一种具有预防和治疗炎症的生物多糖及其应用

文档序号：1762236 发布日期：2019-12-03 浏览：20次 >En<

阅读说明：本技术 一种具有预防和治疗炎症的生物多糖及其应用 (Biological polysaccharide for preventing and treating inflammation and application thereof ) 是由郭宏亮庄秀园郭瑞林檬王轩张雯叶榛朱勤健娄海霞于 2018-05-23 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种具有预防和治疗炎症的生物多糖及其应用。具体地,β-葡聚糖,尤其是裂褶菌β-葡聚糖,是一种预防和/或治疗炎症的功效成分,一方面是β-葡聚糖对巨噬细胞具有免疫激活作用,增强抵御能力,从而有效预防外界病原微生物的侵染；另一方面,对于炎症,β-葡聚糖可直接作用于免疫细胞,通过调节炎性细胞因子的分泌水平等方式,防止炎症过度而造成损伤。(The invention provides a biological polysaccharide for preventing and treating inflammation and application thereof. Specifically, the beta-glucan, especially the Schizophyllum commune beta-glucan, is an effective component for preventing and/or treating inflammation, on one hand, the beta-glucan has an immune activation effect on macrophages and enhances the resistance capability, so that the infection of external pathogenic microorganisms is effectively prevented; on the other hand, for inflammation, beta-glucan can directly act on immune cells, and prevent injury caused by excessive inflammation by means of regulating secretion level of inflammatory cytokines and the like.)

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种具有预防和治疗炎症的生物多糖及其应用。

背景技术

炎症，就是平时人们所说的“发炎”，是机体对于刺激的一种防御反应，表现为红、肿、热、痛和功能障碍。炎症，可以是感染引起的感染性炎症，也可以不是由于感染引起的非感染性炎症。通常情况下，炎症是有益的，是人体的自动的防御反应，但是有的时候，炎症也是有害的，例如对人体自身组织的攻击、发生在透明组织的炎症等等。

巨噬细胞是一种位于组织内的白血球，源自单核细胞，而单核细胞又来源于骨髓中的前体细胞。巨噬细胞和单核细胞皆为吞噬细胞，在脊椎动物体内参与非特异性防卫(先天性免疫)和特异性防卫(细胞免疫)。它们的主要功能是以固定细胞或游离细胞的形式对细胞残片及病原体进行噬菌作用(即吞噬以及消化)，并激活淋巴球或其他免疫细胞，令其对病原体作出反应。

本领域迫切需要开发一种能有效预防和治疗炎症的药物。

发明内容

本发明的目的是提供一种能有效预防和/或治疗炎症的药物。

本发明的另一目的是提供一种具有预防和治疗炎症的生物多糖及其应用。

本发明的第一方面，提供了一种β-葡聚糖的用途，用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于(a)激活免疫细胞；和/或(b)促进免疫细胞增殖。

在另一优选例中，所述激活免疫细胞包括激活巨噬细胞，较佳地包括刺激巨噬细胞免疫活化。

在另一优选例中，所述免疫细胞为巨噬细胞。

在另一优选例中，所述制剂或组合物用于激活免疫细胞中的MAPK信号通路和/或NF-κB信号通路。

在另一优选例中，所述免疫细胞为RAW264.7巨噬细胞。

在另一优选例中，所述激活免疫细胞MAPK信号通路包括促进MAPK信号通路中的ERK、p38和/或JNK的磷酸化。

在另一优选例中，所述激活免疫细胞NF-κB信号通路包括促进IKKβ和/或p65蛋白的磷酸化。

在另一优选例中，所述β-葡聚糖为β-D-葡聚糖。

在另一优选例中，所述β-葡聚糖为β-1,3-葡聚糖，优选地，具有β-1,6-分支的β-1,3-葡聚糖。

在另一优选例中，所述β-葡聚糖的结构如式I所示，

其中，l为0-50的整数，较佳地0-10，更佳地0-3，更佳地1-2，更佳地1；m为≥0的整数，较佳地为0-19，较佳地为0-4，更佳地为0-1，更佳地为0；n为≥3的整数，较佳地为30-60000，更佳地100-10000。

在另一优选例中，所述β-葡聚糖的分支度(DB)为0.02-0.8，较佳地0.1-0.5，较佳地0.25-0.4。

在另一优选例中，所述β-葡聚糖的侧链的单糖单元的平均数量≤20，较佳地≤5，较佳地≤3，更佳地≤1.5，更佳地为1。

在另一优选例中，所述β-葡聚糖包括具有三螺旋立体结构的β-葡聚糖。

在另一优选例中，所述三螺旋立体结构的β-葡聚糖的含量为80％，90％，95％，按β-葡聚糖的总摩尔量计。

在另一优选例中，所述β-葡聚糖的β-1,3-主链为三螺旋立体结构的主体。

在另一优选例中，所述β-葡聚糖的β-1,6-分支位于三螺旋立体结构的外侧。

在另一优选例中，所述β-葡聚糖的分子量≥2kD，较佳地2kD-40000kD，更佳地20kD-20000kD。

在另一优选例中，所述β-葡聚糖的分子量可以为5kD-35000kD；10kD-30000kD；50kD-25000kD；100kD-20000kD；200kD-18000kD；400kD-16000kD；500kD-14000kD；1000kD-12000kD；2000kD-4000kD；3000kD-5000kD；4000kD-6000kD；5000kD-7000kD；6000kD-8000kD；7000kD-9000kD；或者8000kD-10000kD。

在另一优选例中，所述β-葡聚糖选自下组：裂褶菌β-葡聚糖、香菇β-葡聚糖、小核菌β-葡聚糖、灰树花β-葡聚糖、侧耳多糖、蘑菇β-葡聚糖、酵母β-葡聚糖、燕麦β-葡聚糖、或其组合。

在另一优选例中，所述β-葡聚糖为裂褶菌β-葡聚糖。

在另一优选例中，所述香菇β-葡聚糖为每5个β-1,3-的主链，带有2个β-1,6-的分支，且每个分支1个葡萄糖残基的β-葡聚糖。

在另一优选例中，所述β-葡聚糖的纯度≥70％，较佳地≥90％，更佳地≥95％，更佳地≥99％。

在另一优选例中，所述β-葡聚糖具有良好的稳定性。

在另一优选例中，所述β-葡聚糖呈固态形式或液态形式，如β-葡聚糖固体颗粒或粉末、或β-葡聚糖水溶液。

在另一优选例中，所述β-葡聚糖颗粒或粉末的粒径≤20mm，较佳地0.001-10mm，更佳地0.01-5mm，更佳地0.1-2mm。

在另一优选例中，所述β-葡聚糖为完全水溶的β-葡聚糖。

在另一优选例中，所述β-葡聚糖(颗粒或粉末)具有良好的水溶性和/或天然可溶性。

在另一优选例中，所述β-葡聚糖(颗粒或粉末)在25℃水(100g)中的溶解度≥0.0001g，较佳地0.01-50g，更佳地0.1-10g。

在另一优选例中，所述β-葡聚糖(颗粒或粉末)在25℃水(100g)中的溶解度可以为0.1-100g；0.2-90g；0.5-80g；1-50g；或者，所述溶解度可以为0.1-0.3g；0.2-0.4g；0.3-0.5g；0.4-0.6g；0.5-0.7g；0.6-0.8g；0.7-0.9g；0.8-1g；或者1-3g；2-4g；3-5g；4-6g；5-7g；6-8g；7-9g；8-10g。

在另一优选例中，所述β-葡聚糖溶液为β-葡聚糖在水中的溶液，即β-葡聚糖水溶液。

在另一优选例中，所述β-葡聚糖(水)溶液粘度大；较佳地，质量浓度为0.5％的β-葡聚糖水溶液(25℃时)粘度≥40mPa·s，更佳地100-10000mPa·s，更佳地500-2000mPa·s。

在另一优选例中，所述质量浓度为0.5％的β-葡聚糖水溶液(25℃)粘度可以为50-10000mPa·s；100-9000mPa·s；200-8000mPa·s；300-7000mPa·s；400-6000mPa·s；450-5000mPa·s；500-5000mPa·s；550-4000mPa·s；600-3000mPa·s；650-2000mPa·s；700-1500mPa·s。

在另一优选例中，所述质量浓度为1％的β-葡聚糖的水溶液具有高澄清度或高透光率，所述质量浓度为1％的β-葡聚糖水溶液的透光率≥50％，较佳地≥80％，较佳地≥85％，更佳地≥95％；

在另一优选例中，所述β-葡聚糖溶液具有良好的稳定性。

在另一优选例中，所述制剂或组合物含有(a)β-葡聚糖；以及任选的(b)药学上、食品学上、化妆品学上、或器械类可接受的载体或赋形剂。

在另一优选例中，所述制剂或组合物含有(a)裂褶菌β-葡聚糖；以及任选的(b)药学上、食品学上、化妆品学上、或器械类可接受的载体或赋形剂。

在另一优选例中，所述制剂或组合物含有0.0001-99wt％，较佳地0.001-90wt％，更佳地0.01-50wt％，更佳地0.05-10wt％的β-葡聚糖，按制剂或组合物的总重量计。

在另一优选例中，所述β-葡聚糖在所述制剂或组合物中的质量浓度为≥1μg/mL，具体可以为1μg/mL-200mg/mL，或者1μg/mL-5mg/mL，或者1μg/mL-1mg/mL。

在另一优选例中，所述制剂或组合物还用于增强皮肤免疫力或主动防御功能。

在另一优选例中，所述制剂或组合物还用于预防和/或治疗皮肤黏膜炎症或其他皮肤炎性疾病。

在另一优选例中，所述制剂或组合物还用于预防和/或治疗选自下组的皮肤问题：干燥、红血丝、过敏、炎症、细纹、色斑、出油、或其组合。

在另一优选例中，所述组合物或制剂的剂型为固体剂型、半固体剂型、或液体剂型，如溶液、凝胶、膏霜、乳液等。

在另一优选例中，所述组合物为药物组合物或化妆品组合物，较佳地为外用药物剂型。

在另一优选例中，所述制剂为外用制剂或透皮制剂(如外用溶液剂、软膏剂、贴剂等)。

在另一优选例中，所述制剂或组合物包括化妆品、食品、医疗器械或药品。

在另一优选例中，所述制剂或组合物还用于(a)促进所述免疫细胞分泌NO，和/或(b)促进或上调所述免疫细胞中的iNOS表达。

在另一优选例中，所述免疫细胞为巨噬细胞。

在另一优选例中，所述促进巨噬细胞分泌NO具有平台效应。

在另一优选例中，所述“平台效应”指当β-葡聚糖在一定浓度以上，较佳地β-葡聚糖浓度≥30μg/mL时，更佳地40-500μg/mL，更佳地50-300μg/mL，促进巨噬细胞分泌NO作用可维持在特定的水平。

在另一优选例中，所述制剂或组合物用于促进巨噬细胞分泌NO水平达到适量浓度，所述适量指不会引起炎症、免疫紊乱或对正常细胞产生毒害，较佳地≤5000μg/mL，更佳地1-1000μg/mL。

本发明的第二方面，提供了一种β-葡聚糖的用途，用于制备细胞因子的促进剂，或用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于促进或上调细胞中的细胞因子表达，其中所述的细胞因子为免疫相关细胞因子。

在另一优选例中，所述β-葡聚糖为裂褶菌β-葡聚糖。

在另一优选例中，所述β-葡聚糖为完全水溶的β-葡聚糖。

在另一优选例中，所述β-葡聚糖具有选自下组一个或多个特征：

(1)所述β-葡聚糖的纯度≥70％，较佳地≥90％，更佳地≥95％，更佳地≥99％；

(2)所述β-葡聚糖具有良好的水溶性、复溶性和/或天然可溶性；

(3)所述β-葡聚糖(固体颗粒或粉末)在25℃水中的溶解度≥0.0001g/100g水，较佳地0.01-50g/100g水，更佳地0.1g-10g/100g水；

(4)所述β-葡聚糖的水溶液具有高澄清度或高透光率；优选地，所述质量浓度为1％的β-葡聚糖水溶液的透光率≥50％，较佳地≥80％，较佳地≥85％，更佳地≥95％；

(5)所述β-葡聚糖溶液粘度大；优选地，质量浓度为0.5％的β-葡聚糖水溶液(25℃时)粘度≥40mPa·s，更佳地100-10000，更佳地600-2000mPa·s；

(6)所述β-葡聚糖的水溶液具有良好的稳定性；和/或

(7)所述β-葡聚糖的分子量≥2kD，较佳地2kD-40000kD，更佳地20kD-20000kD。

在另一优选例中，所述细胞因子来自哺乳动物。

在另一优选例中，所述哺乳动物包括人和非人哺乳动物，较佳地包括啮齿动物(如小鼠、大鼠)、灵长动物(如人)。

在另一优选例中，所述细胞因子包括免疫细胞分泌或表达的细胞因子。

在另一优选例中，所述细胞因子包括巨噬细胞分泌或表达的细胞因子。

在另一优选例中，所述细胞因子选自下组：TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、趋化因子MCP-1、CXCL10、或其组合。

在另一优选例中，所述促进剂包括促进所述细胞因子的表达，或提高所述细胞因子的表达量。

本发明的第三方面，提供了一种体外免疫激活免疫细胞和/或促进免疫细胞增殖的方法，所述方法包括步骤：在β-葡聚糖存在下，培养免疫细胞，从而激活免疫细胞和/或促进免疫细胞增殖。

在另一优选例中，所述免疫细胞为巨噬细胞。

在另一优选例中，所述β-葡聚糖的浓度≥30μg/mL时，更佳地40-500μg/mL，更佳地50-200μg/mL。

在另一优选例中，所述方法为非治疗性和非诊断性的。

本发明的第四方面，提供了一种β-葡聚糖的用途，用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于

(a)促进个体的炎症反应而应对疾病，其中所述个体是无炎症或无过度炎症的；和/或(b)预防和/或治疗过度炎症或炎性疾病。

在另一优选例中，所述β-葡聚糖为裂褶菌β-葡聚糖。

在另一优选例中，所述β-葡聚糖为完全水溶的β-葡聚糖。

在另一优选例中，所述β-葡聚糖具有选自下组一个或多个特征：

(1)所述β-葡聚糖的纯度≥70％，较佳地≥90％，更佳地≥95％，更佳地≥99％；

(2)所述β-葡聚糖具有良好的水溶性、复溶性和/或天然可溶性；

(3)所述β-葡聚糖(固体颗粒或粉末)在25℃水中的溶解度≥0.0001g/100g水，较佳地0.01-50g/100g水，更佳地0.1g-10g/100g水；

(5)所述β-葡聚糖溶液粘度大；优选地，质量浓度为0.5％的β-葡聚糖水溶液(25℃时)粘度≥40mPa·s，更佳地100-10000，更佳地600-2000mPa·s；

(6)所述β-葡聚糖的水溶液具有良好的稳定性；和/或

(7)所述β-葡聚糖的分子量≥2kD，较佳地2kD-40000kD，更佳地20kD-20000kD。

在另一优选例中，所述个体包括人和非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述制剂或组合物用于预防炎症或炎性疾病。

在另一优选例中，所述炎症或炎性疾病包括由脂多糖引起的炎症或炎性疾病。

在另一优选例中，所述炎症包括皮肤(黏膜)炎症或其他皮肤炎性疾病。

在另一优选例中，所述制剂或组合物用于消炎、减轻炎症反应、或预防或治疗过度免疫(过度炎症)。

在另一优选例中，所述炎症具有选自下组的一个或多个特征：

(a)巨噬细胞异常分泌NO；

(b)巨噬细胞中免疫相关细胞因子的异常表达；和/或

(c)巨噬细胞中的MAPK信号通路和/或NF-κB信号通路的异常活化。

在另一优选例中，所述异常分泌NO包括分泌过量NO、或NO的分泌异常增加(或急剧增加)，具体地NO的分泌高于正常水平。

在另一优选例中，所述细胞因子的异常表达包括所述细胞因子高表达或高于正常水平(或细胞因子mRNA表达水平异常提高或高于正常水平)。

在另一优选例中，所述细胞因子包括TNF-α、IL-1β、或其组合。

在另一优选例中，所述MAPK信号通路的异常活化包括ERK和/或p38的(异常)磷酸化。

在另一优选例中，所述NF-κB信号通路的异常活化包括IKKβ和/或p65蛋白的(异常)磷酸化。

本发明的第五方面，提供了一种β-葡聚糖的用途，用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于在过度炎症中：

(a)抑制巨噬细胞异常分泌NO；

(b)抑制巨噬细胞中免疫相关细胞因子的异常表达；和/或

(c)抑制巨噬细胞中的MAPK信号通路和/或NF-κB信号通路的异常活化。

在另一优选例中，所述细胞因子包括TNF-α、IL-1β、或其组合。

在另一优选例中，所述异常分泌、异常表达或异常活化是由脂多糖引起的。

在另一优选例中，所述抑制是在过度炎症之前、之中、和/或之后。

在另一优选例中，所述抑制包括预防和/或治疗。

在另一优选例中，所述制剂或组合物用于抑制、或降低巨噬细胞NO水平的(急剧)增加。

在另一优选例中，所述制剂或组合物用于抑制巨噬细胞中所述细胞因子(TNF-α和/或IL-1β)的高表达，或降低所述细胞因子的表达水平。

在另一优选例中，所述制剂或组合物用于抑制巨噬细胞中ERK和/或p38的磷酸化，或降低ERK和/或p38磷酸化水平。

在另一优选例中，所述制剂或组合物用于抑制巨噬细胞中IKKβ和/或p65蛋白的磷酸化，或降低IKKβ和/或p65蛋白磷酸化水平。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了实施例1中制备的裂褶菌β-葡聚糖的傅里叶变换红外光谱图。

图2显示了β-葡聚糖稳定性对比，左边一瓶为市售1.0％燕麦β-葡聚糖溶液，右边一瓶为本发明制备的1.0％裂褶菌β-葡聚糖。

图3为裂褶菌β-葡聚糖对RAW264.7巨噬细胞存活率的影响(与未经β-葡聚糖处理的空白对照组相比，*p<0.05，n＝6)。

图4为不同浓度的裂褶菌β-葡聚糖对RAW264.7巨噬细胞iNOS mRNA表达(A，n＝3)和NO释放(C，n＝4)的影响(与空白对照组相比，*p<0.05，**p<0.01)，其中NO释放量根据标准曲线(B)计算得到。

图5为不同浓度的裂褶菌β-葡聚糖对RAW264.7细胞因子TNF-α(A)、IL-1β(B)、IL-6(C)、IL-10(D)和趋化因子MCP-1(E)、CXCL10(F)mRNA表达的影响(与空白对照组相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；n＝3)。

图6为不同浓度的市售水分散性酵母β-葡聚糖对RAW264.7细胞因子TNF-α(A)和IL-1β(B)mRNA表达的影响(与空白对照组相比，*p<0.05；n＝3)。

图7为不同浓度的裂褶菌β-葡聚糖对RAW264.7巨噬细胞MAPK信号通路的影响。

图8为不同浓度的裂褶菌β-葡聚糖对RAW264.7巨噬细胞NF-κB信号通路的影响。

图9为不同浓度的裂褶菌β-葡聚糖预防后，脂多糖对RAW264.7细胞NO生成的影响(B，与空白对照组相比，**p<0.01；与脂多糖刺激组相比，##p<0.01；n＝4)，其NO的量根据标准曲线(A)计算得到。

图10为不同浓度的裂褶菌β-葡聚糖预防后，脂多糖对RAW264.7细胞因子TNF-α(A)和IL-1β(C)mRNA表达的影响，以及市售可溶性酵母β-葡聚糖预防后，脂多糖对TNF-α(B)和IL-1β(D)mRNA表达的影响(与空白对照组相比，**p<0.01；与脂多糖刺激组相比，#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001；n＝3)。

图11为不同浓度的裂褶菌β-葡聚糖预防后，脂多糖对RAW264.7巨噬细胞MAPK信号通路的影响。

图12为不同浓度的裂褶菌β-葡聚糖预防后，脂多糖对RAW264.7巨噬细胞NF-κB信号通路的影响。

图13为不同浓度的裂褶菌β-葡聚糖对脂多糖刺激后RAW264.7细胞因子TNF-α(A)、IL-1β(C)和IL-6(E)mRNA表达的治疗作用，以及市售分散性酵母β-葡聚糖对脂多糖刺激后RAW264.7细胞因子TNF-α(B)、IL-1β(D)和IL-6(F)mRNA表达的治疗作用(与空白对照组相比，*p<0.05，**p<0.01；与脂多糖刺激组相比，#p<0.05，##p<0.01；n＝3)。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，β-葡聚糖(优选地裂褶菌β-葡聚糖)，尤其是具有天然可溶性、高分子量、高粘度的裂褶菌β-葡聚糖，具有免疫刺激活性，并能够非常有效地预防和/或治疗炎症。实验表明，β-葡聚糖能够免疫激活巨噬细胞、促进巨噬细胞增殖。同时裂褶菌β-葡聚糖还能治疗或预防炎症或其他炎性疾病。在此基础上，完成了本发明。

本发明β-葡聚糖(优选地裂褶菌β-葡聚糖)是一种预防和/或治疗炎症的功效成分，一方面是β-葡聚糖对巨噬细胞具有免疫刺激作用，增强抵御能力，从而有效预防外界病原微生物的侵染，并且具有平台效应，不会过度刺激引起炎症、免疫紊乱或对正常细胞产生毒害；另一方面，对于炎症，β-葡聚糖可直接作用于免疫细胞，通过调节炎性细胞因子的分泌水平等方式，防止炎症过度而造成损伤。本发明β-葡聚糖激发细胞基础免疫功能(刺激巨噬细胞活化和增殖)，同时预防和/或治疗过度炎症反应，具有双向免疫调节功能，不会伤害患者正常细胞(如皮肤)或使其产生耐药性。

术语说明

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。

如本文所用，术语“完全水溶”指所述固态形式的β-葡聚糖，可以在水中完全溶解成为β-葡聚糖水溶液，即在25℃100g水中β-葡聚糖的溶解度≥0.0001g，较佳地0.01-50g，更佳地0.1g-10g。

如本文所用，术语“天然可溶性”指天然状态的β-葡聚糖本身所具有的、在水中完全溶解形成水溶液的性质。所述“天然状态的β-葡聚糖”，是指使用天然方法生产得到(如生物发酵)的β-葡聚糖，所述β-葡聚糖没有经过任何化学改性、并且没有经过任何物理的和/或化学的和/或生物的方法将其长链分子打断而降低其分子质量。在另一优选例中，本发明β-葡聚糖为天然状态的β-葡聚糖。

β-葡聚糖

β-葡聚糖是一种天然多糖，在自然环境中可以找到相当多种类的β-葡聚糖，通常存在于特殊种类的细菌、酵母菌、真菌(灵芝)的细胞壁中，也可存在于高等植物种子的包被中。β-葡聚糖的生产方法主要有两种，其一是从燕麦等谷物或蘑菇等子实体真菌中直接提取；其二是通过真菌或细菌的液体发酵，经由对发酵液进行提取加工，以获得β-葡聚糖。

如本文所用，“本发明β-葡聚糖”、“本发明生物多糖”可互换使用，主要是指本发明第一方面所述的β-葡聚糖，所述β-葡聚糖选自下组：裂褶菌β-葡聚糖、香菇β-葡聚糖、小核菌β-葡聚糖、灰树花β-葡聚糖、侧耳多糖、蘑菇β-葡聚糖、酵母β-葡聚糖、燕麦β-葡聚糖、或其组合；优选地裂褶菌β-葡聚糖。

如本文所用，“裂褶菌β-葡聚糖”指来源于裂褶菌的β-葡聚糖。

在另一优选例中，所述β-葡聚糖的结构如式I所示。

在另一优选例中，所述β-葡聚糖的分子量≥2kD，较佳地2kD-40000kD，更佳地20kD-20000kD。

在另一优选例中，所述β-葡聚糖的纯度≥70％，较佳地≥90％，更佳地≥95％，更佳地≥99％。

在另一优选例中，所述β-葡聚糖具有良好的稳定性。

在另一优选例中，所述β-葡聚糖呈固态形式或液态形式，如β-葡聚糖固体颗粒或粉末、或β-葡聚糖水溶液。

在另一优选例中，所述β-葡聚糖颗粒或粉末的粒径≤20mm，较佳地0.001-10mm，更佳地0.01-5mm，更佳地0.1-2mm。

在另一优选例中，所述β-葡聚糖(颗粒或粉末)具有良好的水溶性和/或天然可溶性。

在另一优选例中，所述β-葡聚糖(颗粒或粉末)在25℃水(100g)中的溶解度≥0.0001g，较佳地0.01-50g，更佳地0.1-10g。

在另一优选例中，所述β-葡聚糖溶液为β-葡聚糖在水中的溶液，即β-葡聚糖水溶液。

在另一优选例中，所述β-葡聚糖水溶液具有良好的稳定性。

在另一优选例中，所述β-葡聚糖来源于高等植物或者各种细菌、真菌。

本发明的实施例具体以裂褶菌的发酵产物为例，但不限于此。

NO是生物体内一种结构简单的双原子自由基，同时也是重要的信使分子，具有重要的生理功能。正常情况下，iNOS不表达，来源于内皮型NOS(eNOS)和神经型NOS(nNOS)的低水平的NO，对于机体基础生理功能的维持具有积极意义。免疫系统的激活，尤其是在机体受到炎性因子或病原体刺激后，巨噬细胞等免疫细胞内将出现iNOS的高表达，以及NO水平的增加。适量的NO可增强机体的天然免疫功能，如促进巨噬细胞发挥细胞毒作用，以抑制病原体的繁殖，同时也可调控免疫细胞和炎症细胞的增殖和凋亡。但是过量的NO，通常伴随着炎症和免疫紊乱等现象。局部NO含量过高，可能对附近正常细胞产生细胞毒作用，引起自身组织的损伤。因此NO水平的变化是巨噬细胞天然免疫活性的一个重要指标。

MAPK信号通路

MAPK信号通路参与机体的炎症反应过程。目前已经确定的MAPK信号通路主要有三条：细胞外信号调节激酶ERK信号通路，c-Jun N端激酶JNK信号通路和p38信号通路。每条信号通路都具有高度的特异性和独立的功能。当细胞受到炎性因子和/或外界刺激，相关通路蛋白的磷酸化水平增加，通过调控下游蛋白，使炎性相关基因表达增加，进而促进诱导性细胞因子和炎症介质的分泌和表达。可使用免疫印迹法检测相关蛋白的磷酸化水平。

NF-κB信号通路

NF-κB是炎症反应过程中重要的转录因子，参与调节机体的多种功能。细胞处于静息状态时，NF-κB存在于细胞质中与其抑制剂IκB结合，当细胞受到炎性因子、病原体等刺激时，NF-κB信号通路被激活，IκB被其激酶IKK磷酸化，最终被磷酸化的IκB通过泛素-蛋白酶体被降解。被释放出的游离NF-κB，进入细胞核，调控目的基因的转录。在炎症反应期间，NF-κB可通过上调炎性介质的表达，而在炎症反应中发挥重要作用。使用免疫印迹方法可检测NF-κB的p65亚基和IKKβ的磷酸化水平。

脂多糖

脂多糖是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，高浓度脂多糖是机体产生炎症的诱导因素之一，可引发一系列的炎症反应。脂多糖与宿主细胞发生相互作用，通过激活细胞内信号传递级联反应，而引起多种细胞因子和炎性介质水平的改变。实验室常采用脂多糖作为炎症反应刺激剂来建立细胞或动物的炎症模型，以研究目标物质的对炎症的预防和治疗作用。

制剂或组合物

本发明提供一种用于预防和/或治疗炎症的制剂或组合物，所述制剂或组合物含有(a)β-葡聚糖；以及任选的(b)药学上、化妆品学上、食品学上、或器械类可接受的载体或赋形剂。

在另一优选例中，所述制剂或组合物含有(a)裂褶菌β-葡聚糖；以及任选的(b)药学上、化妆品学上、食品学上、或器械类可接受的载体或赋形剂。

在另一优选例中，所述制剂或组合物含有0.0001-99wt％，较佳地0.001-90wt％，更佳地0.01-50wt％，更佳地0.05-10wt％的β-葡聚糖(优选地裂褶菌β-葡聚糖)，按制剂或组合物的总重量计。

在另一优选例中，所述β-葡聚糖在所述制剂或组合物中的质量浓度为≥1μg/mL，具体可以为1μg/mL-200mg/mlL，或者1μg/mL-5mg/mL，或者1μg/mL-1mg/mL。

本发明所述制剂或组合物中的“活性成分”是指本发明所述的β-葡聚糖(优选地裂褶菌β-葡聚糖)。

本发明所述的“活性成分”、制剂和/或组合物可用于预防和/或治疗炎症。

在另一优选例中，所述“活性成分”、制剂和/或组合物还用于预防和/或治疗皮肤黏膜炎症或其他皮肤炎性疾病的制剂或组合物。

在另一优选例中，所述“活性成分”、制剂和/或组合物还用于预防和/或治疗：

(a)巨噬细胞异常分泌NO；

(b)巨噬细胞中免疫相关细胞因子的异常表达；和/或

(c)巨噬细胞中的MAPK信号通路和/或NF-κB信号通路的异常活化。

“安全有效量”指的是：活性成分的量足以明显改善病情或症状，而不至于产生严重的副作用。

通常，药物组合物含有1-2000mg活性成分/剂，更佳地，含有10-200mg活性成分/剂。较佳地，所述的“一剂”为一个药片或一支注射针剂。

“药学上可接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。

“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的活性成分以及它们之间相互掺和，而不明显降低活性成分的药效。

药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。

在另一优选例中，本发明β-葡聚糖可与大分子化合物或高分子通过非键合作用形成复合物。

在另一优选例中，本发明β-葡聚糖可通过化学键与大分子化合物或高分子相连接。所述大分子化合物可以是生物大分子如高聚糖、蛋白、核酸、多肽等。

本发明的活性成分或组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括但不限于：外敷、口服、瘤内、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)等。

固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。

在这些固体剂型中，活性成分与至少一种常规惰性赋形剂或载体混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分一种或多种混合：

(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；

(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和***胶；

(c)保湿剂，例如，甘油；

(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；

(e)缓溶剂，例如石蜡；

(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；

(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；

(h)吸附剂，例如，高岭土；和/或

(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。

胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。

所述的固体剂型还可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性成分的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。

液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性成分外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例如，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。

除了活性成分外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。

组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。

使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明组合物施用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为1～1000mg，较佳地10～200mg，更佳地20～100mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明组合物可以单独给药，或者与其他治疗药物联合给药(如配制在同一药物组合物中)。

本发明药物组合物也可以与已知的治疗或改进相似病状的其它药物联用。联合给药时，原来药物的给药方式和剂量保持不变，而同时或随后使用本发明药物组合物。药物联用也包括在重叠的时间段使用本发明药物组合物与其它一种或几种已知药物。当本发明药物组合物与其它一种或几种药物进行药物联用时，本发明药物组合物或已知药物的剂量可能比它们单独用药时的剂量较低。

本发明的主要优点包括：

(a)本发明β-葡聚糖(尤其是裂褶菌β-葡聚糖)能够非常有效地预防和/或治疗炎症，如皮肤黏膜炎症或其他皮肤炎性疾病；具体地，可以抑制巨噬细胞异常分泌NO、巨噬细胞中免疫相关细胞因子的异常表达、和/或巨噬细胞中的MAPK信号通路和/或NF-κB信号通路的异常活化。

(b)本发明β-葡聚糖的副作用非常低，不破坏皮肤表面菌群生态平衡，不会伤害患者正常细胞(皮肤)或使其产生耐药性。

(c)本发明β-葡聚糖不仅可以用于预防和/或治疗炎症，还可增强主动防御功能，抗菌、消炎和修复(如皮肤)，预防和/或治疗皮肤黏膜炎症或其他皮肤炎性疾病。本发明β-葡聚糖激发细胞基础免疫功能(刺激巨噬细胞活化和增殖)，同时预防和/或治疗过度炎症反应，具有双向免疫调节功能，不会伤害患者正常细胞(如皮肤)或使其产生耐药性。

(d)本发明β-葡聚糖为纯天然来源的生物多糖，具有天然可溶性。由于不需要经过任何化学和/或物理的改性或修饰，本发明β-葡聚糖完整保留了三螺旋的三维构象，这对于其功效的发挥至关重要。本发明β-葡聚糖具有极佳的稳定性，能够与大多数物质共存而保持其活性，因而应用领域广泛，可与其他治疗药物或者护肤品结合使用。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，部分如下表1-3所示：

表1所需抗体

名称	购买来源
		Phospho-Ser536NF-κB p65兔多克隆抗体	CST公司
Phospho-Tyr199IKKβ兔多克隆抗体	abcam公司
		IKKβ鼠多克隆抗体	Proteintech公司
ERK1/2兔多克隆抗体	Proteintech公司
		Phospho-Thr202/Tyr204ERK/MAPK兔多克隆抗体	Abgent公司
JNK,兔多克隆抗体	Proteintech公司
		Phospho-Thrl83/Tyrl85JNK1/2/3兔多克隆抗体	Abgent公司
p38兔多克隆抗体	Proteintech公司
		Phospho-Thr180/Tyr182p38MAPK兔多克隆抗体	Abgent公司

表2所需药品和试剂

表3所需引物

实施例1、β-葡聚糖的获得以及测定

本实施例仅以裂褶菌发酵获得的β-葡聚糖为例，但不限于此。

一、裂褶菌菌种发酵液的获得

下述实施例中的发酵液通过发酵裂褶菌菌种(裂褶菌Schizophyllum communeFr—1003，产品目录：38548^TM，购于美国模式菌种收集中心[ATCC])，具体如下：

1、裂褶菌菌种活化：将马铃薯200g/L、葡萄糖30g/L、氯化钠10g/L、琼脂20g/L制成平板培养基，把裂褶菌菌种接种到该平板培养基上，于25℃恒温培养箱内培养7天得到平板菌丝体；

2、种子活化：将马铃薯淀粉100g/L、葡萄糖40g/L、酵母浸膏2g/L、酵母浸粉2g/L、水制成的液体培养基装入摇瓶，装液量为1/3，取步骤1所得的平板菌丝体接种该摇瓶，于25℃恒温摇床内160rpm震荡培养培养7天，作为种子液；

3、发酵培养：将葡萄糖50g/L、蔗糖50g/L、黄豆粉(山东招远市温计食品有限公司)5g/L、酵母浸粉2g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、七水合硫酸镁0.5g/L、硫酸铵0.5g/L、硝酸钾6g/L和水制成的发酵培养基加入发酵罐中121℃灭菌15分钟，再将步骤2所得的种子液接种上述发酵罐中，25℃恒温300rpm搅拌4Lpm通气发酵培养8天，得到裂褶菌发酵液。

二、β-葡聚糖的分离纯化及β-葡聚糖溶液的制备

(1)将上述第一部分得到的裂褶菌发酵液与4倍体积的蒸馏水混合，60℃下浸煮8h，得到浸煮液；

(2)将步骤(1)得到的浸煮液在4,000rpm离心5min，取上清液；将上清液用300目的滤布负压过滤，取滤出清液待用，即为浸煮清液；

(3)将步骤(2)过滤后的浸煮清液加热至50℃，向其中同时加入200目的木质活性炭及8～16目的椰壳活性炭，每种活性炭的添加体积为浸煮清液体积的1％。于50℃，350rpm条件下持续搅拌4h，冷却后待用，得到混合有活性炭的浸煮清液；再将混合有活性炭的浸煮清液依次使用300目滤布及SCP-321#滤板(孔径大小约1.5μm)进行负压抽滤，取过滤后的清液待用；

(4)将Solarbio脂肪酶(L8070，酶活力100～400U/mg)溶于生理磷酸盐缓冲液中，按10U/mL的酶用量，将脂肪酶溶液加入步骤(3)制备的滤液中，搅拌均匀后40℃酶解2h；再将Solarbio中性蛋白酶(Z8030，酶活力>60U/mg)溶于生理磷酸盐缓冲液中，按60U/mL的酶用量，将中性蛋白酶溶液加入上述酶解液中，搅拌均匀后，40℃酶解2h。酶解结束后90℃水浴加热30min，以灭酶活，再以SCP-321#滤板(孔径大小约1.5μm)进行负压抽滤，取过滤后的清液待用；

(5)将步骤(4)过滤后的清液快速与95％浓度的食用乙醇混合(体积比为1：3)，搅拌，直至得到析出物；再将析出物重新溶解至原体积，后快速与95％浓度的食用乙醇混合(体积比为1：3)，搅拌，直至得到析出物；

(6)将步骤(5)得到的析出物置于带孔托盘中，使用电热烘箱40℃烘干，直至恒重，得干燥产物；

(7)将上述步骤(6)得到的β-葡聚糖干燥物粉碎，称取粉碎物5g，溶解于1,000mL超纯水中，维持600rpm搅拌2h，直至β-葡聚糖充分溶解，得到β-葡聚糖溶液；将上述β-葡聚糖溶液使用5μm滤膜进行负压抽滤，即可得到浓度为0.5％的高粘度、高透光率的β-葡聚糖溶液。

该质量浓度为0.5％的β-葡聚糖溶液在600nm波长(以分光光度计检测)下的透光率可以达到90％，40℃时粘度可达600mPa·s以上。

三、β-葡聚糖的鉴定与检测

1、β-葡聚糖的红外光谱鉴定

对上述0.5％的β-葡聚糖溶液进行鉴定，具体按照《中华人民共和国药典》(2010版)二部附录IV中方法C使用红外光谱法，将105℃烘干后的样品，使用傅里叶变换红外光谱仪进行全波长扫描。结果上述实施例1第二部分步骤(7)得到的0.5％溶液为β-葡聚糖溶液。

与酵母β-葡聚糖行业标准QBT 4572-2013中酵母β-葡聚糖的红外光谱图对比，官能团位置基本吻合。如图1所示，主要的官能团位置为：

1)3301cm^-1附近有较强，较宽的吸收峰(糖类O-H键伸缩振动吸收峰)

2)2921cm^-1附近有较弱的吸收峰(糖类C-H键伸缩振动吸收峰)

3)886cm^-1附近有较弱的吸收峰(糖类β构型特征振动吸收峰)

4)1076cm^-1附近有较强的吸收峰(糖类C-OH，C-O-C伸缩振动吸收峰)

傅里叶变换红外光谱测试结果表明，本实施例得到的产物为β-葡聚糖。

2、β-葡聚糖的含量检测

对上述实施例1第二部分步骤(6)得到的干燥产物进行β-葡聚糖定量检测，具体按照酵母β-葡聚糖行业标准QBT 4572-2013中酵母β-葡聚糖含量测定方法，将得到的β-葡聚糖干燥物样品研磨至直径1.0mm左右后进行。结果产物中β-葡聚糖含量为99.23％。

3、β-葡聚糖溶液的激素检测

对上述0.5％的β-葡聚糖溶液进行48项激素测定，具体按照《化妆品安全技术规范》(2015年版)第四章2.4雌三醇等7种组分第一法高压液相色谱-二极管阵列检测器法和GB/T24800.2-2009化妆品中四十一种糖皮质激素的测定液相色谱/串联质谱法和薄层层析法进行。结果上述实施例1第二部分步骤(7)得到的0.5％β-葡聚糖溶液中，未检出上述激素(结果见表4)。

表4 48项激素测定

4、β-葡聚糖溶液的粘度测定

按照实施例1第二部分步骤(7)的方法，配制0.3％、0.5％、0.8％、1.0％(质量体积比)的β-葡聚糖水溶液，于25℃时分别检测动力粘度。结果详见表5，随着β-葡聚糖含量的提高，各样品的粘度也递增，分别为472、740、2150和3100mPa·s。

取市售分散性(不溶于水)酵母β-葡聚糖颗粒(购自Wellmune公司)，准确称取2g，加入去离子水混合，并定容至200mL，得到质量体积比为1.0％的酵母β-葡聚糖混悬液，于25℃时检测动力粘度。结果该1.0％的酵母β-葡聚糖混悬液的动力粘度为0mPa·s(见表5)。

取市售可溶性酵母β-葡聚糖粉末(购自Wellmune公司)，准确称取2g，加入去离子水溶解，并定容至200mL，得到质量体积比为1.0％的酵母β-葡聚糖水溶液，于25℃时检测动力粘度。结果该1.0％的酵母β-葡聚糖水溶液的动力粘度为0mPa·s(见表5)。

上述动力粘度的测定方法如下：

(1)取200mL上述溶液样品，置于250mL烧杯中；

(2)将盛有上述溶液/混合液样品的烧杯置于水浴锅中，25℃保温1h；

(3)使用旋转粘度计，检测25℃下各样品的动力粘度。

5、β-葡聚糖溶液的透光率测定

按照实施例1第二部分步骤(7)的方法，配制0.3％、0.5％、0.8％、1.0％(质量体积比)的β-葡聚糖水溶液，于600nm波长处测定溶液透光率，结果如见表5所示，各样品的透光率分别为96.5％、93.1％、87.5％和81.1％。

取市售1.0％的燕麦β-葡聚糖溶液(购自Symrise公司)，于600nm波长处测定溶液透光率，结果透光率为59.7％(见表5)。

取市售分散性酵母β-葡聚糖颗粒，准确称取2g，加入去离子水混合，并定容至200mL，得到质量体积比为1.0％的酵母β-葡聚糖混悬液，于600nm波长处测定混悬液透光率，结果透光率仅为1.3％(见表5)。

取市售可溶性酵母β-葡聚糖粉末，准确称取2g，加入去离子水溶解，并定容至200mL，得到质量体积比为1.0％的酵母β-葡聚糖水溶液，于600nm波长处测定溶液透光率，结果透光率为68.4％(见表5)。

上述透光率的测定方法如下：

(1)取10mL上述溶液样品置于离心管中；

(2)1000rpm低速离心1min，以去除气泡(两种酵母β-葡聚糖溶液/悬液无气泡，未经离心处理)；

(3)小心取3mL至1cm玻璃比色皿内，避免气泡；

(4)使用分光光度计，以去离子水作为空白参照(去离子水的透光率为100％计)，于600nm波长处测定样品透光率。

6、β-葡聚糖溶液的稳定性测定

按照实施例1第二部分步骤(7)的方法，配制0.5％、0.8％、1.0％(质量体积比)的β-葡聚糖水溶液，加入防腐剂后，室温(未避光)放置24个月，观察溶液稳定性，并检测溶液动力粘度和透光率。结果，上述三种溶液状态均十分稳定，其粘度和透光率变化不大，其中透光率甚至有所提高(见图2、表5)。

取市售1.0％的燕麦β-葡聚糖溶液，室温(未避光)放置24个月，观察溶液稳定性，并检测溶液动力粘度和透光率。结果，该1.0％的燕麦β-葡聚糖溶液状态十分不稳定，室温放置3个月后就有固形物析出，导致其粘度和透光率无法检测(见图2、表5)。

表5各种β-葡聚糖溶液动力粘度数据

注：a为市售分散性酵母β-葡聚糖颗粒(不溶于水)，b为市售可溶性酵母β-葡聚糖粉末。

实施例2、β-葡聚糖的免疫激活作用

本实施例中，RAW264.7细胞(记载于“Eun-Hee Lee,Hyung-Min Kim.Activationof inducible nitric oxide synthase by human choriogonadotropin in RAW264.7cells.BBA-Molecular Cell Research,1997,1359(1):59-64”等论文中，公众也可以从美国ATCC等机构购买获得)按照下述方法进行培养及β-葡聚糖处理：

(1)将装有RAW264.7细胞的冻存管，37℃水浴至即将完全融化时，取出冻存管移至超净工作台内；

(2)在15mL离心管内加入4mL FBS培养液，将细胞的悬液吸至该离心管内，盖上管盖，1,000rpm离心4min后，小心吸弃上清液，并向离心管内加入FBS培养液1mL，吹打混匀；

(3)用血球计数板进行活细胞计数，稀释细胞悬液，移至培养皿，置于含5％CO₂培37℃养箱中；

(4)传代：每天传代1次；

(5)接板：将吹打下来的细胞制成细胞悬液，用血球计数板进行活细胞计数，以5×10⁵个/mL的细胞密度接种到细胞板中；

(6)β-葡聚糖处理：接板12h后，换液或加入含有不同浓度β-葡聚糖的细胞培养液一定时间，收样。

一、β-葡聚糖对RAW264.7细胞存活率的影响

采用细胞毒性实验检测：

(1)100_μL RAW264.7细胞悬液(5×10⁵/mL)接于96孔板中培养12h；

(2)每孔加入含有不同种类以及不同浓度β-葡聚糖的细胞培养液100_μL继续培养20h；以100_μL不含β-葡聚糖的细胞培养液为对照；

(3)加入MTT溶液(5mg/mL)，每孔20_μL，继续孵育4h；

(4)弃上清，加入100_μL DMSO充分溶解结晶，在波长490nm下检测OD值。

β-葡聚糖对RAW264.7巨噬细胞存活率的影响(n＝6)如图3所示，各个浓度的裂褶菌β-葡聚糖处理RAW264.7巨噬细胞24h，均不会对细胞产生毒性作用，相反，200_μg/mL的β-葡聚糖能够在一定程度上促进巨噬细胞的生长。结果表明，裂褶菌β-葡聚糖对巨噬细胞无细胞毒作用，反而有利于该细胞的存活率的提高。

二、β-葡聚糖对RAW264.7细胞一氧化氮(NO)分泌和诱导型NO合酶(iNOS)表达的影响

1、巨噬细胞iNOS mRNA表达水平的测定

1)细胞RNA抽提与反转录

以脂多糖为阳性对照，不同浓度β-葡聚糖(浓度分别为10、25、50和75_μg/mL)单独作用于RAW264.7巨噬细胞24h后，分别收集各组细胞，以检测iNOS mRNA表达情况。

(1)加入500_μL trizol吹打收取细胞样，放于-80℃冰箱过夜；

(2)RNA抽提：取出细胞trizol样，溶化后加入1/5氯仿，震荡混匀，室温静置5min后，冷冻离心机4℃12,000rpm离心15min；

(3)离心结束后，吸取上清(约180_μL)转移到新的EP管中，加入等体积异丙醇，轻轻混匀，室温静置10min，12,000rpm离心10min；

(4)弃去上清溶液，向剩下的沉淀加入1mL 75％预冷的乙醇，轻轻颠倒混匀，12,000rpm离心5min；

(5)弃去上清，室温挥发至RNA沉淀半透明，加入20-80μL 65℃预热的DEPC水进行溶解；

(6)使用紫外分光光度计测定RNA浓度，通过OD₂₆₀/OD₂₈₀数值及RNA电泳检测RNA是否降解；

(7)反转录：RNA浓度测定后，500ng RNA使用10μL体系进行反转录。根据试剂盒进行操作，其中5×PrimeScript Buffer 2μL，Oligo dT Primer、Random 6mers和PrimeScript RT Enzyme Mix分别为0.5μL，500ng RNA根据浓度计算出的体积，然后用DEPC水补足到10μL，混匀瞬离，37℃水浴锅中反转录15min，之后迅速置于85℃10s使酶失活。加水补足至50μL，此时即为cDNA，-20℃保存备用。本实验所用耗材等均为RNase Free。

2)荧光定量PCR实验

(1)25μL体系：2×UltraSYBR Mixture荧光染料12.5μL，DEPC水9.5μL，5μM的前后引物混合液(表3所示的因子的对应引物)2μL，cDNA 1μL；

(2)混匀瞬离，除去气泡；

(3)PCR仪设置反应程序：95℃10min预变性；95℃15s变性和60℃1min退火延伸，交替进行，共39个循环；60-95℃融解曲线分析，读板。

图4A为不同浓度的裂褶菌β-葡聚糖对RAW264.7巨噬细胞iNOS mRNA表达(n＝3)的影响，结果发现，随着β-葡聚糖浓度的增加，RAW264.7细胞iNOS的mRNA表达水平呈剂量依赖的方式递增(与未处理组相比，*p<0.05)。表明β-葡聚糖可显著提高巨噬细胞iNOS mRNA表达，裂褶菌β-葡聚糖具有显著的免疫激活作用。

2、细胞培养液中NO分泌水平测试

以脂多糖为阳性对照，不同浓度裂褶菌β-葡聚糖(浓度分别为10、25、50、75和100μg/mL)单独作用于RAW264.7巨噬细胞24h后，分别收集各组的培养上清液，以检测NO分泌情况。

(1)收集上述诱导后的细胞培养上清液100μL；

(2)提前取出Griess试剂盒，待其恢复至室温后开始进行实验；

(3)标准曲线的制作，用DMEM+10％FBS稀释标准品，标准品的稀释浓度选定为0、1、5、10、25、50、100μM；

(4)按50μL/孔的体积，向96孔板中加入标准品/样品；

(5)按50μL/孔的体积，向各孔中加入室温的Griess Reagent I；

(6)按50μL/孔的体积，向各孔中加入室温的Griess Reagent II；

(7)室温反应10min，540nm处测OD值。根据准曲线，计算出各组细胞培养上清液中NO水平。

图4B为NO检测标准曲线，根据该曲线，计算不同浓度的裂褶菌β-葡聚糖对RAW264.7巨噬细胞NO释放(图4C，n＝4；以脂多糖为阳性对照)的影响，结果发现，RAW264.7细胞培养液中的NO水平，在裂褶菌β-葡聚糖浓度处于50μg/mL以下时，呈剂量依赖性地递增(与未处理组相比，**p<0.01)；当裂褶菌β-葡聚糖以50-100μg/mL的浓度刺激该细胞株时，细胞NO分泌水平进入平台期，能够维持在一个较稳定的高水平状态。结果表明β-葡聚糖可显著促进巨噬细胞NO分泌，且这种促进作用可维持在一个特定的水平，裂褶菌β-葡聚糖具有显著的免疫激活作用。

三、β-葡聚糖对RAW264.7细胞因子mRNA表达的影响

活化的巨噬细胞具有分泌多种炎性细胞因子和趋化因子的能力，主要包括TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、CXCL10和MCP-1等。上述因子在机体免疫反应和炎症反应中具有重要作用。

1、RNA的抽提与反转录

以50ng/mL的脂多糖水溶液作为阳性对照，不同浓度裂褶菌β-葡聚糖(浓度分别为10、25、50和75μg/mL)或分散性酵母β-葡聚糖(浓度分别为1、10、25、50、75和100μg/mL)单独作用于RAW264.7巨噬细胞24h后，分别收集各组细胞，以检测各种细胞因子mRNA的表达情况。

(1)加入500μL trizol吹打收取细胞样，放于-80℃冰箱过夜；

(2)RNA抽提：取出细胞trizol样，溶化后加入1/5氯仿，震荡混匀，室温静置5min后，冷冻离心机离心，4℃12000rpm离心15min；

(3)离心结束后，吸取上清(约180μL)转移到新的EP管中，加入等体积异丙醇，轻轻混匀，室温静置10min，12000rpm离心10min；

(4)弃去上清溶液，向剩下的沉淀加入1mL 75％预冷的乙醇，轻轻颠倒混匀，12000rpm离心5min；

(5)弃去上清，室温挥发至RNA沉淀半透明，加入20-80μL 65℃预热的DEPC水进行溶解；

(6)使用紫外分光光度计测定RNA浓度，通过OD₂₆₀/OD₂₈₀数值及RNA电泳检测RNA是否降解；

(7)反转录：RNA浓度测定后，500ng RNA使用10μL体系进行反转录。根据试剂盒进行操作，其中5×PrimeScript Buffer 2μL，Oligo dT Primer、Random 6mers和PrimeScript RT Enzyme Mix分别为0.5μL，500ng RNA根据浓度计算出的体积，然后用DEPC水补足到10μL，混匀瞬离，37℃水浴锅中15min反转录，之后迅速置于85℃10s使酶失活。加水补足至50μL，此时即为cDNA，-20℃保存备用。本实验所用耗材等均为RNase Free。

2、荧光定量PCR实验

(1)25μL体系：2×UltraSYBR Mixture荧光染料12.5μL，DEPC水9.5μL，5μM的前后引物混合液(表3所示的因子的对应引物)2μL，cDNA 1μL；

(2)混匀瞬离，除去气泡；

(3)PCR仪设置反应程序：95℃10min预变性；95℃15s变性和60℃1min退火延伸，交替进行，共39个循环；60-95℃融解曲线分析，读板。

图5为不同浓度的裂褶菌β-葡聚糖对RAW264.7细胞因子和趋化因子mRNA表达的影响(以脂多糖为阳性对照)，结果显示，肿瘤坏死因子TNF-α(图5A)、白细胞介素IL-1β(图5B)、IL-6(图5C)、IL-10(图5D)和趋化因子MCP-1(图5E)、CXCL10(图5F)的mRNA表达量均呈增长的趋势，其中TNF-α、IL-6、IL-10、MCP-1和CXCL10在β-葡聚糖浓度低于75_μg/mL，IL-1β在β-葡聚糖浓度低于50_μg/mL时，均具有明显的剂量依赖性(与未处理组相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；n＝3)，结果表明β-葡聚糖可显著促进巨噬细胞免疫相关的各种细胞因子mRNA的表达，裂褶菌β-葡聚糖具有显著的免疫活化作用。

图6为不同浓度的分散性酵母β-葡聚糖对RAW264.7细胞因子TNF-α(图6A)和IL-1β(图6A)mRNA的表达的影响(以脂多糖为阳性对照)。结果表明，各浓度的分散性酵母β-葡聚糖均未能促进RAW264.7细胞这两种免疫相关细胞因子mRNA的表达。

四、β-葡聚糖对RAW264.7细胞MAPK信号通路的影响

1、免疫印迹分析相关试剂及配制

(1)RIPA裂解液(Radio Immuno Precipitation Assay,RIPA)

NaCl 4.35g，SDS 0.5g，Tris base 3.03g，Triton X-1005mL，10％脱氧胆酸钠25mL，调节pH至8.0即可。

(2)5×SDS上样缓冲液

SDS 5g，溴酚蓝0.2g，1M Tris HCl 12.5mL，甘油30mL，混合均匀后-20℃保存。使用前分装出950μL，加入50μLβ-巯基乙醇，混匀。

(3)10×电泳缓冲液

称取Tris base 33g，甘氨酸144g，SDS 10g，用超纯水定容至1L，后使用盐酸调pH至8.3。使用时用超纯水稀释至1×。

(4)10×转移电泳缓冲液

称取Tris base 33g，甘氨酸144g，用超纯水定容至1L。使用时量取100mL，加入200mL甲醇，超纯水稀释至1L。

(5)10×TBS缓冲液

称取Tris base 24.2g，NaCl 80g，用超纯水定容至1L，使用HCl调pH至7.5。

(6)1×TBST缓冲液

量取100mL 10×TBS缓冲液，加入1mL Tween20超纯水定容至1L，超声使Tween20溶解备用。

(7)脱脂牛奶封闭液

称取脱脂奶粉，使用1×TBST溶液配制成5％(w/v，质量体积比)脱脂牛奶。

(8)抗体稀释液

称取BSA，使用1×TBST溶液配制成1％(w/v)，加入1/250的叠氮化钠，即为一抗稀释液。二抗同一抗，但是不加入叠氮化钠。

2、免疫印迹分析操作步骤

以50ng/mL的脂多糖溶液为阳性对照，不同浓度β-葡聚糖(浓度分别为10、25、50、75和100μg/mL)单独作用于RAW264.7巨噬细胞24h后，分别收集各组细胞，以免疫印迹法检测MAPK通路中相关蛋白的磷酸化水平。

(1)细胞裂解液的制备

β-葡聚糖处理结束后，以冰冷的PBS清洗细胞两遍，加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，使用刮刀将细胞刮下，转移到EP管中。使用超声粉碎仪进行粉碎，20s ON，20sOFF，循环8次，之后放入-80℃冰箱中过夜裂解。

(2)蛋白定量及变性

-80℃冰箱中取出细胞裂解液，冰上融化，12000rpm 4℃离心20min，取上清于新EP管中。使用BCA试剂盒进行蛋白定量，每孔50000ng的标准，然后加入5×SDS上样缓冲液，使用RIPA补足，水浴煮沸10min，瞬离后置于-80℃冰箱备用。

(3)SDS-PAGE凝胶电泳

配制SDS-PAGE凝胶，组装好跑胶装置，电泳槽中加入1×电泳缓冲液。使用前将样品煮沸1min，以每孔20μL的量上样，marker上样量为1μL。70V电压电泳30min，之后100V电压电泳1h。

(4)转膜

电泳结束后，截取所需条带，制作三明治转膜模型，于冰盒中以120V电压，转膜90min。

(5)封闭、孵抗体及扫膜

转膜结束后，首先使用1×TBST洗膜两遍，每次10min；加入脱脂牛奶，摇床慢摇封闭1h；倒掉牛奶，洗膜三次，每次5min；加入一抗，4℃慢摇过夜；回收一抗，洗膜三次，每次5min；加入二抗，避光慢摇孵育1h；回收二抗，洗膜四次，每次8min；扫膜并分析结果。

图7为裂褶菌β-葡聚糖对RAW264.7巨噬细胞MAPK信号通路的影响，由图7可知，以脂多糖为阳性对照，不同浓度的β-葡聚糖处理RAW264.7巨噬细胞24h，可显著增强MAPK信号通路中的ERK，p38以及JNK的磷酸化水平。表明β-葡聚糖可显著激活MAPK信号通路，裂褶菌β-葡聚糖的免疫活化作用可能是通过MAPK信号通路的激活实现的。

五、β-葡聚糖对RAW264.7细胞NF-κB信号通路的影响

检测方法同本实施例的四，使用目的蛋白对应的抗体，以检测其水平。

图8为裂褶菌β-葡聚糖对RAW264.7巨噬细胞NF-κB信号通路的影响，由图8可知，以50ng/mL的脂多糖为阳性对照，不同浓度β-葡聚糖处理RAW264.7巨噬细胞24h，可剂量依赖性地激活IKKβ和p65蛋白的磷酸化。表明β-葡聚糖可显著激活NF-κB信号通路，裂褶菌β-葡聚糖的免疫活化作用可能是通过NF-κB信号通路的激活实现的。

实施例3、β-葡聚糖对脂多糖引起的炎症的预防和治疗作用

一、β-葡聚糖预处理对脂多糖刺激下RAW264.7细胞NO生成的影响

首先以不同浓度的裂褶菌β-葡聚糖(浓度分别为10、25、50和75μg/mL)预处理RAW264.7单核巨噬细胞1h，之后再以1μg/mL的脂多糖联合上述不同浓度裂褶菌β-葡聚糖(浓度分别为10、25、50和75μg/mL)，共同刺激细胞18h，收集细胞上清液，按照实施例2中二的方法，检测各组细胞NO分泌水平。

结果β-葡聚糖可有效降低脂多糖刺激下RAW264.7细胞NO水平的急剧增加。由图9B可知，1μg/mL脂多糖刺激下，RAW264.7细胞NO水平较β-葡聚糖单独处理时(图4C)，出现了大幅度的提升。但随着预处理β-葡聚糖浓度的增加，尤其是浓度增加至25μg/mL时，脂多糖刺激下过高的NO分泌水平得到显著抑制(与脂多糖刺激组相比，p<0.01)，且这种抑制作用呈现一定的剂量依赖关系。表明裂褶菌β-葡聚糖对脂多糖引起的炎症状态下NO异常增加具有预防作用。

二、β-葡聚糖预处理对脂多糖刺激下RAW264.7细胞表达的细胞因子mRNA水平的影响

以不同浓度的裂褶菌β-葡聚糖(浓度分别为1、10和25μg/mL)或可溶性酵母β-葡聚糖(浓度分别为10、15、20和25μg/mL)预处理RAW264.7巨噬细胞24h，之后再以50ng/mL的脂多糖联合上述各不同浓度β-葡聚糖，共同刺激细胞1.5h后，检测各细胞因子mRNA水平，检测方法同实施例2的三。将未经β-葡聚糖预处理的脂多糖模型组mRNA的表达水平设为1，其余各组mRNA的表达水平以脂多糖组的倍数表示。

结果如图10所示，各模型组中巨噬细胞TNF-α和IL-1β的mRNA表达水平极显著增加(p<0.01)。但随着预处理时使用浓度的增加，裂褶菌β-葡聚糖预处理的各组，其由脂多糖引起的TNF-α(图10A)和IL-1β(图10C)mRNA的高表达得到显著抑制(与模型组相比，p<0.05)，且这种抑制作用具有剂量依赖性。而经可溶性酵母β-葡聚糖预处理后的各组RAW264.7细胞，其由脂多糖引起的TNF-α和IL-1βmRNA的高表达没有得到显著抑制，其中各组的TNF-α的mRNA水平与模型组无显著差异(图10B，p>0.05)，而IL-1β的mRNA表达显著增加(图10D，p<0.05)。表明裂褶菌β-葡聚糖对脂多糖引起的炎症状态下巨噬细胞细胞因子表达的异常增加具有预防作用，而可溶性酵母β-葡聚糖没有预防作用。

三、β-葡聚糖预处理对脂多糖诱导下RAW264.7细胞MAPK信号通路的影响

不同浓度的裂褶菌β-葡聚糖(浓度分别为10、25、50和75μg/mL)作用于RAW264.7巨噬细胞24h，然后与50ng/mL的脂多糖共同处理细胞4h，检测MAPK信号通路中ERK、JNK和p38蛋白的水平，检测方法同实施例2的四。

由图11可知，模型组中，脂多糖单独处理可显著促进ERK、p38、JNK的磷酸化。而裂褶菌β-葡聚糖预处理组与模型组相比，ERK和p38的磷酸化水平显著下降，但对磷酸化JNK的表达没有影响。表明以裂褶菌β-葡聚糖进行预防后，脂多糖引起的炎症状态下巨噬细胞MAPK通路的活化能够得到有效抑制。

四、β-葡聚糖预处理对脂多糖诱导下RAW264.7细胞NF-κB信号通路的影响

不同浓度的裂褶菌β-葡聚糖(浓度分别为10、25、50和75μg/mL)作用于RAW264.7巨噬细胞24h，然后与50ng/mL的脂多糖共同处理细胞4h后，检测NF-κB通路相关蛋白的水平，检测方法同实施例2的四。

图12为不同浓度的裂褶菌β-葡聚糖对脂多糖诱导的RAW264.7巨噬细胞内NF-κB信号通路蛋白表达的影响，由图12可知，模型组中，脂多糖单独处理后，该组细胞IKKβ和p65的磷酸化水平显著增强，表明NF-κB信号通路被脂多糖所激活。β-葡聚糖预处理24h后再与脂多糖共同作用4h的情况下，巨噬细胞磷酸化IKKβ和p65的水平降低。表明以裂褶菌β-葡聚糖进行预防后，脂多糖引起的炎症状态下巨噬细胞NF-κB通路的活化得到有效抑制。

五、β-葡聚糖对脂多糖预刺激下RAW264.7细胞表达的细胞因子mRNA水平的影响

以50ng/mL的脂多糖预刺激RAW264.7巨噬细胞1.5h之后，再以不同浓度的裂褶菌β-葡聚糖(浓度分别为1、10、25、50、75和100μg/mL)或分散性酵母β-葡聚糖(浓度分别为1、10、25、50、75和100μg/mL)，联合50ng/mL的脂多糖，共同刺激细胞1.5h，检测各细胞因子mRNA水平，检测方法同实施例2的三。将脂多糖组(模型组)mRNA的表达水平设为1，其余各组mRNA的表达水平以脂多糖的倍数表示。

结果如图13所示，脂多糖刺激可使巨噬细胞TNF-α、IL-1β和IL-6等的mRNA表达水平显著增加(p<0.05)。随着裂褶菌β-葡聚糖使用浓度的增加，各治疗组细胞中，由脂多糖引起的TNF-α(图13A)、IL-1β(图13C)和IL-6(图13E)mRNA的高表达得到进一步促进(与模型组相比，p<0.05)。而经分散性酵母β-葡聚糖处理后的各组RAW264.7细胞，其由脂多糖引起的TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA的高表达情况各异，无特定规律可循，其中各组的TNF-α的mRNA水平与模型组相比均无显著差异(图13B)，而10μg/mL治疗中组，其IL-1β(图13D)和IL-6(图13F)的mRNA表达显著提高(与模型组相比，p<0.05)。表明裂褶菌β-葡聚糖对脂多糖引起的炎症的治疗效果不明显或有所下降，而分散性酵母β-葡聚糖没有治疗作用。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 浙江立恩生物科技有限公司

<120> 一种具有预防和治疗炎症的生物多糖及其应用

<130> P2018-0271

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA