1mM)，阳性对照)和RGE肽(1mM，阴性对照)。

图1提供了所述肽对伤口愈合动力学的作用。

结果表示为起始面积的百分比。误差棒相当于2-6次独立试验的伤口大小的标准差。

HUVEC伤口闭合动力学的结果表明，24小时后R-G-磺基丙氨酸肽抑制HUVEC伤口愈合达70％，而24小时后环状RGD(基于RGD的肽；N-甲基化环状-RGDf-N(Me)V；西仑吉肽)抑制HUVEC伤口愈合达45％。将这两者与24小时后抑制HUVEC伤口愈合0％的阴性对照RGE肽相比较。R-G-磺基丙氨酸(化合物1)的作用在量上比得上基于RGD的肽(一种已十分确定的整联蛋白结合活性的抑制剂)的活性。此外，R-G-磺基丙氨酸肽具有与基于RGD的肽的活性相似的性质而不使HUVEC细胞凋亡。

如本文其它部分的描述一样，玻璃体和视网膜之间的强烈粘附可能是最终发生许多病理性玻璃体视网膜疾病的原因，所述疾病为例如玻璃体黄斑牵引、增殖性糖尿病视网膜病、黄斑裂孔、年龄相关性黄斑变性和飘浮物。因此，十分需要获得玻璃体后部脱离的无创性非侵入方法，而不是玻璃体与视网膜内表面的机械分离(参见Tezel，T.H.等，Retina(1998)18：7 -15；以及Verstraeten，T.C等，Arch.Ophthalmol.(1993)111：849-854)。

如本文其它部分的描述一样，ECM组分，特别是玻璃体皮质的胶原原纤维，被认为在内界层(ILL)中通过整联蛋白结合位点与视网膜的内表面锚定(参见Foos，R.Y.，Invest.Ophthalmol. Vis.Sci.(1972)11：801-808)。另已知眼中ILL的主要黏着糖蛋白(例如纤连蛋白和层粘连蛋白)通过RGD(Arg-Gly-Asp)序列与整联蛋白大量连接(参见Curtis，T.M.等，Am.J.Physiol.，(1995)269： L248-L260；Elner，S.G.等，IOVS(1996)37：696-701；以及Horman，S.M等，Am.J.Physiol.(1995)269： L248-L260)，且若干整联蛋白通过ECM蛋白上存在的RGD基序结合。此外，已知纤连蛋白与α_vβ₃以外的若干其它整联蛋白结合，而玻连蛋白是α_vβ₃特异性的。

整联蛋白与ECM的主要连接涉及Arg-Gly-Asp(RGD)序列，且RGD序列与位于整联蛋白头的α-亚基和β-亚基之间的浅裂缝结合(参见Xiong等，Science(2002)296：151-155)。这种结合有助于调节各种细胞信号转导途径，包括细胞粘附、迁移、分化、血管生成和伤口愈合(参见Ruoslahti，E.等，Science(1987)238：491-497；和J.Clin.Invest.(1991)87：1-5)。

由于玻璃体胞外基质(例如胶原原纤维)通过整联蛋白结合位点与细胞视网膜(cellular retina)连接，因此玻璃体内注射R-G-磺基丙氨酸肽(寡肽)可通过与相同的整联蛋白受***点竞争性结合而从细胞视网膜释放出玻璃体胞外基质的RGD基序。

数位研究人员(参见Ruoslahti，E.等，Science(1987)238：491-497；Hynes，R.A.等，Cell (1992)68：303-322；以及Humphries，M.J.，J.Cell Sci.，(1990)97：585-592)证实，许多整联蛋白(α_vβ₃、α₅β₁、α₁₁β₃等)可被具有RGD序列基序的小肽抑制。已充分证明，α_vβ₃和α₅β₁整联蛋白以及玻连蛋白和纤连蛋白在以下肿瘤中上调：例如人黑素瘤细胞(参见Nip，J.，J.Clin. Invest.，(1992)90：1406-1413)、人乳癌细胞(参见Rong，L.等，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.(2009)50： 5988-5996)和人视网膜色素上皮细胞(PeterC.Brooks等，J.Clin.Invest.，(1995)96：1815-1822)。于是已证实，人黑素瘤细胞的转移潜力与黑素瘤细胞通过α_vβ₃整联蛋白受体与***玻连蛋白的粘附有良好相关性，且含有RGD的肽抑制该粘附(Nip，J.，J.Clin.Invest.，(1992)90： 1406-1413)。这就表明RGD肽可为重要的抗血管生成剂。

此外，已经证实，在人结肠癌细胞系中当存在细胞粘附显著增加时，转移活性便增强 (Lehmann，M.，Cancer Res.，(1994)，54：2102-2107)。因此，抑制细胞粘附的药物有效地抑制结肠癌和黑素瘤发生转移。

根据其中R-G-磺基丙氨酸显示抑制细胞粘附的伤口愈合研究的结果，并根据黑素瘤和结肠癌模型中RGD转移潜力的推断，R-G-磺基丙氨酸肽及其衍生物可有效地抑制肿瘤转移，例如黑素瘤和结肠癌的转移。

实施例5

使用R-G-磺基丙氨酸肽用于引导或递送药物至肿瘤

在本实施例中，提供下述二聚R-G-磺基丙氨酸肽-紫杉醇缀合物(化合物3)。该组合物可用作抗肿瘤剂。二聚R-G-磺基丙氨酸肽与在某些癌细胞中高表达的整联蛋白受体选择性结合，并可通过抑制细胞粘附用于治疗某些转移性癌症，例如转移性乳癌。

化合物3：

化合物3

化合物3的相应RGD类似物的合成和作用机制、生物分布和肿瘤选择性描述于Chen，X.等， Synthesis and Biological Evaluation of Dimeric RGD Peptide-PaclitaxelConjugate as a Model for Integrin-Targeted Drug Delivery(作为整联蛋白靶向药物递送模型的二聚RGD肽-紫杉醇缀合物的合成和生物学评价)；J.Med.Chem.，(2005)48(4)：1098-1106)。

虽然化合物3包含与二聚R-G-磺基丙氨酸肽结合的特殊抗肿瘤剂紫杉醇，但要认识到本发明的这个方面包括与任何可行的诊断剂或治疗剂结合的R-G-磺基丙氨酸肽的所有单体形式或多聚体形式，所述诊断剂或治疗剂可用于诊断、成像或***或其它含整联蛋白的组织或结构。可与本发明的单体或多聚体R-G-磺基丙氨酸肽结合的抗肿瘤物质的实例可包括抗肿瘤剂(例如癌症化学治疗剂、生物反应调节剂、血管生成抑制剂、激素受体阻断剂、低温治疗剂(cryotherapeutic agent)或破坏或抑制瘤形成或肿瘤发生的其它物质)，例如烷化剂或通过攻击其DNA而直接杀死癌细胞的其它物质(例如环磷酰胺、异磷酰胺(isophosphamide))、亚硝基脲或通过抑制对细胞DNA修复所必需的变化而杀死癌细胞的其它物质(例如卡莫司汀(BCNU) 和洛莫司汀(CCNU))、抗代谢物和通过干扰某些细胞功能(通常为DNA合成)而阻断癌细胞生长的其它物质(例如6-巯基嘌呤和5-氟尿嘧啶(5FU)、抗肿瘤抗生素和通过结合或嵌入DNA和防止RNA合成起作用的其它化合物(例如多柔比星、柔红霉素、表柔比星、伊达比星、丝裂霉素 -C和博来霉素)、植物(长春花属)生物碱和来源于植物的其它抗肿瘤剂(例如长春新碱和长春碱)、甾类激素、激素抑制剂、激素受体拮抗剂和影响激素反应性癌的生长的其它物质(例如他莫昔芬、赫赛汀、芳香酶抑制剂例如氨鲁米特(aminoglutethamide)和福美坦、***(trriazole)抑制剂例如来曲唑和阿那曲唑、甾体抑制剂例如依西美坦)、抑制肿瘤血管发生或血管生成的抗血管生成蛋白、小分子、基因治疗和/或其它物质(例如meth-1、meth-2、沙利度胺)、贝伐珠单抗 (阿瓦斯丁)、司夸胺、内皮生长抑素、血管生长抑素、Angiozyme、AE-941(Neovastat)、CC-5013 (Revimid)、medi-522(Vitaxin)、2-甲氧基***(2ME2、Panzem)、羧基酰胺基***(CAI)、康普瑞汀A4前药(CA4P)、SU6668、SU11248、BMS-275291、COL-3、EMD 121974、IMC-1C11、IM862、 TNP-470、塞来考昔(Celebrex)、罗非考昔(Vioxx)、干扰素α、白介素-12(IL-12)或Science第289 卷第1197-1201页(2000年8月17日)鉴定的任何化合物(其通过引用明确结合到本文)、生物反应调节剂(例如干扰素、卡介苗(BCG)、单克隆抗体、白介素2(interleukin-12)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)等)、PGDF受体拮抗剂、赫赛汀、天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥(cchlorambucil)、阿糖胞苷、达卡巴嗪、依托泊苷、flucarbazine、氟尿嘧啶(flurouracil)、吉西他滨、羟基脲、异环磷酰胺(ifosphamide)、伊立替康、洛莫司汀、美法仑、巯基嘌呤、甲氨蝶呤、硫鸟嘌呤、塞替派、拓优得、托泊替康、曲奥舒凡、长春碱、长春新碱、mitoazitrone、奥沙利铂、丙卡巴肼、链球菌素、泰素、泰素帝、这类化合物的类似物/ 同源物和衍生物以及本文未列出的其它抗肿瘤剂。

实施例6

用于整联蛋白表达肿瘤的成像的⁶⁴CU标记的多聚体R-G-磺基丙氨酸肽

在本实施例中，下面所显示的⁶⁴CU标记的本发明四聚体和八聚体R-G-磺基丙氨酸肽(分别为化合物4和5)，可用作成像和诊断目的的放射治疗剂(例如肿瘤放射性同位素标记用于PET扫描)以及用于将治疗剂引入或递送至表达整联蛋白的肿瘤或其它细胞中，例如表达α_vβ₃整联蛋白的肿瘤。

化合物4：

化合物4

化合物5：

化合物5

化合物4和5的相应RGD类似物的合成和作用机制、生物分布、肿瘤选择性和PET相关应用描述于Li，Z.等，⁶⁴CU-Labeled Tetrameric and Octameric RGD Peptides for Small-Animal PET of Tumor α_vβ₃ Integrin Expression(用于肿瘤α_vβ₃整联蛋白表达的小动物PET的⁶⁴CU标记的四聚体和八聚体RGD肽)；J.Nucl.Med.48(7)第1162-1171页(2007)。

与本文所用一样，任何提及疾病或病症的治疗(treating/treatment)应解释为包括在疾病或病症发生或被检出之前预防(preventing/prevention)所述疾病或病症以及在其发生或检出之后治疗所述疾病或病症。

要理解的是，上文参照本发明的某些实施例或实施方案对本发明进行了描述，但是可在不偏离本发明的既定精神和范围的情况下，对这些实施例和实施方案进行各种添加、删减、改动和修改。例如，一个实施方案或实施例的任何要素或属性可掺入另一实施方案或实施例或者与另一实施方案或实施例一起使用，除非另有说明如果如此做可能致使实施方案或实施例不适于其既定用途。同样地，如果以特定顺序描述或列举方法或工艺的步骤，则可以改变所述步骤的顺序，除非另有说明或者除非如此做可能致使所述方法或工艺无法实现其既定目的。所有合理的添加、删减、修改和改动应视为所述实施例和实施方案的等同内容，并且包括在所附权利要求书的范围内。本文引用的所有出版物和专利文献均通过引用以其整体结合到本文中用于所有目的，引用程度如同各自如此分别指出一样。