阅读说明：本技术 一种快速pcr扩增试剂盒及其应用方法 (A kind of rapid PCR amplification kit and its application method ) 是由 孙晓娇 张文平 于 2019-06-12 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种快速PCR扩增试剂盒及其应用方法,所述试剂盒包括DNA聚合酶、dNTPs、内参基因引物群以及缓冲液体系；所述的内参基因引物群包括内参A片段和内参B片段,所述内参A片段包括上游引物F和下游引物R；所述内参B片段包括上游引物F和下游引物R。本发明的PCR扩增试剂盒及其应用方法,结合使用Phire热启动II DNA聚合酶,可实现更长片段靶点的扩增,且错误率较低；试剂盒中添加了PCR增强剂,能够打开核苷酸序列的高级结构；且试剂盒具有便捷、节省资金、提高效率的特点,一步法PCR检测,实现了微量DNA样本快速扩增。(It includes archaeal dna polymerase, dNTPs, reference gene primer group and buffer solution system that the present invention, which provides a kind of rapid PCR amplification kit and its application method, the kit,；The reference gene primer group includes internal reference A segment and internal reference B segment, and the internal reference A segment includes upstream primer F and downstream primer R；The internal reference B segment includes upstream primer F and downstream primer R.PCR amplification kit of the invention and its application method, Phire thermal starting II archaeal dna polymerase is used in combination, it can be achieved that more long segment target spot amplification, and error rate is lower；It is added to PCR reinforcing agent in kit, the higher structure of nucleotide sequence can be opened；And kit have the characteristics that it is convenient, saving fund, improve efficiency, one-step method PCR detection, realize minim DNA sample rapid amplifying.)

一种快速PCR扩增试剂盒及其应用方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种快速PCR扩增试剂盒及其应用方法。

背景技术

PCR是聚合酶链式反应的简称，是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，其研究对生物学各个领域有着深刻的影响，与医、农业、生物工程等的关系十分密切，例如PCR技术涉及在农业上育种的新途径，涉及在医学上检测、治疗遗传疾病，涉及以基因工程为基础的新兴工业，涉及法医物证鉴定、亲子鉴定等。快速PCR包含核酸快速抽提和PCR扩增两部分，经典PCR扩增试剂盒包含PCR缓冲体系、dNTPs、DNA聚合酶等。现有的试剂盒为了配制PCR反应液，会将不同试剂进行反复冻融，每次称量琼脂糖配置凝胶，过程相对繁琐，同时浪费实验耗材。

当前，基因组DNA传统提取方法所提取出来的DNA常含有较多的蛋白残留、多糖的污染、酚类物质的污染(如DNA为褐色)是提取基因组DNA时常遇到的非常棘手的问题，而蛋白、多糖和酚类等杂质对后续的酶切、PCR反应等下游实验有较强的抑制作用。然而，对于极其微量DNA样本，由于PCR扩增反应敏感度低，很难捕捉到有效的DNA信息。对于微量的DNA样本，常规的PCR扩增方法的反应敏感度低是导致后续PCR扩增效果差的主要原因。例如，在法医侦检工作中，犯罪现场的法医学物证的鉴定和检出，对于及时有效地指证犯罪分子，打击犯罪起到至关重要的作用。犯罪现场中指纹、烟蒂、指甲等都含有微量的DNA信息，可为找出或指证犯罪嫌疑人提供科学依据。但由于犯罪现场的DNA残留甚微，采集到的痕迹法医物证DNA极其微量，常规PCR扩增方法的反应敏感度低，难以捕捉到有效DNA信息从而扩增效果较差，直接导致后续的DNA检出率低，STR分型失败，不能指认犯罪个体。

如何利用PCR技术手段，实现实时、便捷、快速监测微量样本基因变异，包括基因突变、缺失、融合等信息，用于临床辅助诊断、靶向用药方案的指导，具有显著的意义，特别是对于技术难点很高的如何实现超微量变异DNA的扩增上。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种实现超微量变异DNA的扩增的快速PCR扩增试剂盒及其应用方法，可适用于基础科研、临床快速PCR扩增等用途。

为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种快速PCR扩增试剂盒，其包括DNA聚合酶、dNTPs、内参基因引物群以及缓冲液体系；所述的内参基因引物群包括内参A片段和内参B片段，所述内参A片段包括上游引物F和下游引物R；所述内参B片段包括上游引物F和下游引物R；其中，所述内参A片段的所述上游引物F的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，所述下游引物R的核苷酸序列为SEQ ID NO：2；所述内参B片段的所述上游引物F的核苷酸序列为SEQ ID NO：3，所述下游引物R的核苷酸序列为SEQ ID NO：4。

优选地，所述内参A片段大小为：200-300bp，所述内参B片段大小为：1000-1100bp。

再优选地，所述的快速PCR扩增试剂盒还包括PCR增强剂，所述的PCR增强剂包含DMSO、甘油、甲酰胺中的一种或两种。

再优选地，所述DMSO的工作浓度为1-10％(v/v)，所述甘油的工作浓度为1-20％(v/v)，所述甲酰胺的工作浓度为1-10％(v/v)。

再优选地，所述缓冲液体系为10×缓冲液，包括浓度为500mmol/L Tris-HCl和20mmol/L的MgCl₂，所述Tris-HCl的PH值为9.0。

再优选地，所述dNTPs的浓度为2.5mmol/L；所述DNA聚合酶活性为2.5U/μL。

再优选地，所述上游引物F和所述下游引物R的浓度为10μmol/L。

再优选地，所述的DNA聚合酶为Phire热启动II DNA聚合酶。

根据本发明的另一目的，本发明还提出所述的快速PCR扩增试剂盒的应用方法，应用所述的快速PCR扩增试剂盒的PCR反应体系为：

PCR扩增试剂盒扩增条件为：95℃预变性3min，95℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸30s，30个循环后延伸5min。

再优选的，所述的快速PCR扩增试剂盒的应用方法还包括进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，稳定电压为130V，电泳时间20分钟。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1.与现有技术PCR扩增试剂盒相比，本发明结合使用Phire热启动II DNA聚合酶，含有增强DNA聚合酶扩增能力，使其具有极强的抗抑制剂能力的成分，可实现更长片段靶点的扩增，且错误率较低；

2.与现有技术相比，本发明试剂盒中添加了PCR增强剂DMSO、甘油、甲酰胺中的一种或两种，能够打开核苷酸序列的高级结构；

3.本发明所述的快速PCR扩增试剂盒具有便捷、节省资金、提高效率的特点，一步法PCR检测，实现了微量DNA样本快速扩增。

附图说明

图1为一步法PCR内参基因A片段扩增检测结果图；

图2为一步法PCR内参基因B片段扩增检测结果图。

具体实施方式

为使对本发明的目的、构造、特征、及其功能有进一步的了解，兹配合实施例详细说明如下。

本发明的目的是提供一种快速PCR扩增试剂盒，所述的PCR试剂盒包括DNA聚合酶、dNTPs、内参基因引物群、缓冲液体系；所述的内参基因引物群包括用于扩增内参A片段(含上游引物F和下游引物R)和B片段(含上游引物F和下游引物R)，所述的引物群的序列见信息表1：

内参A片段的上游引物F的核苷酸序列为SEQ ID NO:1，内参A片段的下游引物R的核苷酸序列为SEQ ID NO:2；

内参B片段的上游引物F的核苷酸序列为SEQ ID NO:3，内参B片段的下游引物R的核苷酸序列为SEQ ID NO:4；

本发明为保证PCR高效扩增，对DNA聚合酶进行优化，使用Phire热启动II DNA聚合酶，含有增强DNA聚合酶扩增能力，使其具有极强的抗抑制剂能力的成分，可实现更长片段靶点的扩增，且错误率较低，从而使得快速PCR扩增成为可能；

本发明试剂盒添加了PCR增强剂DMSO、甘油、甲酰胺中的一种或两种，目的是为打开核苷酸序列的高级结构。

在工作时，所述的DMSO的工作浓度为1-10％(v/v)，所述的甘油的工作浓度为1-20％(v/v)。所述的甲酰胺的工作浓度为1-10％(v/v)。

在一优选的实施方式中，本发明的内参基因A片段的大小为：100-300bp；内参基因B片段的大小为1000-1100bp。

应用本发明的快速PCR扩增试剂盒进行PCR扩增的反应体系建立如下：

10×缓冲液	5μL
		dNTPs(2.5mmol/L)	4μL
上游引物F(10μmol/L)	1μL
		下游引物R(10μmol/L)	1μL
增强剂	2μL
		模板DNA	100ng
DNA聚合酶(2.5U/μL)	2μL
		双蒸水	补足至50μL

采用所述的PCR扩增反应体系进行PCR反应扩增条件为：95℃预变性3min，95℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸30s，30个循环后延伸5min。

本发明使用公式(A+T)×2+(G+C)×4－(5℃～8℃)确定PCR退火温度进行PCR扩增；另外，扩增后，进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，稳定电压130V，电泳时间20分钟。

实施例1：

采用本发明的快速PCR扩增试剂盒和反应体系及反应条件用人基因组DNA中内参基因A片段进行扩增，并取适量小鼠心脏、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉、脚趾、鼠尾、骨骼、毛组织进行核酸DNA PCR扩增实验，参见图1所示的扩增后的琼脂糖凝胶电泳检测结果，其中1泳道为DNA marker，2～12泳道分别为小鼠心脏、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉、脚趾、鼠尾、骨骼、毛组织的核酸DNA扩增结果，13泳道为人类基因组DNA扩增结果，14泳道为阴性对照(即ddH₂O为模板)。

实施例2：

采用本发明的快速PCR扩增试剂盒和反应体系及反应条件用人基因组DNA中内参基因B片段进行扩增，并取适量小鼠心脏、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉、脚趾、鼠尾、骨骼、毛组织进行核酸DNA提取与PCR扩增实验，参见图2所示的扩增后的琼脂糖凝胶电泳检测结果，其中1泳道为DNA marker，2～12泳道分别为小鼠心脏、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉、脚趾、鼠尾、骨骼、毛组织的核酸DNA扩增结果，13泳道为人类基因组DNA扩增结果，14泳道为阴性对照(即ddH₂O为模板)。

本发明的快速PCR扩增试剂盒及其应用方法，与现有技术PCR扩增试剂盒相比，结合使用Phire热启动II DNA聚合酶，含有增强DNA聚合酶扩增能力，使其具有极强的抗抑制剂能力的成分，可实现更长片段靶点的扩增，且错误率较低；本发明试剂盒中添加了PCR增强剂DMSO、甘油、甲酰胺中的一种或两种，能够打开核苷酸序列的高级结构；另外，3.本发明的快速PCR扩增试剂盒具有便捷、节省资金、提高效率的特点，一步法PCR检测，实现了微量DNA样本快速扩增。

本发明已由上述相关实施例加以描述，然而上述实施例仅为实施本发明的范例。必需指出的是，已揭露的实施例并未限制本发明的范围。相反地，在不脱离本发明的精神和范围内所作的更动与润饰，均属本发明的专利保护范围。