具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案进一步的详细说明，结合附 图阅读本发明的具体实施例后，本发明的其他优点和特点将变得更加清晰，但本发 明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。本领域技术人员可以根据下文公 开内容的实质对本发明进行一些修改和调整，这些调整也属于本发明的范围。

术语

除非另有定义，否则在说明书和权利要求书中所使用的下述术语具有的含义 为所属领域技术人员通常理解的涵义。除非另有说明，本文全文引用的所有专利、 专利申请、公开材料通过引用方式整体并入本文。

1)聚合度(Degree of Polymerization)：dp；指聚合物大分子中重复结构单元的数目，在糖类化合物中，聚合度一般指化合物中单糖残基的数目。

2)多糖(Polysaccharide)：指由糖苷键结合而成的糖链，是由多个单糖残基缩合、失水而成的聚合碳水化合物。

3)葡萄糖(Glucose)：Glc；C₆H₁₂O₆，自然界分布最广且最为重要的一种单糖。

4)寡糖(Oligosaccharide)：又称低聚糖，是由2-20个相同或不同的单糖残基通过糖苷键连接形成的糖类化合物。

5)糖残基：指糖类物质水解之后得到的水解基团。

6)葡寡糖：由葡萄糖残基通过糖苷键连接组成的寡糖。

7)葡聚糖：由葡萄糖残基通过糖苷键连接组成的多糖。

8)ESI：电喷雾电离(Electrospray ionization)，是质谱中较常用的一种离子化方 式。

9)CID：碰撞诱导解离(Collision Induced Dissociation)，通过与中性分子碰撞将 能量传递给离子的过程，能量传递足以导致键的开裂和重排。

10)MS：质谱法(mass spectrometry)，一种测量离子荷质比(电荷-质量比)的 分析方法。

在本发明中，“β-1,3/1,6-葡聚糖”和“β-葡聚糖”可互换使用，其概念表述意义相同。

在本发明中，“β-1,3/1,6-葡聚糖”包括式I结构、式II结构、或其衍生形式、或 其组合，例如在本发明的β-1,3/1,6-葡聚糖组合物中，式I结构可以是0-100％，而 余量为式II结构；或者式II结构可以是0-100％，而余量为式I结构。在本发明中， 式II结构可视为开环的式I。此外，式I和式II可通过合适的条件或试剂进行互相 转换。

在另一优选例中，所述的β-1,3/1,6-葡聚糖不含有或基本不含有260-280nm的 吸收峰。

在另一优选例中，所述的β-1,3/1,6-葡聚糖的旋光度大于-15°，如在-15°至-25°之间，较佳地在-16°至-21°之间。

在本文中，术语“强阴离子树脂”和“强阴离子交换树脂”可以互换使用，是 指含有较强的反应基如季胺基团等的阴离子树脂。一般地，强阴离子树脂可用 于去除带有磺酸基、羧基等基团的杂质。

在本文中，术语“弱阴离子树脂”和“弱阴离子交换树脂”可以互换使用，是 指含有较弱的反应基如二乙基氨基乙基的阴离子树脂。一般地，弱阴离子树脂 可用于去除核酸、蛋白、色素等杂质。

本发明的主要优点和有益效果包括：

本发明的β-葡聚糖组合物是不同聚合度的、带有不同分支和侧链的β-葡聚糖的混合物，侧链由β-1,3-和β-1,6-葡萄糖组成，侧链长度不超过4个糖残基，结构新颖， 质量可控，由本发明所得的β-葡聚糖组合物具有更好的抗肿瘤活性，有望开发成为 安全有效的新的一类改善或治疗免疫相关疾病，抗肿瘤药物。

特别地，发明人对β-1,3/1,6-葡聚糖的制备方法进一步改进，通过强阴离子色 谱纯化和弱阴离子色谱纯化的组合纯化，获得了仅在紫外全波长扫描图谱中仅末端 出现吸收峰且230-900nm范围内(尤其是260-280nm区段)无明显吸收峰且旋光度进 一步增加(如旋光度为-15°～-21°范围)的β-1,3/1,6-葡聚糖。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明 本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通 常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份 数是重量百分比和重量份数。

实施例1 β-1,3/1,6-葡聚糖的制备

制备例1

(1)脱脂：将南极褐藻烘干、粉碎，有机溶剂浸泡、搅拌，得脱脂藻粉；

(2)水提：所述脱脂藻粉室温下用蒸馏水搅拌提取得水提液；

(3)分级：将步骤(2)所得水提液离心，在离心获得的上清液中加入1～3mol/L 氯化钙水溶液；搅拌后离心，取上清液用蒸馏水透析或超滤脱盐，减压浓缩干燥 获得粗多糖；

(4)纯化：将步骤(3)所述粗多糖用蒸馏水溶解，以蒸馏水和氯化钠水溶液为 流动相，经过强阴离子交换树脂分离纯化，收集水洗脱组分，减压浓缩、冻干， 获得所述β-1,3/1,6-葡聚糖。

除非特别说明，实施例2-19所用的β-1,3/1,6-葡聚糖或经验证的β-1,3/1,6-葡聚糖是以该制备例的方法制备的。

制备例2

(1)脱脂：将南极褐藻烘干、粉碎，有机溶剂浸泡、搅拌，得脱脂藻粉；

(2)水提：所述脱脂藻粉室温下用蒸馏水搅拌提取得水提液；

(3)分级：将步骤(2)所得水提液离心，在离心获得的上清液中加入1～3mol/L 氯化钙水溶液；搅拌后离心，取上清液用蒸馏水透析或超滤脱盐，减压浓缩干燥 获得粗多糖；

(4)纯化：将步骤(3)所述粗多糖用蒸馏水溶解，以蒸馏水和氯化钠水溶液为 流动相，经过强阴离子交换树脂分离纯化，收集水洗脱组分，减压浓缩；

(5)第二次纯化：将步骤(4)所述水洗脱组分，以蒸馏水为流动相，经过弱阴 离子交换树脂分离纯化，收集水洗脱组分；

(6)脱色：向步骤(5)所述水洗脱组分经过活性炭柱分离纯化，以蒸馏水为流 动相，收集水洗脱组分。减压浓缩、冻干，获得所述β-1,3/1,6-葡聚糖。

除非特别说明，实施例20-25所用的β-葡聚糖或经验证的β-葡聚糖是以该制 备例的方法制备的。

实施例2-7:β-葡聚糖组合物的分析

本实施例中的β-葡聚糖组合物，采用高效凝胶渗透色谱(HPGPC)与十八角激光 散射仪(MALLS)和示差检测器(RI)联用分析：

测定方法：采用0.1mol/L Na₂SO4将β-葡聚糖组合物配制成不同浓度的溶液， 由低浓度到高浓度依次注入DNDC仪，计算β-葡聚糖组合物的dn/dc。采用高效凝胶 渗透色谱(HPGPC)与十八角激光散射仪(MALLS)和示差检测器(RI)联用分析，色谱 条件为：色谱柱TSK-Gel G3000PW(7.5×300mm)；流动相0.1mol/L Na₂SO4；柱温35℃；流速0.5mL/min；示差检测器、十八角度激光检测器联用。代入β-葡聚糖组 合物的dn/dc测定值，获得β-葡聚糖组合物的重均分子质量以及分布分析(结果示于 表1和附图5-7)。

计算五糖-十糖(Dp 5-10)的β-葡聚糖，十糖-二十糖的β-葡聚糖，二十糖-二十五糖的β-葡聚糖，二十五糖-三十糖的β-葡聚糖，三十糖-四十糖的β-葡聚糖，四十糖- 五十糖的β-葡聚糖，五十糖-六十糖的β-葡聚糖，六十糖-七十糖的β-葡聚糖，七十 糖-八十糖的β-葡聚糖，大于八十糖的β-葡聚糖的重量百分比。

实施例2-7所得结果如表1所示：

实施例8:β-葡聚糖侧链长度的鉴定

1)β-葡聚糖组合物中侧链寡糖的制备：将β-葡聚糖组合物溶解，配成约5％左 右的浓度，加入10μL内切-1,3-β-葡聚糖苷酶，40℃下酶解8h。煮沸10min，离 心机10000rpm离心10min，收集上清，冷冻干燥获得β-葡聚糖组合物中侧链寡糖。

2)ESI-CID-MS/MS分析本发明的β-葡聚糖组合物中侧链寡糖的结构。质谱条 件：LTQ-Qrbitrap XL质谱仪，毛细管电压-3000V，进样锥电压-50V，离子源温 度80℃，解离温度150℃，鞘流速8arb，样品流速3-5μL/min。碰撞气体氦气， 碰撞电压15-30eV。

3)各聚合度β-葡聚糖组合物中侧链寡糖的质谱图见附图1-4所示。对质谱图 中各信号峰进行归属，验证了β-葡聚糖组合物中侧链寡糖的分子结构，即通式(III) 或式(Ⅳ)或式(V)或式(Ⅵ)所示的结构。其中图1显示了侧链为式(Ⅳ)中Glcβ1-6Glcβ 的质谱图，图2显示了侧链为式(Ⅳ)中Glcβ1-3Glcβ时的质谱图，图3显示了侧链 为式(V)中结构时的质谱图，图4显示了侧链为式(VI)中结构时的质谱图。

实施例9:高级结构信息

本发明的β-葡聚糖组合物具有三螺旋结构。刚果红可与具有三股螺旋链构象的多糖形成复合物，复合物的最大吸收波长与刚果红相比发生红移。本发明的β-葡聚 糖组合物在碱性条件下可以与刚果红形成复合物，使其最大吸收波长红移超过15 nm(附图8)。

本发明的β-葡聚糖组合物还原端具有糖醇结构。与式(I)结构的区别在于，式(II)结构在还原端具有糖醇结构，表现为在¹³C-NMR中，在63.16ppm处具有特征信号(附 图9)。

实施例10：β-1,3/1,6-葡聚糖可提高骨髓来源的巨噬细胞的吞噬作用

在本实施例中，检测了本发明的β-1,3/1,6-葡聚糖糖对外周血固有免疫细胞的两个主要群体，单核细胞(CD11b+Ly6C^hi，图10A和10B)和粒细胞(CD11b+Ly6G+， 图10A和10C)的结合亲和力和选择性。如图10D所示，β-1,3/1,6-葡聚糖-FITC较好地 与单核细胞(12.8％)结合，与极少的粒细胞(1.5％)结合。

接下来，评估了本发明的β-1,3/1,6-葡聚糖对差异极化BMDMs吞噬活性的影 响。β-1,3/1,6-葡聚糖轻微上调的巨噬细胞GM-BMDMs和M-BMDMs的吞噬活性图 11A和B。在剂量高于10μg/ml时,结构类似的β-glucan LNT的细胞吞噬作用高于本发 明的β-1,3/1,6-葡聚糖(图11B)。然而，如图11C和11D所示，LNT以剂量依赖的方式 显著降低BMDMs的细胞存活率。本发明的β-1,3/1,6-葡聚糖即使在100μg/ml的浓度 下也没有观察到细胞毒性。

实施例11：本发明的β-1,3/1,6-葡聚糖在肿瘤移植小鼠模型中减轻肿瘤负担， 改善脾脏指数

血液单核细胞被招募到肿瘤微环境中分化为巨噬细胞，产生免疫抑制和肿瘤 促进的微环境。将免疫抑制巨噬细胞重塑为促炎状态，将操纵肿瘤微环境，阻碍肿 瘤在体内生长。检测了本发明的β-1,3/1,6-葡聚糖在人结直肠癌细胞DLD1异种移植 小鼠模型中的抗肿瘤作用。

如图12A-C所示，本发明的β-1,3/1,6-葡聚糖抑制肿瘤体积(图12A、图12B)和肿瘤重量(图12C)。值得注意的是，与经典的化疗化合物不同，本发明的β-1,3/1,6-葡 聚糖不依赖于剂量抑制肿瘤生长。低剂量2mg/kg的β-1,3/1,6-葡聚糖比高剂量(4 mg/kg和8mg/kg)对肿瘤生长的抑制作用更强(图12A)。本发明的β-1,3/1,6-葡聚糖作 为一种免疫刺激因子，显著上调荷瘤小鼠脾脏指数，提示免疫细胞的活化和浸润增 加(图12D)。各处理对小鼠体重均无明显影响(图12E)。

实施例12：本发明的β-1,3/1,6-葡聚糖上调巨噬细胞体外吞噬活性和促炎细胞因子/趋化因子的分泌

在本实施例中，诱导对照组和本发明的β-1,3/1,6-葡聚糖处理组小鼠的腹腔巨噬细胞，并与9种不同的结直肠癌细胞系共培养，检测巨噬细胞的吞噬作用。

如图13A所示，β-1,3/1,6-葡聚糖组小鼠诱导的巨噬细胞对我们检测的所有癌细胞株均表现出较强的吞噬活性。细胞因子和趋化因子的分泌是机体免疫功能激活的 重要指标。本发明的β-1,3/1,6-葡聚糖强有力地增加了促炎细胞因子的分泌(IL-1β和 TNFα,这主要是由单核细胞/巨噬细胞分泌)。β-1,3/1,6-葡聚糖治疗还可上调巨噬细 胞等免疫细胞产生的IL-2、IL12p70等促炎细胞因子和趋化因子CXCL1的表达水平。 β-1,3/1,6-葡聚糖的2mg/kg和4mg/kg组小鼠的IFNγ水平有所提高。这些数据提示本 发明的β-1,3/1,6-葡聚糖在体内不仅触发巨噬细胞的吞噬活性，而且促进促炎细胞因 子/趋化因子的分泌，发挥抗肿瘤作用。

实施例13：本发明的β-1,3/1,6-葡聚糖在肿瘤微环境中增加促炎巨噬细胞和B 细胞的浸润

检测循环血液系统中的免疫细胞组成。发现B细胞(CD19+)和树突状细胞 (CD11c+)的比例增加，而髓细胞(CD11b+)的比例略有下降(图14A)。β-1,3/1,6-葡聚 糖治疗诱导髓样亚群、促炎单核细胞源性巨噬细胞(CD11b+Ly6Chi)形成(图14B)。

对肿瘤进行解剖，计算肿瘤浸润免疫细胞的百分比。在肿瘤内，本发明的 β-1,3/1,6-葡聚糖治疗后髓细胞百分比(CD11b+)略有上调(图14C)。此外，β-1,3/1,6- 葡聚糖促进了促炎单核细胞来源的巨噬细胞亚群(CD11b+Ly6Chi)的浸润(图 14D)。与对照组相比，本发明的β-1,3/1,6-葡聚糖小鼠中，抗肿瘤促炎肿瘤相关巨噬 细胞(TAMs)(CD11b+CD80+)上调，原瘤免疫抑制TAMs(CD11b+CD206+)下调(图 14E)。这些数据表明本发明的β-1,3/1,6-葡聚糖治疗可调节肿瘤中抗肿瘤髓样细胞的 比例。与B细胞在血液系统中的诱导一致，本发明的β-1,3/1,6-葡聚糖治疗后浸润B 细胞的比例也有所增加(图14F)。因此，本发明的β-1,3/1,6-葡聚糖可调节全身和瘤 内免疫细胞的组成，使其处于促炎和抗肿瘤状态，从而阻碍肿瘤在体内的生长。

根据β-1,3/1,6-葡聚糖治疗肿瘤的体积对其进行分组，以检测免疫细胞(CD45+)浸润。大肿瘤指的是本发明的β-1,3/1,6-葡聚糖治疗组中体积高于平均水平的肿瘤， 反之亦然。如图14F所示，本发明的β-1,3/1,6-葡聚糖治疗的所有肿瘤均含有较多的 免疫细胞(CD45+)。此外，大肿瘤比小肿瘤有更多的免疫细胞浸润。总之，这些数 据提示本发明的β-1,3/1,6-葡聚糖可能在体内触发促炎巨噬细胞等免疫细胞的肿瘤 浸润，抑制癌细胞生长。

实施例14：本发明的β-1,3/1,6-葡聚糖减轻AOM-DSS诱导结直肠癌模型的肿瘤 负担

为了验证本发明的β-1,3/1,6-葡聚糖在免疫功能健全小鼠体内的抗肿瘤作用，在AOM/DSS诱导的C57BL/6J小鼠结直肠癌模型中检测了β-1,3/1,6-葡聚糖的抗肿 瘤作用。在肿瘤进展的后期，β-1,3/1,6-葡聚糖组在1和3mg/kg剂量下的体重均高于 vehicle组，说明这些治疗小鼠的身体状况较好(图15A)。除了3mg/kg的β-1,3/1,6-葡 聚糖治疗略微增加了结肠长度(图15B)外，没有发现结肠长度的明显差异。即使在 低剂量1mg/kg的β-1,3/1,6-葡聚糖治疗后，每只小鼠诱导结直肠肿瘤的数量也有所 减少(图15C)。如图15D所示，β-1,3/1,6-葡聚糖治疗后，在3mg/kg剂量下，肿瘤直 径在2mm-4mm及4mm以上的肿瘤数量减少。在使用AOM/DSS后，1mg/kg的本发 明的β-1,3/1,6-葡聚糖诱导直径大于4mm的肿瘤数量比使用vehicle更少(图15E)。

实施例15：本发明的β-1,3/1,6-葡聚糖逆转AOM-DSS诱导的免疫细胞组成改变

观察AOM/DSS诱导及本发明的β-1,3/1,6-葡聚糖治疗后包括髓样细胞(CD11b+)在内的多种免疫细胞的变化。AOM/DSS增加循环血液系统中髓细胞(CD11b+)的比 例，本发明的β-1,3/1,6-葡聚糖治疗逆转了这一趋势(图16A)。同时，β-1,3/1,6-葡聚 糖增加了体内AOM/DSS给药引起的血液(图16A)和脾脏(图16B)中下调的B细胞，以 及逆转了CD4 T细胞在血液(图16A)和淋巴结(图16C)的降低。因此，β-1,3/1,6-葡聚 糖治疗逆转了AOM/DSS给药引起的免疫细胞组成的变化。此外,本发明的Β-1,3/1,6- 葡聚糖诱导的分泌炎性因子IFNγ(图16D)，TNF-α等和趋化因子CXCL1的上调(图 16E、图16F、图16G、图16H、和图16I)。

这些数据表明，本发明的Β-1,3/1,6-葡聚糖对免疫功能健全小鼠的抗肿瘤作用与调节免疫细胞组成和作为免疫刺激因子的促炎细胞因子/趋化因子分泌有关。

实施例16：本发明的β-1,3/1,6-葡聚糖对于散发型人结肠癌细胞系裸鼠接种抑制作用

液氮复苏小鼠结肠癌细胞株HCT-116，用含10％胎牛血清的5A培养基培养；培 养瓶中扩大培养细胞，达到所需细胞量后，消化收集细胞；用含10％胎牛血清的5A 培养基稀释成25000万/ml细胞悬液，常规消毒后按每只0.2ml接种于小鼠右前肢腋 窝部皮下，待生长成瘤至1g左右的组织块时牺牲动物剥离肿瘤组织，切割成2-3立 方毫米左右的瘤块，采用导管法植入传代裸鼠皮下，连续传代2次。表中所列的 HT-29、SW-480、DLD-1和RKO细胞系采用相同的方法进行造模和实验。待传代荷 瘤裸鼠肿瘤生长1g左右后采用上述的方法进行瘤块移植造模，移植后第二天随机分 组并开始给药。

采用随机分组法将动物分为组，每组8只动物。各组动物给药剂量如下表：

给药途径采用尾静脉注射给药，根据每只动物给药前最近一次体重，确定每只 动物的给药量。各组每周给药2次，连续给药至实验结束。实验结束，对意外死亡 动物及存活动物实施安乐死后需剥离肿瘤组织，称量肿瘤重量，计算各组的肿瘤重 量差异以及进一步计算肿瘤抑制率IR_TW作为参考指标，计算公式如下：

IR_TW(％)＝(W_模型组-W_给药组)/W_模型组×100％

从表中结果可以看出，本发明的β-1,3/1,6-葡聚糖在1mg/kg、3mg/kg、9mg/kg 给药剂量、每周给药2次的实验条件下，对HCT-116、HT-29、SW-480、DLD-1和 RKO细胞人结肠癌异种BALB/c nude裸鼠移植瘤的生长表现出较为显著的抑制作 用。

实施例17:本发明的β-1,3/1,6-葡聚糖对于小鼠S180肉瘤残癌模型的抑制作用

使用S180小鼠纤维肉瘤细胞，使用含10％FBS的DMEM高糖培养基进行培养 扩增。细胞进入对数生长期即可进行下一步试验。将对数生长期细胞收集离心，计 数。调整细胞浓度，以0.2ml/只接种于昆明鼠腹腔作为第一代种鼠。饲养一周后， 取第一代种鼠腹腔内的腹水离心并计数，调整细胞浓度，以0.2ml/只接种于昆明鼠 腹腔作为第二代种鼠，再饲养一周后，取第二代种鼠腹腔内的腹水离心并计数，调 整细胞浓度，以0.2ml/只接种于昆明鼠背部皮下。整个接种过程于超净工作台内行 无菌操作。接种后观察小鼠生长情况，根据小鼠的生长状态进行筛选，筛选后随机 分组给药。实验结果如下表所示，β-1,3/1,6-葡聚糖在3mg/kg可以显著抑制手术后 肿瘤的再生长。

实施例18:本发明的β-1,3/1,6-葡聚糖对于小鼠Lewies肺癌残癌模型的抑制作用

使用小鼠肺癌Lewis细胞，使用含10％FBS的DMEM高糖培养基进行培养 扩增。细胞进入对数生长期即可进行下一步试验。将对数生长期细胞收集离心，计 数。调整细胞浓度，以0.2ml/只接种于C57BL/6小鼠右侧腋窝皮下作为种鼠。待 肿瘤长至大于1000mm³后，无菌取出，称重，加入质量体积比为1:4的氯化钠注 射液稀释研磨，常规消毒后按每只0.2ml接种于小鼠右前肢腋窝部皮下进行传代。 待肿瘤长至大于1000mm³后，取第二代肿瘤，无菌取出，称重，加入质量体积比 为1:4的氯化钠注射液稀释研磨，常规消毒后按每只0.2ml接种于小鼠背部皮下， 接种后观察小鼠生长情况，根据小鼠的生长状态进行筛选，筛选后随机分组给药。 实验结果如下表所示，本发明的β-1,3/1,6-葡聚糖在1mg/kg，3mg/kg，9mg/kg可以显著抑制手术后肿瘤的再生长。

实施例19:β-1,3/1,6-葡聚糖对于AOM/DSS诱导小鼠炎症相关型结直肠癌的抑 制作用

癌症是导致人类死亡的主要原因之一，而约1/4癌症病例的病因和发病机制慢 性炎症相关。炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)是一类病因和发病机 制未明的肠道炎症性疾病，根据其病理特征可分为溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)和克罗恩病(Crohn's disease,CD)，呈逐年上升和年轻化趋势。IBD患者发生 结直肠癌(colorectal cancer,CRC)的风险率增高，8-10年后以每年0.5％-1％递 增，30年后高达18％的IBD患者可能发展为CRC。尽管IBD相关的CRC仅 占全部结直肠癌的1％-2％，它却是导致IBD患者死亡的常见原因。氧化偶氮甲 烷(azoxymethane,AOM)/葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate,DSS)诱发的 结肠炎相关性癌症(colitis associatedcancer,CAC)动物模型由于成功地模拟IBD 诱发CRC的全过程，被广泛用于研究新药药效和机制研究中，阐明其病理变化与 癌变原理有助于发现结直肠癌治疗新的候选靶点。

本实验采用腹腔注射AOM及周期性给予DSS饮用溶液方法建立小鼠结直肠 癌模型模型，实验开始将70只6-8周龄的雄性C57BL/6小鼠进行随机分组， 每组10只，共分7组。除第一组为正常对照外，其余各组均以AOM/DSS造模。 造模组小鼠实验开始第一天单次给予小鼠腹腔内注射剂量为10mg/kg氧化偶氮 甲烷(AOM)，七天之后，给小鼠饮用含有1％葡聚糖酸钠(DSS)的饮用水。七天之 后，再给十四天的正常饮用水，7天1％的DSS饮用水和14天的正常饮用水作 为一个循环，如此总共重复三个循环，最后诱发小鼠形成CAC。

实验结束将小鼠解剖，取出整个结直肠，小心去除肠系膜和附着的脂肪组织， 测量其长度，然后用生理盐水将整个结直肠的肠腔冲洗干净并纵向剖开，并在解剖 显微镜下用游标卡尺对宏观肿瘤进行计数和测量，最后从结肠长度、肿瘤成瘤率、 肿瘤总数等方面评价本发明的β-1,3/1,6-葡聚糖效果。

实验结果如下表所示，模型组与空白组比较，结肠长度明显缩短(P<0.01)，成 瘤率达77.78％，表明AOM/DSS诱导小鼠结直肠癌模型是成功的。β-1,3/1,6-葡聚糖 (3mg/kg)组成瘤率为16.67％，与模型组相比成瘤率降低，表明β-1,3/1,6-葡聚糖 (3mg/kg)对AOM/DSS诱导的小鼠结直肠癌有抑制作用。

*p<0.05vs.空白；**p<0.01vs.空白；#p<0.05vs.模型；##p<0.01vs.模型；

实施例20制备例1和制备例2获得的β-1,3/1,6-葡聚糖的表征

测试方法如下：

(i)紫外全波长扫描图谱:将β-葡聚糖组合物溶解，配成5wt％的浓度，以纯水 建立基线，设定扫描波长为190～900nm，扫描精度为1nm，进行紫外全波长扫 描。

(ii)侧链长度以实施例8的方法测定

实施例21.尾静脉注射β-1,3/1,6-葡聚糖抗小鼠S-180实验

免疫功能正常鼠动物实验(尾椎静脉给药)

1.实验方案：

肿瘤细胞：S-180；接种部位：肩胛处；小鼠种属：KM(雄鼠)；小鼠数量： 每组13只；接种肿瘤细胞次日开始给药；给药频率：每天给药；给药周期：20 天；给药方式：尾椎静脉注射；

空白对照组：模型组(CN组)

阳性对照组：顺铂(2mg/kg)(PC或CP组)；香菇多糖LNT(1.5mg/kg)

实验组：BL：β-1,3/1,6-葡聚糖低剂量(0.3mg/kg)；BM：β-1,3/1,6-葡聚糖 中剂量(1.5mg/kg)；BH：β-1,3/1,6-葡聚糖高剂量(7.5mg/kg)。

2.实验结果

结果如图18A-B所示。并且阳性对照组和实验组小鼠在接种20天后生理状 态依然很好，动物牺牲前非常活跃，行动敏捷。

与模型组相比，β-1,3/1,6-葡聚糖在低、中、高剂量时均能显著抑制S-180 肿瘤的生长，抑瘤率高达60％～70％。顺铂组小鼠的胸腺重量明显低于模型组， β-1,3/1,6-葡聚糖给药组(0.3、1.5、7.5mg/kg)的胸腺重量明显高于顺铂组，高剂 量BG136给药组小鼠的胸腺重量与模型组的胸腺重量相当。说明β-1,3/1,6-葡聚 糖很有可能通过激活小鼠的免疫系统来发挥抗肿瘤的作用。

实施例22口服β-1,3/1,6-葡聚糖抗肿瘤试验

1.实验方案：

肿瘤细胞：S-180；接种部位：腋下；小鼠种属：昆明小鼠(Kunming)； 小鼠数量：每组13只(7只雌鼠6只雄鼠)；给药开始时间：接种次日给药；给药 频率：每天给药；给药周期：10天；给药方式：口服；给药剂量(mg/kg)：① 模型(CN)；②顺铂(CP或PC)：1.5mg；③β-1,3/1,6-葡聚糖：1mg(B1)；④β-1,3/1,6- 葡聚糖：5mg(B5)；⑤β-1,3/1,6-葡聚糖：25mg(B25)；⑥顺铂 1.5mg+BG1mg(CPB1)；⑦顺铂1.5mg+BG5mg(CPB5)；⑧顺铂1.5mg+BG 25mg(CPB25)。

2.实验结果：

实验结果如图19A和B所示。由该实验结果可以看出，口服β-1,3/1,6-葡聚糖 对S-180肿瘤具有明显的抑制作用，β-1,3/1,6-葡聚糖口服剂量为1mg/kg时总体抑 制率58％以上，且对雄性小鼠的抑瘤率高达70.4％。当BG136在25mg/kg与顺铂 (1.5mg/kg)药物联用，抑制率进一步提高，抑瘤率达到77.3％。

实施例23β-1,3/1,6-葡聚糖联合化疗用于小鼠肿瘤模型

β-1,3/1,6-葡聚糖联合化疗对白细胞和血小板的作用

将3x10⁵个小鼠黑素瘤细胞系B16(PerkinElmer馈赠)的细胞悬浮液皮下注射到C57BL/6J小鼠(雌性，6-8周龄，购买自济南朋悦实验动物公司)中(Overwijk&Restifo,2001)。植瘤大约2天后，腹腔注射卡铂(30mg/kg，每周两次)和尾静脉注射 BG136(4mg/kg)或者香菇多糖LNT(2mg/kg)，给药期间检测肿瘤体积，第15天，动 物处死后，检测肿瘤质量。动物处死后心脏取血，放入EDTA-抗凝管中，混匀后取 50μl全血，通过血液分析仪检测免疫细胞浓度。

测试结果显示制备例2制备的β-1,3/1,6-葡聚糖可以增强卡铂的肿瘤抑制效果，并且可以刺激免疫反应，逆转卡铂用药后的免疫抑制，以及血小板的降低。

实施例24

由于免疫细胞在多种肿瘤细胞类型中均发挥着重要的作用，因此，β-1,3/1,6- 葡聚糖的抗肿瘤以及升白和升血小板作用在多种肿瘤细胞中均会发挥作用(例如， 肺癌，肾癌，肝癌，乳腺癌等)并且免疫细胞对于肿瘤转移和发生也发挥调节作用， 因此，β-1,3/1,6-葡聚糖可能抑制肿瘤细胞的转移和发生。

实施例25β-1,3/1,6-葡聚糖与PD-1抗体联用对小鼠肿瘤模型的影响

所用PD-1抗体：名称：体内MAb抗小鼠PD-1(CD279)；购自Bioxcell

(i)静脉注射β-1,3/1,6-葡聚糖联合PD-1抗体对结肠癌MC38小鼠皮下移植瘤的作用

在本实施例中选取小鼠结肠癌细胞系MC38，检测β-1,3/1,6-葡聚糖联用PD-1 抗体对小鼠移植瘤生长的影响，测试结果如图20A-C所示。

图20A和B结果表明，尾静脉注射β-1,3/1,6-葡聚糖联合PD-1抗体可以有效抑 制MC38移植瘤的生长，抑制效果明显优于单独给药PD-1抗体组，具有显著的增 效作用，并且没有明显的药物毒性(图20C)，具有良好的用药安全性。

(ii)静脉注射β-1,3/1,6-葡聚糖联合PD-1抗体对对小鼠肿瘤免疫相关细胞因子的表达的影响

在本实施例中，以RT-PCR的方法定量了小鼠前列腺癌细胞MC38移植瘤中多 种细胞因子的表达。结果如图21A-F所示。

由图21A、B和C结果可见，β-1,3/1,6-葡聚糖联合PD-1抗体后，小鼠肿瘤中巨 噬细胞产生的肿瘤坏疽因子α(TNFα)、白细胞介素1β(IL1-β)和一氧化氮合成酶 (iNOS)的表达量明显上升，表明β-1,3/1,6-葡聚糖可以协同PD-1抗体刺激肿瘤内部 的免疫激活；

由图21D、E和F结果可见，β-1,3/1,6-葡聚糖联合PD-1抗体后，促炎Th1极化 细胞因子(干扰素γ，IFN-γ)、白细胞介素2(IL-2)和颗粒酶B(GZMB)的表达量上 升，进一步说明了β-1,3/1,6-葡聚糖联用PD-1抗体可以桥接机体的先天性免疫和适 应性免疫，发挥最佳抗肿瘤免疫力。

(iii)口服β-1,3/1,6-葡聚糖联合PD-1抗体对小鼠肿瘤模型的影响

选取了小鼠结肠癌细胞系MC38，检测β-1,3/1,6-葡聚糖联用PD-1抗体对小鼠 移植瘤生长的影响。结果如图22A-C所示。

图22A和B结果表明，口服β-1,3/1,6-葡聚糖联合PD-1抗体可以有效抑制MC38 移植瘤的生长，抑制效果明显优于单独给药PD-1抗体组，具有显著的增效作用， 并且没有明显的药物毒性(图22C)，具有良好的用药安全性。

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