一种用于检测ntrk基因融合突变的引物、探针及试剂盒
阅读说明：本技术 一种用于检测ntrk基因融合突变的引物、探针及试剂盒 (A kind of primer, probe and kit being mutated for detecting NTRK Gene Fusion ) 是由 张宇清 赵艳伟 裴婷婷 于 2019-10-30 设计创作，主要内容包括：本发明涉及分子生物技术领域,公开了一种用于检测NTRK基因融合突变的引物、探针及试剂盒。本发明的检测引物、探针分别为SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.21所示的序列,探针5’端有FAM或VIC报告荧光基团,3’端有NFQ-MGB淬灭荧光基团。利用本发明可以同时检测6种NTRK基因融合突变,操作简单,灵敏度高,检测速度快,具有良好的临床应用前景。(The present invention relates to field of molecular biotechnology, disclose a kind of for detecting primer, probe and the kit of the mutation of NTRK Gene Fusion.Detection primer of the invention, probe are respectively sequence shown in SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.21, and there is FAM or VIC reporter fluorescence group at the end of probe 5 ', and there is NFQ-MGB quenching fluorescence group at 3 ' ends.6 kinds of NTRK Gene Fusions can be detected simultaneously using the present invention to be mutated, easy to operate, high sensitivity, detection speed is fast, has good potential applicability in clinical practice.)
技术领域
本发明涉及分子生物技术领域，具体地涉及一种用于检测NTRK基因融合突变的引物、探针及试剂盒。
背景技术
NTRK基因融合突变属于一种染色体重排，最终导致NTRK基因家族成员（NTRK1、NTRK2、NTRK3）与其他基因融合在一起，其结果会产生构象激活的异常TRK融合蛋白，TRK融合蛋白处于持续活跃状态，引发下游信号级联反应，驱动发生TRK基因融合突变的肿瘤的发生与生长。研究还发现，在多种肿瘤中，NTRK1、NTRK2或NTRK3的C端激酶区域容易与其他基因存在融合现象，这些NTRK基因的融合导致了融合蛋白的过度表达，从而导致下游信号通路不依赖配体的持续激活，进而导致肿瘤的发生。NTRK基因融合可能出现在起源于身体不同位置的肿瘤中，包括乳腺癌、胆管癌、结直肠癌、神经内分泌癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、甲状腺癌等。
2018年11月26日，美国FDA加速批准拉罗替尼（Larotrectinib，商品名Vitrakvi）用于治疗携带NTRK融合基因的成年和儿童局部晚期或转移性实体瘤患者，而不需考虑癌症的发生部位。2019年1月18日，NCCN发布了非小细胞肺癌指南2019年第3版，非小细胞肺癌靶向用药的相关基因从8个变成了9个，就是新增了NTRK基因融合，而拉罗替尼（Larotrectinib）更是被推荐成为 NTRK基因融合突变阳性的转移性非小细胞肺癌患者的一线治疗选择。2019年6月，罗氏公司 “不限癌种”个体化药物恩曲替尼（Entrectinib，商品名Rozlytrek）获得日本厚生劳动省（MHLW）批准，用于治疗NTRK基因融合突变阳性的成人晚期复发性实体瘤患者。这些药物的获批打破了以前药物必须以疾病作为适应症的界限，而开启了药物可以以基因突变为适应症的先河。因为这两个药物的使用都必须以患者携带NTRK基因融合突变为前提，因此快速、准确地检测NTRK基因融合突变作为这些药物的伴随诊断，对这些药物的临床选择至关重要。
目前针对NTRK基因融合突变的检测方法有免疫组织化学法（IHC）、荧光原位杂交技术(FISH)、高通量测序法和逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）法等。IHC法是应用免疫学抗原与抗体特异性结合的原理检测肿瘤特异性抗原表达，具有快速筛选作用，但IHC法针对的是蛋白的表达量，判断上存在一定主观性，对于弱阳性结果需进一步用FISH等技术来验证。FISH技术是利用靶DNA与荧光标记的核酸探针同源互补，形成靶DNA与核酸探针的杂交体，在荧光显微镜下对待测DNA进行定性、定量和相对定位分析，但该技术对于融合的两个基因在染色***置上距离较近时，可能导致重排的分离信号不明显，产生假阴性结果，且成本较高，检测周期较长。高通量测序法也可以用于检测基因融合，但操作相对比较复杂，对实验人员的技术要求较高，耗时长，通常要3-5天才可出检测结果。因此临床上需要一种高效、高准确率、高灵敏度、操作简单的检测方法，对NTRK基因融合突变进行检测，为肿瘤患者个体用药提供科学依据，降低治疗风险及患者负担。
针对上述问题，本发明公开了一种高效、高准确率、高灵敏度的用于检测NTRK基因融合突变的引物、探针及试剂盒。本试剂盒以RNA为检测样本，检测NTRK1、NTRK2、NTRK3基因与其它基因的融合，涵盖最常见的6种融合类型，能在150分钟检测时间内获得高灵敏度的检测结果，检测下限可以达到2.5%。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效、高准确率、高灵敏度的检测NTRK基因融合突变的引物、探针及试剂盒。
本发明提供的一种检测NTRK基因融合突变的引物、探针及试剂盒，其特征在于，所述特异性引物对为：核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的COSF572-ETV6-NTRK3融合扩增引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的COSF1535-ETV6-NTRK3融合扩增引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的COSF1330-TPM3-NTRK1融合扩增引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示的COSF1447-QKI-NTRK2融合扩增引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的COSF1449-NACC2-NTRK2融合扩增引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示的COSF1332-NTRK1-TPM3融合扩增引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示的ETV6质控基因的扩增引物对。
所述特异性探针为：核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的COSF572-ETV6-NTRK3融合检测探针(5’端标记FAM荧光基团)，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的COSF1535-ETV6-NTRK3融合检测探针(5’端标记FAM荧光基团)，核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的COSF1330-TPM3-NTRK1融合检测探针(5’端标记FAM荧光基团)，核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的COSF1447-QKI-NTRK2融合检测探针(5’端标记FAM荧光基团)，核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示的COSF1449-NACC2-NTRK2融合检测探针(5’端标记FAM荧光基团)，核苷酸序列如SEQID NO.18所示的COSF1332-NTRK1-TPM3融合检测探针(5’端标记FAM荧光基团)，核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示的ETV6质控基因的检测探针(5’端标记VIC荧光基团)。
进一步地，所述特异性探针5’端修饰有FAM或VIC荧光基团，3’端修饰有非荧光淬灭基团NFQ(Non-Fluorescent Quencher)，该基团本身不产生荧光，一方面可以大大降低本底信号的强度，另一方面，当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号，随着PCR的进行，Taq酶在DNA链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5’→3’外切核酸酶活性就会将探针切断，荧光基团远离淬灭基团，产生荧光信号。同时该特异性探针上还连接有MGB修饰基团，可以将该探针的Tm值提高10℃左右，增加探针的特异性。
所述一种检测NTRK基因融合突变的试剂盒，其特征在于，包含以下步骤：
1） 样本RNA提取
根据样本性质，使用相应的RNA提取试剂盒进行样本RNA提取，使用无核酸酶水将提取的RNA稀释至10-100ng/μL备用，提取的RNA的A260/A280值在1.8～2.0之间，提取后的RNA应立即使用，若暂时不用需放置在-70℃以下保存。
2） RNA逆转录为cDNA
将提取的样本RNA、阳性对照品RNA、阴性对照品RNA按照如下体系分别配置反应液：
试剂
体积
逆转录引物（10μM）
2μL
2.5mM each dNTP Mix
4μL
5×First-Strand Buffer
4μL
0.1M DTT
1μL
RNaseOUT Recombinant RNase Inhibitor
1μL
SuperScript III RT
1μL
模板RNA
2μL
无核酸酶水
补足至20μL
按照下面反应程序进行反应：
温度
时间
循环数
25℃
5min
1
50℃
60min
1
70℃
15min
1
反应结束后，立即放置于冰上至少2分钟，得到cDNA，获得的cDNA作为扩增反应模板备用。
3） 实时荧光PCR检测
在超净台中按照下表分别配置COSF572-ETV6-NTRK3、COSF1535-ETV6-NTRK3、COSF1330-TPM3-NTRK1、COSF1447-QKI-NTRK2、COSF1449-NACC2-NTRK2、COSF1332-NTRK1-TPM3这六种基因融合检测反应体系：
试剂
体积
2× qPCR mix
10μL
融合F-Primer(10μM)
0.4μL
融合R-Primer(10μM)
0.4μL
融合Probe(10μM)
0.2μL
质控gene-F-Primer(10μM)
0.4μL
质控gene-R-Primer(10μM)
0.4μL
质控gene-Probe(10μM)
0.2μL
50×ROX Dye I
0.4μL
模板 cDNA
2μL
无核酸酶水
补足至20μL
按照下面反应程序进行反应：
在60℃时采集FAM、VIC通道的荧光。
每个反应均设置阳性对照和阴性对照。
所述阳性对照品为含有COSF572-ETV6-NTRK3、COSF1535-ETV6-NTRK3、COSF1330-TPM3-NTRK1、COSF1447-QKI-NTRK2、COSF1449-NACC2-NTRK2、COSF1332-NTRK1-TPM3这六种NTRK基因融合的RNA混合样本；
所述阴性对照品为不含COSF572-ETV6-NTRK3、COSF1535-ETV6-NTRK3、COSF1330-TPM3-NTRK1、COSF1447-QKI-NTRK2、COSF1449-NACC2-NTRK2、COSF1332-NTRK1-TPM3这六种NTRK基因融合的RNA样本。
4） 根据荧光PCR扩增结果进行判读
质控标准：
a)阳性对照品：FAM 通道有正常平滑扩增曲线，VIC通道有正常平滑扩增曲线；
b)阴性对照品：FAM通道没有扩增曲线，VIC通道有正常平滑扩增曲线。
符合上述条件的即为质控合格。
样本检测结果判读：
a)如VIC通道有扩增曲线，FAM通道有扩增曲线，则样本为NTRK基因融合突变阳性；
b)如VIC通道有扩增曲线，FAM通道无扩增曲线，则样本为NTRK基因融合突变阴性或低于本试剂盒的检测下限或样本质量原因或为本试剂盒未覆盖的其他融合类型；
c)如VIC通道没有扩增曲线，则实验结果不可信，需重新进行实验。
因此，使用本发明所述的一种检测NTRK基因融合突变的试剂盒，能够用于检测以下6种类型的NTRK基因融合位点：COSF572-ETV6-NTRK3、COSF1535-ETV6-NTRK3、COSF1330-TPM3-NTRK1、COSF1447-QKI-NTRK2、COSF1449-NACC2-NTRK2、COSF1332-NTRK1-TPM3。
本发明的有益效果是：本发明采用了特异性引物和探针，可以特异性地检测6种NTRK基因融合突变。此方法：（1）建立了实时荧光PCR体系，实现对NTRK基因融合突变的快速检测；（2）用时短，只需150分钟即可完成检测；（3）检测结果判读方便，特异性强，根据有无扩增信号即可判定结果；（4）灵敏度高，可检测出最低25个拷贝的基因融合突变阳性质粒；（5）样本检测范围广，样本可以为新鲜组织、石蜡包埋组织或冰冻病理切片。
附图说明
图1为本发明检测阳性基因融合对照品结果示意图。
图2为本发明检测阴性基因融合对照品结果示意图。
图3为本发明对COSF572-ETV6-NTRK3基因融合样本灵敏度分析实验结果示意图。
图4为本发明对COSF572-ETV6-NTRK3基因融合样本检测限重复性实验结果示意图。
图5为本发明检测1例阳性临床样本的实验结果示意图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为可以通过市场购买获得的常规产品。
实施例1
本发明涉及一种用于检测NTRK基因融合突变的引物和探针，其设计原理如下：
1） 根据COSMIC数据库和相关文献报道得到6种常见NTRK基因融合突变形式（如表1），按照引物探针设计原则分别设计上下游引物和探针，探针5’端修饰有FAM荧光基团。以人类ETV6基因为内控基因，按照引物探针设计原则设计上下游引物和探针，探针5’端修饰有VIC荧光基团。
表1 6种NTRK基因融合突变形式
序号
融合名称
5'端拼接外显子
3'端拼接外显子
COSMIC ID
（1）
COSF572-ETV6-NTRK3
ETV6-EXON5
NTRK3-EXON 15
COSF572
（2）
COSF1535-ETV6-NTRK3
ETV6-EXON4
NTRK3-EXON 14
COSF1535
（3）
COSF1330-TPM3-NTRK1
TPM3-EXON7
NTRK1-EXON 10
COSF1330
（4）
COSF1447-QKI-NTRK2
QKI-EXON6
NTRK2-EXON 16
COSF1447
（5）
COSF1449-NACC2-NTRK2
NACC2-EXON4
NTRK2-EXON 13
COSF1449
（6）
COSF1332-NTRK1-TPM3
NTRK1-EXON9
TPM3-EXON 8
COSF1332
2） 本实施例经过多轮测试验证和优化，最终获得检测NTRK基因融合突变的引物、探针组合，序列如表2所示：
表2 检测NTRK基因融合突变的引物和探针的核苷酸序列
序号
名称
序列(5’- 3’)
SEQ ID NO.1
COSF572-ETV6-NTRK3-F
CATCGGGAAGACCTGGCTTACATG
SEQ ID NO.2
COSF572-ETV6-NTRK3-R
CCAGTTCTCGCTTCAGCACGATG
SEQ ID NO.3
COSF572-ETV6-NTRK3-P
FAM-TGGGAGAATAGCAGATGTGCAG-MGB
SEQ ID NO.4
COSF1535-ETV6-NTRK3-F
TTCCACCCTGGAAACTCTATACACACAC
SEQ ID NO.5
COSF1535-ETV6-NTRK3-R
CCGTGGTTGATGTGGTGCAGTG
SEQ ID NO.6
COSF1535-ETV6-NTRK3-P
FAM-ACCATGAAGAAGGTCCCGTG-MGB
SEQ ID NO.7
COSF1330-TPM3-NTRK1-F
AGAGACCCGTGCTGAGTTTGCTG
SEQ ID NO.8
COSF1330-TPM3-NTRK1-R
GTCCCAAAGTCTGCACAAGCTTCTAC
SEQ ID NO.9
COSF1330-TPM3-NTRK1-P
FAM-TGGAGAAGAAGGACGAAACACC-MGB
SEQ ID NO.10
COSF1447-QKI-NTRK2-F
CACATTGGCACCAGCTACATCAATC
SEQ ID NO.11
COSF1447-QKI-NTRK2-R
TCCCATTGGAGATGTGATGGAGTG
SEQ ID NO.12
COSF1447-QKI-NTRK2-P
FAM-TATCAGCAATGATGATGACTCTGC-MGB
SEQ ID NO.13
COSF1449-NACC2-NTRK2-F
CCGGAAGCCGCTGGACAG
SEQ ID NO.14
COSF1449-NACC2-NTRK2-R
TCCCGACCGGTTTTATCAGTGAC
SEQ ID NO.15
COSF1449-NACC2-NTRK2-P
FAM-AACGCTGTGAAATATTATGGAACTG-MGB
SEQ ID NO.16
COSF1332-NTRK1-TPM3-F
TGGCTGCCTTCATGGACAACC
SEQ ID NO.17
COSF1332-NTRK1-TPM3-R
AAGCAGGGTCTGGTCCAGCATC
SEQ ID NO.18
COSF1332-NTRK1-TPM3-P
FAM-TGATAAACTGAAATGCACCAAAGAG-MGB
SEQ ID NO.19
ETV6-F
TCCGAGGACGGGCTGCATAG
SEQ ID NO.20
ETV6-R
GAGGCTGGCTGCAAAGATCACAG
SEQ ID NO.21
ETV6-P
VIC-AGCATCATGGGGACCTGACA-MGB
实施例2
本发明涉及一种用于检测NTRK基因融合突变的试剂盒，主要包括：
(1) 逆转录引物：由6个随机碱基组成；
(2) 特异性引物：针对选定的6种NTRK基因融合突变和用于质控的ETV6基因所设计的特异性引物，引物的Tm值在60℃-62℃之间；
(3) 特异性探针：针对选定的6种NTRK基因融合突变和用于质控的ETV6基因所设计的特异性探针，序列5’端修饰有FAM 或VIC荧光基团，3’端修饰有NFQ-MGB，探针的Tm值在55℃-60℃之间；
(4) 逆转录反应液：包括RNA逆转录酶、5×缓冲液、DTT、dNTPs、RNA酶抑制剂；
(5) qPCR反应液：DNA聚合酶、KCl、MgCl2、Tris-HCl、dNTPs；
(6) 阳性对照品为含有COSF572-ETV6-NTRK3、COSF1535-ETV6-NTRK3、COSF1330-TPM3-NTRK1、COSF1447-QKI-NTRK2、COSF1449-NACC2-NTRK2、COSF1332-NTRK1-TPM3这六种NTRK基因融合的RNA混合样本；
(7) 阴性对照品为不含COSF572-ETV6-NTRK3、COSF1535-ETV6-NTRK3、COSF1330-TPM3-NTRK1、COSF1447-QKI-NTRK2、COSF1449-NACC2-NTRK2、COSF1332-NTRK1-TPM3这六种NTRK基因融合的RNA样本。
优选的，所述试剂盒的保存温度为-20℃。
实施例3
一种检测NTRK基因融合突变的试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
1）样本RNA提取
根据样本性质，使用相应的RNA提取试剂盒进行样本RNA提取，使用无核酸酶水将提取的RNA稀释至10-100ng/μL 备用，提取的RNA的A260/A280值在1.8～2.0之间，提取后的RNA应立即使用，若暂时不用需放置在-70℃以下保存。
2）RNA逆转录为cDNA
将提取的样本RNA、阳性对照品RNA、阴性对照品RNA按照如下体系分别配置反应液：
试剂
体积
逆转录引物（10μM）
2μL
2.5mM each dNTP Mix
4μL
5×First-Strand Buffer
4μL
0.1M DTT
1μL
RNaseOUT Recombinant RNase Inhibitor
1μL
SuperScript III RT
1μL
模板 RNA
2μL
无核酸酶水
补足至20μL
按照下面反应程序进行反应：
温度
时间
循环数
25˚C
5min
1
50˚C
60min
1
70˚C
15min
1
反应结束后，立即放置于冰上至少2分钟，得到cDNA，获得的cDNA作为扩增反应模板备用。
3）实时荧光PCR检测
在超净台中按照下表分别配置COSF572-ETV6-NTRK3、COSF1535-ETV6-NTRK3、COSF1330-TPM3-NTRK1、COSF1447-QKI-NTRK2、COSF1449-NACC2-NTRK2、COSF1332-NTRK1-TPM3六种基因融合检测反应体系：
试剂
体积
2× qPCR mix
10μL
融合F-Primer(10μM)
0.4μL
融合R-Primer(10μM)
0.4μL
融合Probe(10μM)
0.2μL
质控gene-F-Primer(10μM)
0.4μL
质控gene-R-Primer(10μM)
0.4μL
质控gene-Probe(10μM)
0.2μL
50×ROX Dye I
0.4μL
模板cDNA
2μL
无核酸酶水
补足至20μL
按照下面反应程序进行反应：
60℃时采集FAM、VIC通道的荧光。
每个反应均设置阳性对照和阴性对照。
所述阳性对照品为含有COSF572-ETV6-NTRK3、COSF1535-ETV6-NTRK3、COSF1330-TPM3-NTRK1、COSF1447-QKI-NTRK2、COSF1449-NACC2-NTRK2、COSF1332-NTRK1-TPM3这六种NTRK基因融合的RNA混合样本；
所述阴性对照品为不含COSF572-ETV6-NTRK3、COSF1535-ETV6-NTRK3、COSF1330-TPM3-NTRK1、COSF1447-QKI-NTRK2、COSF1449-NACC2-NTRK2、COSF1332-NTRK1-TPM3这六种NTRK基因融合的RNA样本。
4）根据荧光PCR扩增结果进行判读
质控标准：
a)阳性对照品：FAM 通道有正常平滑扩增曲线，VIC通道有正常平滑扩增曲线；
b)阴性对照品：FAM通道没有扩增曲线，VIC通道有正常平滑扩增曲线。
符合上述条件的即为质控合格。
样本检测结果判读：
a)当VIC通道有扩增曲线，FAM通道有扩增曲线，则样本为NTRK基因融合突变阳性；
b)当VIC通道有扩增曲线，FAM通道无扩增曲线，则样本为NTRK基因融合突变阴性或低于本试剂盒的检测下限或样本质量原因或为本试剂盒未覆盖的其他融合类型；
c)当VIC通道没有扩增曲线，实验结果不可信，需重新进行实验。
实施例4
通过对COSF572-ETV6-NTRK3基因融合质粒拷贝数进行梯度稀释，如图3所示，试验结果在满足质控标准的情况下，即VIC通道和FAM通道均有平滑扩增曲线，可检测出最低25个拷贝的基因融合突变阳性质粒。
实施例5
对25拷贝的COSF572-ETV6-NTRK3基因融合质粒，进行10次重复实验，如图4所示，10次试验结果在满足质控标准的情况下，即VIC通道和FAM通道均有平滑扩增曲线，能稳定检出25拷贝的COSF572-ETV6-NTRK3基因融合突变阳性质粒。
实施例6
从复旦大学附属肿瘤医院获得11例经临床病理证实属未分化甲状腺癌（ATC）患者的石蜡包埋组织样本，其中男性3例，平均年龄51岁，女性8例，平均年龄58岁，使用本发明所述的试剂盒（操作方式按照实施例3所述步骤进行）检测这11例患者组织中是否存在NTRK基因融合突变。检测发现，11例患者中有1例女性患者的检测结果呈阳性，其扩增曲线结果如图5所示，根据荧光PCR扩增结果判读标准，该样本的VIC通道有扩增曲线，FAM通道也有扩增曲线，因此判断该样本为NTRK基因融合突变阳性，通过核对特异性的引物和探针组合，我们发现该患者的NTRK基因融合突变类型为COSF572-ETV6-NTRK3。有报道称，NTRK基因融合突变在甲状腺肿瘤中的发生频率并不是很高，我们这次的阳性检出率也仅有9.1%。
随后我们又用二代测序的方法对这11例患者的样本进行了验证，测序结果显示，其中1例女性患者样本中存在NTRK基因融合突变，融合类型为COSF572-ETV6-NTRK3，其他患者样本中没有发现NTRK基因融合突变。以上测序结果和使用本发明试剂盒检测所得的结果完全一致，从而进一步验证了本发明所述试剂盒检测的准确性。
表3 本发明方法和二代测序方法对于NTRK基因融合突变检测结果的比较
最后说明的是，以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制。上文中已经用具体实施方案描述了本发明的基本原理和主要特征，在本发明的基础上，可以对之进行一些修改或替换，但这些修改或者替换并不使相应技术方案的本质脱离本发明要求保护的范围。
序列表
<110>
<120> 一种用于检测NTRK融合基因突变的引物、探针及试剂盒
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
catcgggaag acctggctta catg 24
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccagttctcg cttcagcacg atg 23
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgggagaata gcagatgtgc ag 22
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttccaccctg gaaactctat acacacac 28
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccgtggttga tgtggtgcag tg 22
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
accatgaaga aggtcccgtg 20
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agagacccgt gctgagtttg ctg 23
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtcccaaagt ctgcacaagc ttctac 26
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tggagaagaa ggacgaaaca cc 22
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cacattggca ccagctacat caatc 25
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tcccattgga gatgtgatgg agtg 24
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tatcagcaat gatgatgact ctgc 24
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ccggaagccg ctggacag 18
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tcccgaccgg ttttatcagt gac 23
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aacgctgtga aatattatgg aactg 25
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tggctgcctt catggacaac c 21
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
aagcagggtc tggtccagca tc 22
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tgataaactg aaatgcacca aagag 25
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tccgaggacg ggctgcatag 20
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gaggctggct gcaaagatca cag 23
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
agcatcatgg ggacctgaca 20
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