阅读说明：本技术 一种检测枸杞根腐病尖孢镰孢菌的环介导等温扩增检测方法及其检测引物和验证方法 (A kind of loop-mediated isothermal amplification detection method and its detection primer and verification method detecting fructus lycii root rot Fusarium oxysporum ) 是由 漆永红 李敏权 李雪萍 曹素芳 李建宏 李继平 申培增 陈爱昌 于 2019-08-22 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种检测枸杞根腐病尖孢镰孢菌的环介导等温扩增检测方法及其检测引物和验证方法；检测引物采用LAMP设计软件primer software PrimerExplorer V4进行设计,包括2条外引物F3和B3,2条内引物FIP、BIP。本发明的有益效果为：采用本发明的检测方法、引物及验证方法进行检测,5个不同地理来源的枸杞根腐病尖孢镰孢菌LAMP检测均呈黄绿色,即阳性,而对照和其他病原菌均呈橘色,即阴性。本专利具有引物特异性强、检测灵敏度高、反应速度快、直接用肉眼观察结果、准确性高、不易污染、对疑似病害样本直接检测等优点。同时通过显色进行比对判断,大幅提升检测准确性。(The invention discloses a kind of loop-mediated isothermal amplification detection method for detecting fructus lycii root rot Fusarium oxysporum and its detection primer and verification methods；Detection primer is designed using LAMP design software primer software PrimerExplorer V4, including 2 outer primer F3 and B3,2 inner primers FIP, BIP.The invention has the benefit that being detected using detection method of the invention, primer and verification method, the fructus lycii root rot Fusarium oxysporum LAMP detection of 5 different geographic origins is in yellow green, it is i.e. positive, and compareing with other pathogens is in orange, i.e., it is negative.This patent have many advantages, such as primer specificity is strong, detection sensitivity is high, reaction speed is fast, the result that directly detects by an unaided eye, accuracy are high, it is not easy to pollute, doubtful disease sample is directly detected.Judgement is compared by colour developing simultaneously, detection accuracy is substantially improved.)

一种检测枸杞根腐病尖孢镰孢菌的环介导等温扩增检测方法 及其检测引物和验证方法

技术领域

本发明涉及植物病害病原菌检测技术领域，具体涉及一种检测枸杞根腐病尖孢镰孢菌的环介导等温扩增检测方法及其检测引物和验证方法。

背景技术

枸杞根腐病发病症状：发病初期，病株叶片灰绿，中午萎蔫，早晚可恢复。其后不再恢复，叶片变枯黄，缓慢死亡。根茎部稍肿胀，韧皮部变红褐色，发软，外部有白色菌丝，木质部有红褐色细条纹，有时渗入深层。主根及侧根的韧皮部***发褐死亡。表皮纵裂，韧皮部中有很多白色粉质小点，易自木质部上剥落。

现有研究发现枸杞根腐病的主要病原菌为尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)，在PDA培养基上菌落白色、粉色至紫色。7d后菌落直径90mm，***呈羊毛状，菌背产生粉色或紫色色素。菌丝无色，有隔。产孢梗单瓶梗，大小为8.2～16.5μm×1.8μm(平均11.8μm×1.8μm)。大型分生孢子镰孢形，中间粗，两端尖细，具3～5个横膈膜，多为3个隔，大小为23.5～32.9μm×2.4～3.5μm(平均27.5μm×2.7μm)，足胞明显。小型分生孢子椭圆形、长椭圆形，单胞，无色，假头状，大小为3.5～14.1μm×1.8～2.9μm(平均6.8μm×2.5μm)。厚垣孢子很多，单生、对生、间生或顶生，球形，大小为5.5～10.0μm。上述培养方法虽然可以进行尖孢镰孢菌检测，但是需要工作人员实时观测形状变化情况并进行记录才能进行判定。上述方法培养周期长、判定标准不一。尤其无法适用田间快速测试，培养周期过长检测结果确定后田间已发生大面积灾害，无法提前防控。

LAMP检测具有操作简单、特异性强、灵敏度高、产物易检测等特点，广泛应用于真菌、细菌、病毒、线虫等病原微生物的检测。LAMP反应的原理，利用4种特异引物依靠一种高活性链置换DNA聚合酶。使得链置换DNA合成在不停地自我循环，扩增分两个阶段。第1阶段为起始阶段，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。上游内部引物FIP的F2序列首先与模板F2c结合，在链置换型DNA聚合酶的作用下向前延伸启动链置换合成。外部引物F3与模板F3c结合并延伸，置换出完整的FIP连接的互补单链。FIP上的F1c与此单链上的Fl为互补结构。自我碱基配对形成环状结构。以此链为模板。下游引物BIP与B3先后启动类似于FIP和F3的合成，形成哑铃状结构的单链。迅速以3’末端的Fl区段为起点.以自身为模板，进行DNA合成延伸形成茎环状结构。该结构是LAMP基因扩增循环的起始结构。第2阶段是扩增循环阶段。以茎环状结构为模板，FIP与茎环的F2c区结合。开始链置换合成，解离出的单链核酸上也会形成环状结构。迅速以3’末端的B1区段为起点，以自身为模板。进行DNA合成延伸及链置换，形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA，BIP引物上的B2与其杂交。启动新一轮扩增。且产物DNA长度增加一倍。在反应体系中添加2条环状引物LF和LB，它们也分别与茎环状结构结合启动链置换合成，周而复始。扩增的最后产物是具有不同个数茎环结构、不同长度DNA的混合物。且产物DNA为扩增靶序列的交替反向重复序列。

LAMP反应的特点是，(1)灵敏度高：LAMP的检测灵敏度通常比PCR高10～1000倍，与real-time PCR灵敏度相近。(2)高特异性：针对靶序列6个区域设计的4种特异性引物，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故其特异性极高。(3)快速高效：不需要预先的双链DNA热变性.避免了温度循环而造成的时间损失.核酸扩增在l h内均可完成，比PCR反应更快完成。在LAMP扩增体系中增加1条环引物可加速扩增反应，缩短反应时间，使扩增反应能在30min内完成，提高了LAMP检测的效率。(4)产物检测直观：LAMP扩增产生大量的双链DNA，向反应管中加入焚光染料SYBR Green I，根据颜色变化判断扩增是否发生。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种操作简单、特异性强、灵敏度高、产物易检测的检测枸杞根腐病尖孢镰孢菌的环介导等温扩增检测方法及其检测引物和验证方法。

枸杞根腐病尖孢镰孢菌的基因序列：

TTAAGTTCAGCGGGTATTCCTACCTGATCCGAGGTCAACATTCAGAAGTTGGGGTTTAACGGCGTGGCCGCGACGATTACCAGTAACGAGGGTTTTACTACTACGCTATGGAAGCTCGACGTGACCGCCAATCAATTTGAGGAACGCGAATTAACGCGAGTCCCAACACCAAGCTGTGCTTGAGGGTTGAAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCGCCAGAATACTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTTGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTTATTTATGGTTTTACTCAGAAGTTACATATAGAAACAGAGTTTAGGGGTCCTCTGGCGGGCCGTCCCGTTTTACCGGGAGCGGGCTGATCCGCCGAGGCAACAAGTGGTATGTTCACAGGGGTTTGGGAGTTGTAAACTCGGTAATG

具体如序列表中序列1所示。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一种检测枸杞根腐病尖孢镰孢菌的环介导等温扩增检测用引物，所述环介导等温扩增检测引物为：

F3：5’-GTCCGAAAATTTTGCGGTGC-3’；

B3：5’-TTCCAGTGGTTA GTGACTGC-3’；

FIP：5’-AGTGGCGGGGTAAGATACCCC-3’；

BIP：5’-GCTTGCCCTGTTCCCACAAAAC-3’。

本发明的第二个目的是提供了一种检测枸杞根腐病尖孢镰孢菌的环介导等温扩增检测方法，使用上述的环介导等温扩增检测引物进行环介导等温扩增。

进一步的，上述的一种检测枸杞根腐病尖孢镰孢菌的环介导等温扩增检测方法，包括以下步骤：

A、病样采集：

采集枸杞根腐病病株，室内以常规方法分离病原菌，病原菌于4℃下保存；

B、菌株培养：

病原菌培养在PDA培养基上，PDA培养基配方为马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15-20g、自来水1000mL，光照条件下室温25℃进行培养；

C、菌株基因组DNA提取：

采用E.Z.N.A^TM HP Fungal DNA Kit试剂盒，取步骤B中培养好的菌丝在液氮保护下研磨成粉状物，粉状物中加600μL的CPL缓冲液，加10μLβ-巯基乙醇；65℃水浴30min，水浴处理期间取出摇晃2次，加600μL氯仿制得提取混合液，提取混合液与无水乙醇按体积比24:1混合，转速12000r/min下离心处理5min；

吸取上清液300μL至新的离心管中，加150μL CXD缓冲液，再加300μL无水乙醇制得上清混合液，将上述750μL上清混合液加到HiBind DNA柱中，转速12000r/min下离心处理1min，留取沉淀物弃掉滤液；

沉淀物中加入650μL SPW洗液，转速12000r/min下离心处理1min；再加入650μLSPW洗液，转速12000r/min下离心处理1min，留取沉淀物弃掉滤液，沉淀物放入新的离心管中转速12000r/min下离心处理1min；

将洗涤后的沉淀物转入新的离心管中，加入预热65℃的Elution缓冲液100μL，转速12000r/min下离心处理2min，最后转速12000r/min下离心处理1min溶解DNA制得DNA模板；

D、病原菌ITS序列的扩增及LAMP引物的设计：

对枸杞根腐病菌的溶解DNA中ITS序列进行扩增、克隆、测序，获得其病菌尖孢镰孢菌的ITS序列，采用LAMP设计软件primer software PrimerExplorer V4进行引物设计，包括2条外引物F3和B3，2条内引物FIP、BIP；其序列分别为：

F3：5’-GTCCGAAAATTTTGCGGTGC-3’；

B3：5’-TTCCAGTGGTTA GTGACTGC-3’；

FIP：5’-AGTGGCGGGGTAAGATACCCC-3’；

BIP：5’-GCTTGCCCTGTTCCCACAAAAC-3’；

E、LAMP反应体系的建立：

在60～80℃范围内进行LAMP反应，反应时间20min-1h，LAMP反应体系为10×IsothermalAmplification Buffe 1～3μL、100mmol/L MgSO₄ 0.5～2μL、内引物FIP0.5～1.5μL、内引物BIP 0.5～1.5μL、外引物F3 0.5～1.5μL、外引物B3 0.5～1.5μL、100mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸dNTP 2.0～4.0μL、DNA模板2.0～4.0μL，8 000U/mL的Bst 2.0DNA聚合酶0.5～1.5μL、加ddH₂O 8.0～11.0μL至总体系25μL；

F、扩增结果判断方法：

反应结束后取3μL产物，用质量浓度2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，出现连续阶梯状条带，则判定为阳性，检出枸杞根腐病尖孢镰孢菌；未出现条带，则判定为阴性，未检出枸杞根腐病尖孢镰孢菌。

进一步的，上述的一种检测枸杞根腐病尖孢镰孢菌的环介导等温扩增检测方法，所述步骤E中，是以65℃进行LAMP反应，反应时间1h。

进一步的，上述的一种检测枸杞根腐病尖孢镰孢菌的环介导等温扩增检测方法，所述步骤E中，是以80℃进行LAMP反应，反应时间20min。

进一步的，上述的一种检测枸杞根腐病尖孢镰孢菌的环介导等温扩增检测方法，所述步骤F中，还可加入0.5μL荧光染料SYBR Green I，通过肉眼观察LAMP反应液是否发生颜色变化来判断结果，阳性反应为黄绿色，检出枸杞根腐病尖孢镰孢菌，阴性反应为橘色，未检出枸杞根腐病尖孢镰孢菌。

本发明的第三个目的是提供了上述一种检测枸杞根腐病尖孢镰孢菌的环介导等温扩增检测方法的特异性验证方法，是选取多个地区的枸杞根腐病菌制备DNA模板，以ddH₂O替代目标菌的DNA模板为阴性对照，以尖孢镰孢菌相近种茄病镰孢菌Fusariumsonali和其他2个非镰孢菌Phytophthora infestans、Rhizoctonia solani的基因组DNA作为对照组，分别进行LAMP反应，观察反应管颜色变化；所述多个地区分别为甘肃省靖远县、景泰县、武威市、玉门市、宁夏中卫。

本发明的第四个目的是提供了上述一种检测枸杞根腐病尖孢镰孢菌的环介导等温扩增检测方法的灵敏度验证方法，是采用10倍浓度系列稀释法将提取的枸杞根腐病尖孢镰孢菌的DNA模板进行梯度稀释，使其DNA模板质量浓度梯度依次为100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL和10pg/μL，分别取2μL作为模板进行LAMP反应，观察反应管颜色变化。

本发明的第五个目的是提供了上述一种检测枸杞根腐病尖孢镰孢菌的环介导等温扩增检测方法的田间验证方法，是于田间随机选取样品200mg病组织制备DNA将其作为模板进行LAMP扩增，观察反应管颜色变化。

本发明的第六个目的是提供了上述一种检测枸杞根腐病尖孢镰孢菌的环介导等温扩增检测方法的土壤病菌验证方法，是取步骤B中病原菌菌株尖孢镰孢菌的孢子制备孢子悬浮液；取不含尖孢镰孢菌的土样每份0.25g，放入2mL的EP管中，EP管中分别添加不同数量的孢子10 000、1 000、100、10、1个，按照E.Z.N.A^TM.HP Fungal DNA Kit提取试剂盒说明书提取土壤样品总DNA，将其作为模板进行LAMP扩增，并以尖孢镰孢菌纯DNA作为阳性对照，灭菌水作为阴性对照，观察反应管颜色变化。

本发明的有益效果为：

1、引物特异性强：

在LAMP体系中，4条引物特异性识别靶标基因的6个区域，而在PCR体系中只有2条引物识别2个区域。本发明专利应用LAMP设计软件设计4条引物，包括2条外引物F3、B3和2条内引物FIP、BIP，5个不同地理来源的枸杞根腐病尖孢镰孢菌LAMP检测均呈黄绿色(阳性)，而对照和其他病原菌均呈橘色(阴性)，电泳检测没有条带。应用LAMP设计4条引物，实现上述效果。同时通过显色方法直接进行比对判断，大幅提升检测准确性。

2、检测灵敏度高：

LAMP技术检测灵敏度比普通PCR技术高10～1000倍。本发明专利灵敏度验证结果表明，LAMP反应液检测灵敏度在DNA水平达到10pg。

3、反应速度快：

PCR一般需要3～6h,本发明专利优化的LAMP反应体系最佳反应程序为65℃1h，80℃20min。

4、直接用肉眼观察结果：

本发明专利LAMP技术在反应完成后加入荧光染料SYBR Green I，通过肉眼观察LAMP反应液是否发生颜色变化来判断结果，阳性反应为黄绿色，阴性反应为橘色。

5、准确性高：

本发明专利中，扩增产物的阴阳性，通过加入荧光染料SYBR Green I颜色变化直接判断。

6、不易污染：

荧光染料SYBR Green I可以在LAMP反应前加入到反应液中，可以有效避免反应后开盖加入荧光染料造成的污染问题。

7、对疑似病害样本直接检测：

本发明专利LAMP技术对疑似病害样本提取的DNA进行检测，只需要提取枸杞发病部位的总DNA就可以检测到尖孢镰孢菌的有无，该技术能够检测出枸杞发病组织中的尖孢镰孢菌，排除了病害样本上含有多种微生物，手工不易分离纯化到目标菌的人为因素影响。

8、土壤中检测的灵敏度高：

本发明专利LAMP技术在土壤中检测的灵敏度为10个尖孢镰孢菌孢子/0.25g土壤，土壤检测灵敏度很高。

综上所述，本发明专利在尖孢镰孢菌ITS特异序列基础上，建立了尖孢镰孢病菌LAMP简便、灵敏、快速和准确的方法，LAMP反应液检测灵敏度在DNA水平达到10pg/μL，土壤中检测的灵敏度为10个尖孢镰孢菌孢子/0.25g土壤。该发明专利为生产上枸杞根腐病尖孢镰孢菌的诊断和防治提供重要的实用价值。

附图说明

图1显示为尖孢镰孢菌LAMP反应体系的建立示意图。

其中，1为尖孢镰孢菌LAMP反应液，2为对照产物。

图2显示为尖孢镰孢菌LAMP特异性检测示意图。

其中，1、靖远县；2、景泰县；3、武威市；4、Rhizoctonia solani；5、玉门市；6、Phytophthora infestans；7、Fusarium sonali；8、宁夏中卫；9、阴性对照。

图3显示为尖孢镰孢菌LAMP灵敏度检测示意图。

其中，1～5：浓度依次为100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL；6：阴性对照。

图4显示为枸杞根腐病病组织LAMP检测示意图。

其中，1～7：发病样品；8：阴性对照；9：阳性对照。

图5显示为土壤中尖孢镰孢菌的检测示意图。

其中，1号：阳性对照；2～6号：10 000、1 000、100、10、1个孢子悬浮液；7号：阴性对照。

具体实施方式

实施例1：

枸杞根腐病尖孢镰孢菌环介导等温扩增检测方法，包括如下步骤：

A、病样采集

采集枸杞根腐病病株，在室内以常规方法分离病原菌，病原菌于4℃下保存；

B、菌株培养

病原菌菌株培养在PDA培养基上，PDA培养基配方为马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15-20g、自来水1000mL，光照条件下室温25℃进行培养；

C、菌株基因组DNA提取

采用E.Z.N.A^TM HP Fungal DNA Kit试剂盒，取步骤B中培养好的菌丝在液氮保护下研磨成粉状物，粉状物中加600μL的CPL缓冲液，加10μLβ-巯基乙醇；65℃水浴30min，水浴处理期间取出摇晃2次，加600μL氯仿制得提取混合液，提取混合液与无水乙醇按体积比24:1混合，转速12000r/min下离心处理5min；

吸取上清液300μL至新的离心管中，加150μL CXD缓冲液，再加300μL无水乙醇制得上清混合液，将上述750μL上清混合液加到HiBind DNA柱中，转速12000r/min下离心处理1min，留取沉淀物弃掉滤液；

沉淀物中加入650μL SPW洗液，转速12000r/min下离心处理1min；再加入650μLSPW洗液，转速12000r/min下离心处理1min，留取沉淀物弃掉滤液，沉淀物放入新的离心管中转速12000r/min下离心处理1min；

将洗涤后的沉淀物转入新的离心管中，加入预热65℃的Elution缓冲液100μL，转速12000r/min下离心处理2min，最后转速12000r/min下离心处理1min溶解DNA制得DNA模板；

D、病原菌ITS序列的扩增及LAMP引物的设计

对枸杞根腐病菌的溶解DNA中ITS序列进行扩增、克隆、测序，获得其病菌尖孢镰孢菌的ITS序列，采用现有LAMP设计软件primer software PrimerExplorer V4进行引物设计，包括2条外引物F3和B3，2条内引物FIP、BIP；其序列分别为，F3：GTCCGAAAATTTTGCGGTGC、B3：TTCCAGTGGTTA GTGACTGC、FIP：AGTGGCGGGGTAAGATACCCC、BIP：GCTTGCCCTGTTCCCACAAAAC。

E、LAMP反应体系的建立

在60～80℃范围内进行LAMP反应，反应时间1h，LAMP反应体系为10×IsothermalAmplification Buffe 1～3μL、100mmol/L MgSO₄ 0.5～2μL、内引物FIP0.5～1.5μL、内引物BIP 0.5～1.5μL、外引物F3 0.5～1.5μL、外引物B3 0.5～1.5μL、100mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸dNTP 2.0～4.0μL、DNA模板2.0～4.0μL，8 000U/mL的Bst 2.0DNA聚合酶0.5～1.5μL、加双蒸水ddH₂O 8.0～11.0μL至总体系25μL；

F、扩增结果判断方法

反应结束后取3μL产物，用质量浓度2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，若出现连续阶梯状条带，则判定为阳性，检出枸杞根腐病尖孢镰孢菌；未出现条带，则判定为阴性，未检出枸杞根腐病尖孢镰孢菌；或

加入0.5μL荧光染料SYBR Green I，通过肉眼观察LAMP反应液是否发生颜色变化来判断结果，阳性反应为黄绿色，检出枸杞根腐病尖孢镰孢菌，阴性反应为橘色，未检出枸杞根腐病尖孢镰孢菌。

步骤E中，可于65℃或80℃进行LAMP反应，反应时间1h。

枸杞根腐病尖孢镰孢菌环介导等温扩增检测的特异性验证方法，包括如下步骤：

G、尖孢镰孢菌LAMP检测体系的特异性验证

选取多个不同地区的枸杞根腐病菌制备DNA模板，以ddH₂O替代目标菌的DNA模板为阴性对照，以尖孢镰孢菌相近种茄病镰孢菌Fusarium sonali和其他2个非镰孢菌Phytophthorainfestans、Rhizoctonia solani的基因组DNA作为对照组，分别进行LAMP反应，观察反应管颜色变化。

枸杞根腐病尖孢镰孢菌环介导等温扩增检测的特异性验证方法，所述选取多个不同地区的枸杞根腐病菌制备DNA模板，多个不同地区包括甘肃省靖远县、景泰县、武威市、玉门市、宁夏中卫。

枸杞根腐病尖孢镰孢菌环介导等温扩增检测的灵敏度验证方法，包括如下步骤：

H、尖孢镰孢菌LAMP检测体系的灵敏度验证

采用10倍浓度系列稀释法将提取的枸杞根腐病尖孢镰孢菌的DNA模板进行梯度稀释，使其DNA模板质量浓度梯度依次为100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL和10pg/μL，分别取2μL作为模板进行LAMP反应观察反应管颜色变化。

枸杞根腐病尖孢镰孢菌环介导等温扩增检测的田间验证方法，包括如下步骤：

I、田间发病组织中尖孢镰孢菌的检测

田间随机选取样品200mg病组织制备DNA将其作为模板进行LAMP扩增，观察反应管颜色变化。

枸杞根腐病尖孢镰孢菌环介导等温扩增检测的土壤病菌验证方法，包括如下步骤：

J、土壤中尖孢镰孢菌检测的灵敏度

取步骤B中病原菌菌株尖孢镰孢菌的孢子制备孢子悬浮液。取不含尖孢镰孢菌的土样每份0.25g，放入2mL的EP管中，EP管中分别添加不同数量的孢子10 000、1 000、100、10、1个，按照E.Z.N.A^TM.HP Fungal DNA Kit提取试剂盒说明书提取土壤样品总DNA，将其作为模板进行LAMP扩增，并以尖孢镰孢菌纯DNA作为阳性对照，灭菌水作为阴性对照，观察反应管颜色变化。

实施例2：

实施效果1 LAMP引物设计及序列

应用LAMP设计软件进行引物设计，包括2条外引物F3和B3，2条内引物FIP、BIP；其序列分别为，F3：GTCCGAAAATTTTGCGGTGC、B3：TTCCAGTGGTTA GTGACTGC、FIP：AGTGGCGGGGTAAGATACCCC、BIP：GCTTGCCCTGTTCCCACAAAAC。

实施效果2 LAMP反应体系的建立

优化后用于检测枸杞根腐病尖孢镰孢菌的LAMP最佳反应体系25μL：10×IsothermalAmplification Buffe 2.5μL，100mM MgSO₄ 1.5μL，FIP Primer 1μL，BIPPrimer 1μL，F3Primer 1μL，B3Primer 1μL，10mM dNTP 3.5μL，模板DNA 2.5μL，8 000U/mL的Bst 2.0DNA聚合酶1μL，ddH₂O 10μL。通过反应温度进行优化，确定LAMP引物最佳反应温度为65℃。反应程序为：65℃1h，80℃20min。肉眼观察尖孢镰孢菌LAMP反应液阳性为黄绿色，而对照产物为橘色，呈阴性(图1)。

实施效果3 特异性检测

5个不同地理来源的枸杞根腐病尖孢镰孢菌LAMP检测均显示黄绿色，而阴性对照(CK)和其它3个病原菌LAMP检测均显示橘色(图2)。以上结果表明，该LAMP引物能够特异性的检测不同地理来源的枸杞根腐病尖孢镰孢菌。

实施效果4 灵敏度验证

以10pg为模板时，反应产物仍然可显示黄绿色(图3)，说明该LAMP反应体系可以检测到10pg的尖孢镰孢菌DNA。

实施效果5 田间发病组织中尖孢镰孢菌的检测

7份枸杞根腐病疑似病害样本提取的DNA检测发现，6份为阳性(图4)。同时对阳性的样本进行组织分离，分离获得的菌株经形态学观察和ITS测序鉴定为尖孢镰孢菌。以上结果表明，该技术能够排除寄主植物及其他非目标菌的干扰，快速、准确地从枸杞发病组织中检测出尖孢镰孢菌。LAMP检测技术用于尖孢镰孢菌的检测和枸杞根腐病的快速诊断。

实施效果6 土壤中尖孢镰孢菌的检测灵敏度

图5表明，1号阳性对照，2～5号尖孢镰孢菌10 000、1 000、100、10个孢子悬浮液LAMP检测均呈黄绿色的阳性反应，表明LAMP技术在土壤中检测的灵敏度为10个尖孢镰孢菌孢子/0.25g土壤。5号尖孢镰孢菌1个孢子悬浮液LAMP检测呈橘色的阴性反应，表明LAMP检测对土壤中1个尖孢镰孢菌孢子悬浮液未检测到，6号阴性对照呈现橘色。本方法可用于土壤中携带尖孢镰孢菌的高灵敏度检测。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。