阅读说明：本技术 一种区分dna中5-甲基化胞嘧啶和5-羟甲基化胞嘧啶的方法 (A method of distinguishing 5- methylated cytosine and 5- methylolation cytimidine in DNA ) 是由 刘震 李阳 于 2019-07-11 设计创作，主要内容包括：本发明属于表观遗传学技术领域,具体涉及一种区分DNA中5-甲基化胞嘧啶和5-羟甲基化胞嘧啶的方法。该方法基于APOBEC3A对5-mC和5-hmC脱氨基转化的差异性,直接将被检测位点作为特异性引物的3’末端,qPCR扩增后不同的甲基化修饰会产生不同的扩增Ct值,根据酶转化产物和阴性对照之间的Ct值差异,从而快速区分被检测位点的修饰是甲基化修饰还是羟甲基化修饰,提高了分析时效性,节约了二次测序成本。该方法转化过程对DNA几乎无损伤作用,可利用低至1ng的样本DNA完成分析,能够广泛应用于DNA表观遗传分析领域。(The invention belongs to epigenetics technical fields, and in particular to a method of distinguish 5- methylated cytosine and 5- methylolation cytimidine in DNA.The otherness that this method converts 5-mC and 5-hmC deamination based on APOBEC3A, directly using detected site as 3 ' ends of specific primer, different methylation modifications can generate different amplification Ct values after qPCR amplification, it is different according to the Ct value difference between enzymatic conversion product and negative control, it is methylation modification or methylolation modification to quickly distinguish the modification in detected site, analysis timeliness is improved, secondary sequencing cost has been saved.This method conversion process, almost without damaging action, completes analysis using the sample DNA down to 1ng, can be widely applied for DNA epigenetic analysis field to DNA.)

一种区分DNA中5-甲基化胞嘧啶和5-羟甲基化胞嘧啶的方法

技术领域

本发明属于表观遗传学技术领域，具体涉及一种区分DNA中5-甲基化胞嘧啶和5-羟甲基化胞嘧啶的方法。

背景技术

胞嘧啶C5位的甲基化修饰是自然界最常见的DNA修饰手段之一，在染色体失活、基因调控、胚胎发育、疾病控制等领域具有重要意义，5-甲基化胞嘧啶 (简称5-mC)被称为自然界的“第五种碱基”。近年来，随着对5-甲基化胞嘧啶的不断研究，科学家们又发现了自然界的“第六种碱基”：5-羟甲基化胞嘧啶(简称5-hmC)。实际上，1952年就发现了这种碱基，但当时并未得到重视，直到2009年，Kriaucionis和Tahiliani两位科学家证实小鼠的Purkinje细胞、颗粒神经元以及胚胎干细胞存在5hmC(Kriaucionis and Heintz,2009；Tahiliani et al., 2009)。研究发现5-hmC可影响长期和短期的基因表达调控，并且5-hmC影响 5mC的去甲基化过程，因此在体内可能具有重要的生物学意义。

现有技术中区分5-mC和5-hmC的方法原理如图1所示。检测DNA甲基化最普遍的方法是重亚硫酸盐测序法(BS-Seq)，该方法使用重亚硫酸盐在高温、高盐条件下将DNA中的胞嘧啶转化为尿嘧啶，通过PCR扩增尿嘧啶转化成胸腺嘧啶，经过测序原DNA中的C被读作T，而甲基化的胞嘧啶不受重亚硫酸盐的转化，在测序反应中仍被读作C。然而，5-hmC与5-mC同样不被重亚硫酸盐转化，因此无法使用重亚硫酸盐测序的方法检测5-hmC。

现有技术中检测5-hmC的方法有：1)单分子实时测序法(SMRT)，该技术根据DNA聚合酶对C、5-mC和5-hmC的动力学差异区分它们，可以实现长读长分析但准确率不高；2)限制性内切酶法，最常用的是MspI，该酶特异性切割C^CGG序列，切割位点的胞嘧啶可以是C、5-mC和5-hmC任何一种形式，但不能是β-葡萄糖基-5-羟甲基胞嘧啶(简称5-ghmC)，5-hmC经过T4噬菌体β-葡糖基转移酶处理变成5-ghmC，不能被MspI切割，这种方法精确度不高且受到识别序列的限制；3)氧化重亚硫酸盐测序法(OxBS)，该技术使用二氧化锰或者高钌酸钾将5-羟甲基化胞嘧啶氧化成5-醛甲基化胞嘧啶(5-fC)或者5- 羧甲基化胞嘧啶(5-caC)，这些碱基能够被重亚硫酸盐转化为5-fU或5-caU，在测序反应中被读作T；4)Tet氧化酶重亚硫酸盐测序法(TAB-Seq)，He Chuan 课题组首先报道了该技术(Yu M,Hon G C,Szulwach K E,et al.Base-resolution analysis of 5-hydroxymethylcytosine in the mammaliangenome[J].Cell,2012, 149(6):1368-1380.)，文中先使用T4噬菌体β-葡糖基转移酶将5-hmC糖基化为 5-ghmC，再使用过量Tet氧化酶(一种在人体内发现的双加氧酶，能够将5-mC或5-hmC氧化为5-fU或5-caU)将5-mC氧化为5-caU，通过BS-Seq技术检测出5-hmC。

基于BS-Seq的检测技术，DNA模板都需要经过高温、高盐、酸性恶劣环境，导致文库构建流程中90％以上的DNA模板丢失，造成建库起始量高，关于 APOBEC3A的研究表明，APOBEC3A极可能成为BS-Seq的优秀替代者。 APOBEC3A是APOBEC家族中一个重要成员，APOBEC家族蛋白是人体内固有免疫系统的重要抗病毒功能因子，该类酶能够将DNA的胞嘧啶通过脱氨基作用转化为尿嘧啶，甲基化胞嘧啶则直接转化为胸腺嘧啶。APOBEC3A对5-hmC的转化效率远低于C和5-mC，因此通过测序反应能够一定程度区分这些碱基，但APOBEC3A存在较大的序列偏好性，当遇到偏好序列时区分5-mC和5-hmC 的差错就会十分严重。

发明内容

针对现有技术中的技术空白，本发明基于APOBEC3A对5-mC和5-hmC脱氨基转化的差异性，提供一种区分DNA中5-甲基化胞嘧啶和5-羟甲基化胞嘧啶的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明的第一个目的是提出一种利用APOBEC3A酶对DNA脱氨基转化的方法，包括以下步骤：

步骤1、双链DNA变性后立即低温保存备用；其特点是降温速度越快DNA 复性的概率越小；

步骤2、取预先配制好的APOBEC3A酶液与变性DNA快速混合；

步骤3、步骤2的反应体系进行转化反应，将DNA上胞嘧啶脱氨基转化为尿嘧啶，将甲基化胞嘧啶脱氨基转化为胸腺嘧啶；

步骤4、转化反应结束后经蛋白酶K消化，DNA回收试剂盒回收反应产物。

进一步地，所述步骤1的变性过程所使用的变性体系包括20wt％的DMSO 和10mMTris-HCl(pH7.9)，DNA变性温度为85-95℃，DNA变性时间为5～ 15min。

进一步地，所述步骤2的APOBEC3A酶液包含2-10uM APOBEC3A，40mM [email protected]，2mM DTT和0.2wt％Tween-20。

进一步地，所述步骤3的转化反应程序为：4℃，1min；4℃，3s， 330cycles(+0.1℃/cycle)；37℃，1～2h，热盖50℃。

进一步地，所述方法还包括转化产物定量分析步骤，所述转化产物定量分析方法为：设计一对3’端为至少2个胞嘧啶的特异性引物，根据APOBEC3A处理前后的Ct值计算未转化DNA的数量，从而得出APOBEC3A转化效率。

本发明的第二个目的是提出一种区分DNA中5-甲基化胞嘧啶和5-羟甲基化胞嘧啶方法，包括以下步骤：

(1)用β-葡萄糖基转移酶处理待检测基因组DNA，将待检测基因组DNA 中所有5-羟甲基化胞嘧啶进行糖基化修饰；

(2)采用上述任一项所述DNA脱氨基转化的方法，以APOBEC3A酶液处理步骤(1)中糖基化产物，将DNA中的胞嘧啶转化为尿嘧啶，将5-甲基化胞嘧啶转化为胸腺嘧啶；

(3)以步骤(2)的转化产物为模板，对步骤(2)的转化产物进行qPCR 扩增，根据经APOBEC3A处理和未经APOBEC3A处理的产物的Ct值判断被检测位点胞嘧啶修饰情况。

进一步地，所述步骤(3)中qPCR扩增特异性反向引物的3’末端为被检测位点。

进一步地，经APOBEC3A处理和未经APOBEC3A处理的Ct值无显著差异 (|ΔCt|<1)，则该位点为5-羟甲基化胞嘧啶；经APOBEC3A处理和未经 APOBEC3A处理的Ct值差异显著(|ΔCt|>3.3)，则该位点为5-甲基化胞嘧啶。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)本发明基于APOBEC3A对5-mC和5-hmC脱氨基转化的差异性，提供一种区分DNA中5-甲基化胞嘧啶和5-羟甲基化胞嘧啶的方法，直接将被检测位点作为特异性引物的3’末端，利用mC和hmC经APOBEC3A转化后的差异，不同的甲基化修饰会产生不同的扩增Ct值，能够快速区分被检测位点的修饰是甲基化修饰还是羟甲基化修饰，提高了分析时效性，节约了二次测序成本。该方法转化过程对DNA几乎无损伤作用，可利用低至1ng的样本DNA完成分析，能够广泛应用于DNA表观遗传分析领域。

(2)本发明的方法在DNA变性过程中通过增加DMSO浓度和降低变性温度来降低高温对DNA的损伤，同时添加pH7.9的Tris盐酸增加DNA在变性温度下的稳定性，从而进一步保证DNA在转化过程中的低损伤率，因此允许更低的模板投入量，本申请的方法可利用低至1ng的样本DNA完成分析。同时本申请中的PCR程序能够在任何PCR仪上实现，无需购买专利设备。

(3)APOBEC3A的转化活性是酶法区分5-mC和5-hmC技术关键，本申请提供了一种通过qPCR技术快速检测APOBEC3A转化效率的方法，仅需要设计一对特异性引物，根据APOBEC3A处理前后的Ct变化，即可根据经验公式快速计算出APOBEC3A转化效率。实验表明，转化产物经过建库和测序，结果 DNA中的mC全部被转化为T，转化率≥99.5％，hmC全部被读为C，mC和hmC 的混合底物完全被区分。

(4)APOBEC3A只能催化单链DNA而无法直接催化双链DNA，DNA变性后在37℃中性环境中难以保持单链状态，本申请通过先将酶配成2×酶Mix 混合液，再与DNA快速混合，再经过逐渐升温过程，使APOBEC3A在DNA 复性前结合到反应位点，有效解决了DNA保持单链状态的问题。

(5)本申请提出的用来培养携带pET41a_MBP-A3A-His质粒的大肠杆菌的培养基及原核表达载体pET41a_MBP-A3A-His有利于降低酶的毒性，使其更容易进行可溶性表达。

附图说明

图1为现有技术区分5-mC和5-hmC的原理示意图。

图2为APOBEC3A纯化产物的SDS-PAGE结果，图中M代表蛋白分子标准，1代表上样样本(即经Xa因子酶切后的混合蛋白)，2代表MPB标签蛋白，3和4是纯的APOBEC3A酶。

图3为APOBEC3A和BS转化相同DNA底物的效率的小提琴图，纵坐标的含义为测序结果中被读为C碱基的次数/该位点的总测序深度，图中对这一比例取了以10为底的对数，图中空心圆圈代表样本总量的平均值。

图4为本发明的基于APOBEC3A对5-mC和5-hmC脱氨基转化的差异性提出的快速区分5-mC和5-hmC的方法原理示意图。

图5为区分mC和hmC的准确性结果示意图，其中图5A为BS-Seq法准确性结果柱状图，图5B为实施例3的方法准确性结果柱状图。两个图中横轴表示 4组DNA组合，按从左至右的顺序分别为mC-λ3和mC-RH2、mC-λ3和 hmC-RH2、hmC-λ3和mC-RH2、hmC-λ3和hmC-RH2；纵坐标表示DNA中所有C碱基被读为C的次数/C碱基总测序深度，图中取这一比率的百分数。

具体实施方式

下面申请人结合具体实施例对本发明技术方案做进一步详细说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为本发明请求保护范围的限定。

实施例中所用材料来源：

(1)引物、DNA片段合成：生工生物工程(上海)股份有限公司；

(2)DNA二代测序：范生子基因(NovaSeq5000测序仪)；

(3)qPCR仪：美国伯乐公司(Bio-Rad CFX96)；

(4)感受态细胞、抗生素和IPTG：天根生化科技(北京)有限公司；

(5)化学试剂：Sigma公司；

(6)DNA回收试剂盒、重亚硫酸盐甲基化测序试剂盒：美国Zymo公司；

(7)Ni-NTA、MBP、Heparin树脂：美国GE公司；

(8)T4噬菌体β-葡糖基转移酶(βGT)：Thermo公司。

实施例1、APOBEC3A酶的表达及纯化

本申请以pET41a为载体框架，从pMal-c5x上扩增出MBP-Xa标签，通过同源重组转移到pET41a上，然后连接APOBEC3A基因与载体得重组质粒 pET41a-MBP-A3A-His。重组质粒转化E.coli BL21(DE3)pLysS感受态细胞(天根生化)，挑取10～20个体较小的阳性克隆子到5mL液体LB培养基(包含 2.5mM葡萄糖、50ug/mL卡那霉素、34ug/mL氯霉素、100uM EDTA)中，37℃， 250rpm培养至OD600约0.5，迅速冰上降温，然后加入IPTG至终浓度0.2mM， 16℃培养过夜。离心收集菌体，菌体重悬于0.5ml PBS中，加入溶菌酶37℃孵育30min，取上清进行Western Blot分析。WB确认表达的克隆子再进行放大培养，离心收集菌体。菌体经裂解液(包含50mM [email protected]、150mM NaCl、0.1mM ZnCl₂、5％甘油、10mMβ-Me、0.5mM PMSF)重悬后，超声裂解，离心收集上清，经过MBP亲和层析、Ni-NTA亲和层析、Xa因子酶切和Heprain柱富集，最终得到高纯度APOBEC3A酶，从图2可以判断APOBEC3A酶的纯度≥98％。

实施例2、APOBEC3A的脱氨基活性验证

1、DNA底物制备：通过巢式PCR从质粒DNA上扩增一段DNA片段，长 580bp；

2、APOBEC3A脱氨基转化流程

(1)按如下体系冰上配制APOBEC3A酶Mix，轻微振荡混合均匀，短暂离心后***冰上备用。

表1

(2)DNA变性：按如下体系混合各组分，***冰上冷却1min，移至95℃ PCR仪上变性3min，迅速置于冰水浴中，静置2min。

表2

(3)快速混合酶Mix和变性产物，用移液枪轻轻吹吸混匀，4℃短暂离心后置于冰上备用。

(4)将上述混合产物转移到PCR仪上开始转化程序，转化程序：4℃，1min； 4℃，3s，330cycles(+0.1℃/cycle)；37℃，1.5h；热盖50℃。

3、qPCR快速检测转化效率

(1)转化产物作梯度稀释，分别稀释4⁰、4¹、4²、4³、4⁴、4⁵倍，每个反应设置2个重复，然后按下表配制qPCR体系：

表3

(2)qPCR条件：95℃90s；95℃15s，58℃15s，72℃10s(收集荧光信号)；40cycles；普通溶解曲线。

(3)计算转化率：胞嘧啶被APOBEC3A转化后形成尿嘧啶，甲基胞嘧啶被APOBEC3A转化后形成胸腺嘧啶，引物在此处形成G/U或G/T错配无法正常扩增，错配比例越高Ct越大。本发明以APOBEC3A负对照为参考，通过Ct 值的变化估算未转化DNA数量，据此计算DNA转化率，转化率≈(1-10^[(Ct{-} -Ct{+})/3.32])×100％，公式中Ct{-}代表APOBEC3A负对照的平均Ct值，Ct{+} 代表APOBEC3A转化样品的平均Ct值。另外，根据同一转化产物不同稀释倍数的ΔCt值估算扩增效率，若相邻梯度ΔCt显著偏离2.0，应调整引物浓度和退火温度重新试验。

本实施例中，根据公式计算的APOBEC3A转化率为99.71％，与测序结果 99.9％比较接近。

4、重亚硫酸盐转化对照实验

使用相同的DNA进行重亚硫酸盐转化，使用Zymo公司的Bisulfite ConversionKits，从图3可以看出APOBEC3A的转化效率几乎比BS高一个数量级。

实施例3、利用APOBEC3A区分5-mC和5-hmC

本实施例基于APOBEC3A对5-mC和5-hmC脱氨基转化的差异性，提供了一种快速区分5-mC和5-hmC的方法，其原理如图4所示。

1、DNA底物制备

使用5-mC dCTP代替dCTP进行PCR扩增，从λDNA扩增出一段DNA片段命名为mC-λ3，从pMal-c5x_RH2扩增出一段DNA片段命名为mC-RH2；使用5-hmC dCTP代替dCTP进行PCR扩增，从λDNA扩增出一段DNA片段命名为hmC-λ3，从pMal-c5x_RH2扩增出一段DNA片段命名为hmC-RH2。

2、5-hmC的糖基化

表4反应体系

反应条件：按顺序加入各组分，混合均匀后移至PCR仪上，37℃孵育1h， 4℃hold，热盖50℃。

产物回收：反应结束后，用Oligo Clean&Concentrator(Zymo Research： D4061)回收DNA，10uL ddH₂O洗脱产物。

3、APOBEC3A转化

上述糖基化产物按照实施例二中的方法，利用APOBEC3A进行DNA脱氨基转化，37℃反应结束，加入1U蛋白酶K，50℃孵育30min；反应产物经Oligo Clean&Concentrator(ZymoResearch：D4061)回收，12U ddH₂O洗脱。

4、测序反应

上述产物使用 Ultra^TMDNA Library Prep Kit for 试剂盒 (NEB公司)建库，送范生子基因公司进行NGS测序分析，所用测序仪为illuminaNovaSeq 5000。

本实施例共选择4种DNA组合：mC-λ3和mC-RH2，mC-λ3和hmC-RH2， hmC-λ3和mC-RH2，hmC-λ3和hmC-RH2，从图5可以看出BS-Seq处理对所有组合无显著差异，完全无法区分mC和hmC，βGT+APOBEC3A处理对mC-λ3 和hmC-RH2，hmC-λ3和mC-RH2组合有显著的区分度。

实施例4、利用qPCR定点区分5-mC和5-hmC

(1)DNA底物的合成：委托DNA合成公司，合成如SEQ ID NO.7所示单链DNA序列和如下引物序列：

表5

(2)取40ng单链DNA底物按实施例3中所述方法进行糖基化反应，反应产物利用Oligo Clean&Concentrator试剂盒(Zymo Research：D4061)回收，回收产物平分为两份，一份按实施例2中所述方法进行脱氨基转化，一份在无酶体系中作阴性对照。

(3)取上述转化产物稀释20倍作为模板，取引物对1F、207R，1F、205R， 1F、178R，1F、154R，1F、122R，分别按实施例二中所述qPCR体系和条件进行扩增，所得Ct值如下：

表6

从上述结果可以看出，mC经糖基化和APOBEC3A转化后变成T，qPCR时形成G/T错配，与APOBEC3A-负对照相比，Ct明显升高；hmC经糖基化和 APOBEC3A转化后变成ghmC，qPCR时正常扩增，Ct值无显著变化。因此，利用mC和hmC经APOBEC3A转化后的差异，实现了快速区分被检测位点的修饰是甲基化修饰还是羟甲基化修饰，提高了分析时效性，节约了二次测序成本。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉伯远生物科技有限公司

<120> 一种区分DNA中5-甲基化胞嘧啶和5-羟甲基化胞嘧啶的方法

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<210> 1

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gtggttttaa gagggatggg 20

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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