阅读说明：本技术 两部分式中介探针 (Two-part intermediary probe ) 是由 马丁·特罗特 西蒙·瓦德勒 费利克斯·冯·施特滕 莉萨·贝赫勒 于 2017-12-15 设计创作，主要内容包括：本发明涉及用于检测至少一种靶分子的包括至少两个寡核苷酸的中介探针。根据本发明的中介探针的第一寡核苷酸包括探针区和中介体结合区,其中,探针区对靶分子和/或模板分子具有亲和力,并且中介体结合区对至少一种中介体具有亲和力。中介探针的至少一个另外的寡核苷酸是中介体,其经由中介体结合区与中介探针的第一寡核苷酸结合,并且对至少一种检测分子具有亲和力。在中介探针的第一寡核苷酸释放后,中介体通过与检测分子的相互作用触发可检测的信号。此外,本发明涉及包括至少一种根据本发明的中介探针和至少一种检测分子的系统,以及用于检测至少一种靶分子的方法。(The present invention relates to intermediary's probes including at least two oligonucleotides for detecting at least one target molecule.First oligonucleotides of intermediary's probe according to the present invention includes probe region and mediator combined area, wherein probe region has affinity to target molecule and/or template molecule, and mediator combined area has affinity at least one mediator.At least one other oligonucleotides of intermediary's probe is mediator, via mediator combined area in conjunction with the first oligonucleotides of intermediary probe, and has affinity at least one detection molecules.After the first oligonucleotides release of intermediary's probe, mediator triggers detectable signal by the interaction with detection molecules.In addition, the present invention relates to the system including at least one intermediary's probe and at least one detection molecules according to the present invention, and the method for detecting at least one target molecule.)

两部分式中介探针

引言

本发明涉及用于检测至少一种靶分子的中介探针，其包括至少两个寡核苷酸。根据本发明的中介探针的第一寡核苷酸包括探针区和中介体结合区，其中，探针区对靶分子和/或模板分子具有亲和力，并且中介体结合区对至少一种中介体具有亲和力。中介探针的至少一个另外的寡核苷酸是中介体，其经由中介体结合区与中介探针的第一寡核苷酸结合，并且对至少一种检测分子具有亲和力，其中，在从中介探针的第一寡核苷酸释放后，中介体通过与检测分子的相互作用触发可检测的信号。此外，本发明涉及一种系统，其包括至少一种根据本发明的中介探针和至少一种检测分子，以及一种用于检测至少一种靶分子的方法。

背景技术

DNA扩增尤其用于疾病研究的临床诊断中。DNA扩增涉及复制大量所需靶序列的拷贝，以使最初少量的DNA变的可见。

DNA扩增可以通过各种方法进行。除了需要在约60℃至95℃之间进行热循环的PCR之外，还使用等温扩增方法，诸如LAMP(62℃)或RPA(39℃)。有多种方法可用于实时跟踪DNA扩增和扩增产物的检测。尤其，基于生物发光、化学发光、浊度测量和荧光的检测方法能够检测和定量待检查的DNA。大多数上述方法仅能够检测样品中扩增的DNA的总量，并且不能区分不同的靶序列。因此，这些方法仅适用于所谓的单重验证。基于荧光以及发光、电化学和其他检测方法开辟了另外的应用可能性。除了嵌入与DNA链非特异性相互作用的检测分子外，还使用了修饰的寡核苷酸。后者可以用于靶序列特异性分析，而嵌入检测分子经常导致非特异性副产物的假阳性检测。

在临床分析和体外诊断中，能够在反应中平行检测几种目标分子是有意义的，因为例如不同的细菌或病毒可能是各种疾病的原因。因此，多分析物验证非常重要，为此下面列出了一些实例：例如，ABO基因分型不仅与血型测定有关，而且与人嗜中性粒细胞抗原谱(HNA)的产生有关，其对于血液和组织输注是必需确定的。还使用基于免疫测定或核酸的技术常规地进行了血液供体样品的HIV变体和B型或C型肝炎病毒的平行测试。病原体的特异性检测需要确定几种遗传基因座，以便在短的分析时间后进行衍生的诊断。

不同标记物和对照基因的活性测定允许产生表达谱。例如，这可以用于识别影响细胞***和细胞分化并且因此与癌症密切相关的癌基因，或者用于根据患者的基因型(个性化医疗)预测某些药物的功效。在分子生物学(产前)诊断中也可以检测到经常出现的遗传性疾病，包括囊性纤维化(囊性纤维化)、苯丙酮尿症(代谢紊乱)和地中海贫血(红细胞降解)。此外，联合检测炎症标志物诸如降钙素原或细胞因子可以得出关于感染严重程度的结论。

如果，如上述实例中，诊断问题需要分析几种靶分子、遗传基因座或其他标记物以及内部对照或参考，那么仅允许每次分析确定单个参数的方法通常没有意义。另一方面，如果平行地进行不同的单个分析以记录数个参数，则这是不经济的：样品溶液必须分成几个检测不同的靶分子的反应批次。产生的问题如下：通过将样品溶液分成n个等分试样，单个反应中的物质的量减少为1/n，因此检测反应的灵敏度相应降低。

为了避免这些缺点，开发了平行检测了不同的靶分子的均相或非均相反应方法以捕获若干个参数。使用各种为检测而标记的寡核苷酸，其特异性结合待检测的靶分子。在上述标记的寡核苷酸和靶分子之间的直接依赖性中，出现的问题是，如果出现新的实验问题，例如如果要检测不同的病毒基因型，必需使用新的探针。这使得对于每个新的实验问题必需开发新的标记的寡核苷酸用于检测。由于检测所需的寡核苷酸的修饰，这是耗时且昂贵的。

作为均相反应方法中平行检测不同靶序列的替代方案，可以在固相上固定化寡核苷酸用于检测(非均相检测)。取决于固定相的信号位置，可以推断出某些靶序列的存在。标记的寡核苷酸和靶分子之间的直接依赖性再次引起以下问题：固定化的寡核苷酸必须适应实验问题。对于每个新的实验问题，必须将新的寡核苷酸固定在固相上。由于复杂的制备过程，这非常耗时。

具有用于检测的标记物的靶序列特异性寡核苷酸或位于固相不同位置的靶序列特异性寡核苷酸的不利用途导致需要通用检测方法，其是序列特异性的并且仍然是有成本效益的。在通用方法中，产生信号的寡核苷酸(检测分子)的序列不依赖于待检测的靶序列。相同优化的产生信号的寡核苷酸可以用于不同的靶序列。结果，可以节省工作时间并因此节省劳动力成本，因为不必为每个检测反应重新调节产生信号的寡核苷酸。

序列特异性的通用检测方法是已知的，但是它们具有一些缺点。特别地，使用的酶仅与某些扩增方法主要是非等温扩增方法相容。这些包括，例如，根据2012年Faltin等人多分析物报告系统和根据2008年Yang等人使用的通用双重探针。在所提到的方法中，具有这种核酸酶活性的酶，例如聚合酶，是绝对必要的，尽管LAMP或RPA中使用的聚合酶不具有这种核酸酶活性。所谓的链置换聚合酶(stranddisplacement polymerases)很难用于序列特异性的通用检测。另外，根据2008年Yang等人的程序存在产生假阳性信号的风险。

WO 2013079307 A1描述了使用包括中介探针和通用报告物分子的系统来检测至少一种靶分子的通用方法。通过切割释放的中介体需要具有核酸酶活性的酶。在PCR中，聚合酶在大多数形式中具有这种核酸酶活性，这就是为什么这种扩增方法不需要额外的酶。然而，在等温扩增方法中，诸如LAMP或RPA，或在PCDR中，所用的聚合酶不具有这种核酸酶活性。因此，只有通过添加表现出核酸酶活性的酶才能通过切割释放中介体。其缺点是额外的酶与反应混合物中的其他组分相互作用，并且因此可能影响检测反应的效率。此外，对额外的酶的需求增加了用于检测反应的反应混合物的成本。此外，使用额外的酶导致了在变化的条件下优化检测反应的额外工作量。

US 2016/0312271 A1描述了使用包括可切割探针和通用检测分子的系统来检测至少一种靶分子的通用方法。在根据US 2016/0312271A1的程序中，类似于WO 2013079307A1通过切割寡核苷酸触发了检测反应。因此，出现了相同的缺点，即具有核酸酶活性的酶是必需的。

还描述了使用引物的现有技术方法，其包括发夹形成序列、共价结合的荧光团或共价结合的荧光标记的探针。另外，使用了第二荧光标记的探针，其与扩增子结合并可与第一荧光团相互作用。靶序列特异性的发夹形成序列和靶序列特异性的第二探针导致荧光团不附连通用序列区段的缺点，并且因此该方法不能通用。因此，针对新的检测反应必须单独优化信号生成。另外，当使用链置换聚合酶时，额外的第二探针存在风险，这是因为与引物结合的第一探针可以延伸并因此置换第二探针。

对于此，应该提及根据2012年Tanner等人的在LAMP中使用链置换聚合酶对扩增产物进行的序列特异性检测。通过这种检测方法，荧光供体和荧光接受体与靶序列特异性的寡核苷酸结合，这就是为什么该方法不是通用的，并且因此具有针对每个新的检测反应必须优化检测的缺点。

此外，描述了基于分子信标的检测方法，其包括引物序列并因此具有靶序列特异性的区域。另一个缺点是由于对靶序列的依赖，因为产生信号的标记物定位于靶序列特异性的寡核苷酸，这就是为什么这种检测方法不通用。此外，荧光产率以及分子信标的闭合和开放构象之间的平衡取决于引物序列。因此，针对每个新的检测反应必须单独优化检测反应。

文献中描述的使用链置换聚合酶的通用技术也具有一些缺点。例如，根据2006年Li等人或CN 101328498 A使用与引物杂交的分子信标，由于分子信标的发夹结构的稳定性，在缺乏靶分子的情况下存在产生假阳性信号的风险(Li等人，2007年)。此外，该检测方法迄今仅用于经由PCR的扩增反应。等温扩增方法的功能尚未得到证实，并且发夹结构的稳定性在较低温度(LAMP，RPA)更加明显，这不建议该方法与等温扩增的组合的用途。根据1999年G.J.Nuovo等人的通用荧光标记引物的使用又涉及以下风险：通用引物的杂交也可能导致非特异性扩增产物中的假阳性信号的产生。

现有技术的方法都不允许在可以产生样品的组合的DNA-RNA-蛋白质谱的一个步骤中平行检测不同的分子和分子类别，诸如蛋白质和核酸。

对于需要分析来自不同物质类别的几种不同靶分子的诊断问题，可以同时检测不同的物质类别(诸如蛋白质和核酸)的检测方法是有利的。文献中描述的允许同时检测几种分子类别的检测方法要么不是通用方法(Das等人，2012)，要么具有额外的缺点使得检测反应必须在几个阶段进行(Linardy等人，2016年)，这实施期间需要大量工作和时间。

这使得需要一种序列特异性的通用检测方法，该方法可以同时检测几种分析物并且避免现有技术方法的缺点。另外，需要一种可用于不同扩增方法的检测方法，无论后者是等温还是非等温。

因此，本发明基于以下目的：提供没有表现出上述现有技术的缺点的中介探针以及用于检测至少一种靶分子的系统和方法。因此，目的是提供一种中介探针和一种方法，该方法基本上允许同时、通用和/或序列特异性的检测不同分子类别的几种分析物。

该目的由独立权利要求实现。有利的实施方式由从属权利要求得出。

根据本发明，通过提供用于检测至少一种靶分子的两部分式中介探针来实现本技术目的。

用于检测至少一种靶分子的本发明的中介探针包括至少两个寡核苷酸，并且其特征在于

a)第一寡核苷酸包括探针区和中介体结合区，其中

o探针区对靶分子和/或模板分子具有亲和力，以及

o中介体结合区对至少一种中介体具有亲和力，以及

b)至少一个另外的寡核苷酸是中介体，其

o经由中介体结合区与中介探针的第一寡核苷酸结合，以及

o对至少一种检测分子具有亲和力，其中，在从中介探针的第一寡核苷酸释放后，中介体通过与检测分子的相互作用触发可检测的信号。

因此，根据本发明的中介探针包括第一分子或第一寡核苷酸和第二分子或第二寡核苷酸，即中介体；第一分子或第一寡核苷包括中介体结合区和探针区。第一分子的探针区对靶分子和/或模板分子具有亲和力，并且中介体结合区对一种中介体(mediator)或多种中介体(mediators)具有亲和力。如果探针区不能直接与靶分子相互作用，则使用模板分子。因此，模板分子用作靶分子和探针区之间的介质。

在探针区与靶分子和/或模板分子结合后，中介体通过分子从中介体结合区被置换，该分子优选具有DNA链分离效应的酶以及具有额外的聚合效应的某些形式，优选链置换聚合酶。中介体与检测分子的相互作用触发可检测的信号。链置换聚合酶具有链置换活性，并在扩增期间置换与扩增链互补的链。

完全出乎意料的是，通过巧妙地利用中介探针的普遍适用性，可以将其用于检测不同的靶分子。令人惊讶的是，可以使用根据本发明的几种中介探针在一个样品中同时检测几种靶分子。

根据本发明的中介探针能够对靶分子和/或模板分子的任何核酸序列进行通用的序列依赖性检测。可以使用具有固定设计的检测分子，固定设计不依赖于靶序列或中介探针的探针区。

令人惊讶的是，中介体的释放和随后的通过与检测分子相互作用的信号产生可以应用于不同的扩增方法，并且不限于特定的系统。通过巧妙地利用不同扩增方法中的各个条件，上述中介体释放可以容易地适应各个系统。

存在各种基于标记的寡核苷酸探针或引物用于检测靶核酸序列的现有技术系统。然而，相比于此处所述的以根据本发明的系统和根据本发明的中介探针为基础的根据本发明的方法，这些方法不是可以不依赖于靶序列的不同靶特异性分子进行的通用检测方法。

产生信号的修饰，诸如荧光团和猝灭剂，通常应用于靶序列特异性的寡核苷酸(引物)。在这些情况下，产生信号的分子不能用于不同的检测反应，因为它必须针对每种靶分子单独设计和优化。因此，本发明相对于现有技术的巨大优点是产生信号的通用检测分子的普遍适用性，该通用检测分子与根据本发明的中介探针一起使用。这些通用报告物分子含有产生信号的分子，但没有靶序列特异性的片段。通用报告物分子可以用于检测不同的靶分子，无需重新设计或优化报告物分子。只需要调整两部分式中介探针。根据本发明的中介探针还具有简化的引物设计。与现有技术的系统形成对比，用作引物的寡核苷酸不必含有能够发荧光或连接分子的分子，也不含有第二靶序列特异性的区域。

在扩增过程期间，引物的荧光团标记的和猝灭剂标记的剩余部分通过链置换聚合酶从靶分子被置换，从而将信号恢复到其原始状态并且不能保证持续的信号变化。此外，许多现有技术的检测方法需要具有核酸酶活性的酶，例如，聚合酶，但在LAMP或RPA的情况下，本发明中使用的聚合酶不具有这个核酸酶活性。根据本发明，优选不需要核酸酶活性，这也是为什么使用等温扩增方法。然而，许多现有技术的检测方法不能与等温扩增方法诸如LAMP一起使用。

与现有技术的程序形成对比，根据本发明的方法优选不***中介探针。与所述系统形成对比，中介探针是两部分式的，使得可以发生中介体的释放而无需通过置换***共价键。这有利地允许在等温扩增反应中实时检测靶分子，其中，不使用具有核酸酶活性的聚合酶。另外，通过每种中介探针使用多种中介体可以扩增检测信号并且探针的不同中介体可以产生不同的检测信号。根据本发明，即使每种中介探针使用几种中介体，也只需要一种靶分子的特异性结合位点。然而，对于已知的现有技术的系统或程序，如果要释放多种中介体，则必须使用几个完整的中介探针系统。

已知现有技术的系统含有具有靶分子特异性序列的引物，并且可以与荧光团标记的探针杂交。然而，与这些方法形成对比，根据本发明的两部分式中介探针的中介体优选未负载任何产生信号的标记物。如果荧光团通过单独的探针杂交与引物结合，则荧光团仍可能受引物的靶序列特异性部分影响。如果引物序列中存在鸟嘌呤碱基，则荧光团的荧光产率可能受到鸟嘌呤碱基的负面影响。因此，荧光团的荧光产率对通过引物序列中靶序列特异性区段对单独探针产生影响/依赖性。另外，在大多数情况下，不使用具有通用序列的检测分子。

还描述了现有技术的引物，其具有发夹形成序列和共价地或通过杂交探针结合的荧光团。发夹形成序列包括第二靶序列特异性区域。然而，优选地，根据本发明的中介探针的第一部分仅包括一个靶序列特异性区域或序列。另外，根据本发明的中介探针优选不包括发夹形成序列和仅一个靶序列特异性区域。另外，已知的系统需要引物和通常两种额外的标记的探针，其中，至少一种探针是靶序列特异性的。因此，这个引物/探针系统由具有靶分子特异性序列的两个或三个分子组成。相反，本发明的中介探针优选仅具有一个具有靶分子特异性序列的分子。此外，某些形式的中介探针不包括标记物。中介体还优选不包括靶分子特异性序列。

鉴于已知的现有技术，本发明是一种全新且令人惊讶的发展。现有技术没有揭示类似的使用酶的链置换活性工作的检测系统。相反，其描述了可以在PCR条件下使用不具有链置换活性的聚合酶进行的检测方法。

完全出乎意料的是，根据本发明开发了中介探针、系统和程序，以利用通过具有链置换效应的酶的中介体的活性置换。许多现有技术的方法是基于所用聚合酶的绝对必要的核酸酶活性。切割和置换反应之间没有明显的联系。此外，对于专家而言，对使用聚合酶的核酸酶活性以这样的方式使其通过置换酶起作用的已知方法进行调整是不明显的或微不足道的，因为必须以不同方式修改或重组大量的反应条件。

对于专家而言，在不运用通用检测原理的情况下，将已知的通用检测方法与使用杂交的靶序列特异性引物和靶序列特异性探针的已知方法组合也不是显而易见的。

这里描述的根据本发明的中介探针的优点特别适用于中介探针、根据本发明的系统和根据本发明的方法的优选实施形式。

在本发明的上下文中检测靶分子意味着定量或定性地检测待研究样品中靶分子的存在。根据本发明，靶分子是在样品中其存在待检测的分子。它是生物分子，诸如但不限于核酸分子、蛋白质、肽、糖分子、脂质或这些分子的结合，诸如糖基化蛋白质或其他糖基化生物分子。

本发明意义上的术语核酸包括但不限于DNA、RNA、PNA、ssDNA、dsDNA、RNA、mRNA、tRNA、lncRNA、ncRNA、microRNA、siRNA、rRNA、sgRNA、piRNA、rmRNA、snRNA、snoRNA、scaRNA、gRNA、病毒RNA或修饰的RNA诸如LNA。本发明意义上的寡核苷酸是包括大约至多200个核苷酸的长度相对短的核酸分子。

本发明意义上的糖分子特别地是碳水化合物或糖类，并且包括单糖、二糖、寡糖和多糖。糖基化描述了一系列酶促或化学反应，其中，碳水化合物与蛋白质、脂质或其他糖苷配基结合。在脂质作为糖脂的情况下，或者在蛋白质作为糖蛋白或肽聚糖的情况下，所得反应产物称为糖苷。

在本发明的意义上，术语“脂质”是指完全或至少大部分是水不溶性(疏水)的物质，这是由于它们的低极性，它们在疏水(或亲脂)溶剂中非常好地溶解。脂质是细胞膜中的结构组分，并且还在活生物体中用作能量储存或信号分子。大多数生物脂质是两亲性的，即它们具有亲脂性烃残基和极性亲水性头部基团，这就是为什么它们在极性溶剂诸如水中形成胶束或膜。脂质类特别地包括脂肪酸、三酰基甘油酯(脂肪和脂肪油)、蜡、磷脂、鞘脂、脂多糖和类异戊二烯(类固醇、类胡萝卜素等)。

探针区优选与靶分子和/或模板分子的区段互补。中介探针的第一寡核苷酸的探针区与靶分子和/或模板分子结合。结合是经由中介探针的探针区发生的，因为其对靶分子和/或模板分子具有亲和力。中介体结合区不需要对模板分子具有任何亲和力并且不需要具有互补的序列片段。

中介体优选具有与检测分子的区段互补的区域。中介体与检测分子结合，触发可检测的信号。可检测的信号允许得出关于靶分子或模板分子的存在的结论。模板分子本身可以是待检测的靶分子，或者它可以与靶分子相关联使得可以经由模板分子产生关于靶分子存在的信息。

根据本发明的检测分子是寡核苷酸，其可以与靶分子间接地相互作用并且可以通过处理(例如荧光信号、电化学信号或质量的变化)引起检测反应。

如果用于本发明检测方法的试剂，例如，引物或探针或本发明的中介探针不能直接与靶分子相互作用时，模板分子是可以使用的核酸分子。因此，模板分子可以用作靶分子和引物或探针之间的中介体。适体通常用作模板分子。

适体是寡核苷酸，这是由于它们的结构特性与其他分子或分子复合物相互作用或结合。被适体结合的分子可以是蛋白质、肽、糖分子、脂质分子、核酸分子或由这些分子形成的分子复合物。适体可以在结合和未结合状态下呈现不同的构象，使得例如适体的不同序列区域可以与互补的寡核苷酸诸如引物或探针相互作用，这取决于构象。

本发明意义上的相互作用是指不同相互作用分子的彼此相互作用。这可以是，例如，两个分子之间的共价或非共价键，或由一个或多个其他分子介导的间接键，例如在分子复合物内。

在本发明的上下文中，可检测的信号是指可以物理或化学测量的任何种类的变化。这些变化包括但不限于切割、消化、链复制、内部杂交、磷酸化、去磷酸化、酰胺化、化学基团的结合或切割、荧光、磷光或发光变化。

在根据本发明的中介探针的优选设计中，中介探针的第一寡核苷酸和/或中介体不包括用于产生信号的标记物。这种未标记的中介探针的决定性优点是它可以用于根据本发明的方法中，用于检测至少一种靶分子而不需要对于新的测定优化劳动和成本。与现有技术相比，中介探针由寡核苷酸的组成，其可以有成本效益地合成，而无需技术上复杂的修饰，诸如荧光供体和/或荧光接受体和嵌段基团。

术语标记物优选地指任何可以用于提供可检测(优选可定量)的信号的原子或分子，并且其可以与核酸或蛋白质或其他生物分子共价或非共价结合。标记物可以提供可以通过氧化还原反应、发光、荧光、放射性、比色法、重量分析、X射线衍射或吸收、磁性、酶活性等检测的信号。

在优选的形式中，中介探针和/或中介体的第一寡核苷酸包括一种或多种用于产生信号的标记物，优选荧光分子、氧化还原分子、发光分子或其他产生信号的单元。

在本发明的另一个优选形式中，中介体包括一种或多种用于产生信号的标记物，优选荧光分子、氧化还原分子、发光分子或其他产生信号的分子或其他产生信号的单元。根据本发明，在从中介探针置换后中介体可以与检测分子结合，检测分子也含有至少一种用于产生信号的标记物，引起可检测的信号变化。

例如，与中介探针结合的中介体可以标记有在特定波长λ₁处发射的荧光供体/接受体。在中介探针置换后，中介体可以与标记有在第二波长λ₂处发射的荧光接受体/供体的检测分子结合，第二波长λ₂与λ₁不同。经由FRET机制从荧光供体到荧光接受体的能量转移导致荧光接受体的辐射强度的可检测的增加，这允许λ₂的发射被检测到。或者，可以使用化学发光或生物发光供体分子。非发光荧光接受体也可用于优选的设计中。通过使用具有不同核苷酸数量的检测分子，可以通过熔解曲线分析在一个样品中同时区分不同的靶分子。

通过标记中介体，所描述的检测方法的通用特征不会丢失，因为中介体是通用的、不依赖于靶序列的分子。在另外的设计中，可以使用每种靶分子的几个探针或引物与标记的中介体结合，其中中介体和标记的序列可以不同。例如，可以使用具有不同发射波长的荧光染料。

根据本发明的中介探针的优选形式的特征在于从中介探针的第一寡核苷酸的中介体释放发生于与中介探针结合的靶分子和/或模板分子的扩增期间。

在本发明意义上的术语扩增或扩增反应是指生物分子，优选核酸分子的扩增。借助于称为聚合酶的酶扩增了核酸。在扩增中，初始序列称为扩增子，并且产物称为扩增产物。

在根据本发明的中介探针的优选形式中，第一寡核苷酸具有1至200，优选20至80，特别优选35至65个核苷酸，并且中介体具有1至60，优选10至50，特别优选15至40个核苷酸。

根据本发明中介探针的优选形式，靶分子和/或模板分子是选自由以下组成的组的生物分子：核酸、DNA、RNA、肽、蛋白质、适体，和/或其组合。

在本发明的优选实施方式中，靶分子是模板分子。在其他优选形式中，靶分子与模板分子相互作用。

在根据本发明的中介探针的优选形式中，中介探针的第一寡核苷酸的3'末端用作扩增反应的起始点，并且因此可以用作引物。这是一种优于已知现有技术的方案的决定性优势，因为用于新靶分子的中介探针不必完全重新设计以及选择靶分子中的探针区，而现有的引物可以容易地以这样的方式被修饰使得其可以作为根据本发明的中介探针发挥功能。

在根据本发明的中介探针的另一个优选形式中，中介探针的第一寡核苷酸的3'末端不用作扩增反应的起始点。在靶分子不存在的情况下，相应的中介探针可以形成发夹结构使得其处于闭合形式，中介体与中介探针的第一寡核苷酸结合。在靶分子存在的情况下，中介探针与靶分子或模板分子结合，由此引物可以结合现在打开的中介探针的第一寡核苷酸。通过用合适的酶系统处理，可以延伸附着的引物，由此中介探针置换中介体。释放的中介体可以借助于特异性的检测分子来检测。在实施例18中示出了优选的执行实例。

在优选的设计中，根据本发明的中介探针的第一寡核苷酸可以包括适体区、中介体结合区和引物结合区。待检测的靶分子可以是蛋白质或肽，例如，但不限于此。在靶分子不存在的情况下，引物可以结合中介探针的第一寡核苷酸的引物结合区，并且通过使用合适的酶系统延伸引物的3'末端，中介体从中介探针释放。释放的中介体可以使用特异性的检测分子或方法触发可检测的信号。在靶分子存在的情况下，中介探针的适体区与靶分子结合，由此不能延长与引物结合区域附连的引物，并且因此中介探针不会释放中介体。如果存在靶分子，则与不存在靶分子相比，检测到信号下降。

此外，本发明涉及包括至少一种根据本发明的中介探针和至少一种检测分子的系统，其特征在于至少一种检测分子包括一个或多个寡核苷酸并且包括与至少一种中介体相互作用的至少一个第一区域，并且其中至少一种检测分子包括一个或多个寡核苷酸，并且包括与至少一种中介体相互作用的至少一个第一区域，以及

a)第二区域，包括荧光接受体或荧光供体和/或用于结合固相的化学基团和/或化学保护基团和/或氧化还原修饰和/或发光修饰，和/或

b)第三区域，包括荧光供体或荧光接受体和/或用于结合固相的化学基团和/或化学保护基团和/或氧化还原修饰和/或发光修饰，

或者

c)至少一个第四区域，其与具有荧光供体和/或荧光接受体的至少一种第一探针相互作用，和/或

d)至少一个第五区域，与包括荧光供体和/或荧光接受体的至少一种第二探针相互作用

或者

e)由两个寡核苷酸组成，两个寡核苷酸中的两个或仅一个具有荧光接受体或荧光供体和/或用于结合固相的化学基团和/或化学保护基团和/或氧化还原修饰和/或发光修饰。

与至少一种检测分子相互作用的探针可以被认为是本发明意义上的检测分子的部分。在这种情况下，检测分子包括不止一个寡核苷酸。

这里描述的检测分子的不同区域在本发明的优选形式中可以重叠或相同。

此外，本发明涉及包括至少一种根据本发明的中介探针和至少一种检测分子的系统，其特征在于至少一种检测分子包括一个或多个寡核苷酸并且包括与至少一种中介体相互作用的至少一个第一区域，并且其中至少一种检测分子包括一个或多个寡核苷酸并且包括与至少一种中介体相互作用的至少一个第一区域，以及

a)第二区域，包括荧光接受体或荧光供体和/或用于结合固相的化学基团和/或化学保护基团和/或氧化还原修饰和/或发光修饰，和/或

b)第三区域，包括荧光供体或荧光接受体和/或用于结合固相的化学基团和/或化学保护基团和/或氧化还原修饰和/或发光修饰，

或者

c)至少一个第四区域，其与具有荧光供体和/或荧光接受体的至少一种第一探针相互作用，和/或

d)至少一个第五区域，与包括荧光供体和/或荧光接受体的至少一种第二探针相互作用。

此外，本发明涉及一种系统，其包括至少一种根据本发明的中介探针和至少一种检测分子，其中，至少一种检测分子是寡核苷酸并且包括与至少一种中介体相互作用的至少一个第一区域，以及

a)位于至少一种检测分子的5'末端的第二区域，其具有荧光接受体或荧光供体和/或用于结合固相的化学基团和/或化学保护基团和/或氧化还原修饰和/或发光修饰，以及

b)第三区域，包括荧光供体或荧光接受体和/或氧化还原修饰和/或发光修饰和/或用于结合固相的化学基团和/或化学保护基团，

或者

c)至少一个第四区域，其与具有荧光供体和/或荧光接受体的至少一种第一探针相互作用，和/或

d)至少一个第五区域，其与包括荧光供体和/或荧光接受体的至少一种第二探针相互作用。

通过巧妙地利用根据本发明的中介探针的普遍适用性，可以使用本系统来检测不同的靶分子。使用几种通用中介探针，可以在一个样品中同时检测几种靶分子。

由于荧光供体和受体与通用检测分子，而非靶序列特异性分子结合，因此荧光产量和基本信号不受靶分子结构的影响。与现有技术相比，优化的检测分子可以用于不同的分析而不牺牲荧光产量或基本信号。

荧光接受体或受体染料是能够吸收来自荧光供体的能量的分子。荧光接受体也可以描述为本发明意义上的猝灭剂。除其他以外，吸收效率取决于荧光接受体和荧光供体之间的距离。荧光接受体可以通过吸收具有λ₁的光子被激活来发射λ₂，或者荧光接受体可以是非发射的并且导致荧光猝灭。

荧光供体是能够发荧光的染料分子或荧光团。通过辐射激活的荧光供体可以在没有辐射的情况下经由偶极-偶极相互作用将能量转移到荧光接受体。这淬灭了荧光供体的荧光信号。或者，待检测的荧光供体的荧光信号可以受静态和动态猝灭的影响。

荧光团(或荧光染料，类似于发色团)是一种荧光化合物，可以在光触发时重新发光。在构建本发明的标记的寡核苷酸中用作标记的荧光团优选包括罗丹明和衍生物诸如德克萨斯红，荧光素和衍生物诸如5-溴甲基荧光素、荧光黄、IAEDANS、7-Me2N-香豆素-4-乙酸酯、7-OH-4-CH3-香豆素-3-乙酸酯、7-NH₂-4CH3-香豆素-3-乙酸酯(AMCA)、单溴二胺、芘三磺酸盐诸如Cascade Blue，和5-(溴甲基)-N,N,N,2,6-五甲基-1,7-二氧代-1H,7H-吡唑并[1,2-A]吡唑-3-甲基铵(monobromotrimethylammoniobimane)、FAM、TET、CAL Fluor Gold540、HEX、JOE、VIC、CAL Fluor Orange 560、Cy3、NED、Quasar 570、Oyster 556、TMR、CALFluor Red 590、ROX、LC red 610、CAL Fluor Red 610、德克萨斯红、LC red 610、CALFluor Red 610、LC red 640、CAL Fluor Red 635、Cy5、LC red 670、Quasar 670、Oyster645、LC red 705、Cy5.5、BODIPY FL、俄勒冈绿(Oregon Green)488、罗丹明绿、俄勒冈绿514、Cal Gold、BODIPY R6Gj、Yakima Yellow、JOE、HEX、Cal Orange、BODIPY TMR-X、Quasar-570/Cy3、TAMRA、罗丹明红-X、Redmond Red、BODIPY 581/591、Cy3.5、Cal Red/德克萨斯红、BODIPY TR-X、BODIPY 630/665-X、Pulsar-650、Quasar-670/Cy5。

“猝灭”是指降低特定物质的荧光强度的任何过程。猝灭是福斯特共振能量转移(FRET)分析的基础。FRET是一种动态猝灭机制，因为能量转移发生在供体处于激活状态时。猝灭剂是这样的分子：当被光源激活时由荧光团发射的荧光被该分子经由FRET猝灭。在构建本发明的标记的寡核苷酸或探针中用作标记的猝灭剂优选包括DDQ-1，Dabcyl、Eclipse、TAMRA、Iowa Black FQ、BHQ-1、QSY-7、BHQ-2、DDQ-II、Iowa Black RQ、QSY-21、BHQ-3、QSY-35、BHQ-0、QSY-9、ElleQuencher、Iowa Black。专家可以如文献[Johansson,M.K.Methodsin Molecular Biology 335,17-29(2006)；Marras,S.A.Methods in Molecular Biology335,3-16(2006)]中所述选择合适的报告物分子猝灭剂对。

在根据本发明的系统的优选形式中，检测分子具有发夹结构。这里，发夹结构可以通过检测分子的5'末端与检测分子的内部序列部段互补杂交形成，并且3'末端包括未配对的序列部段。

此外，根据本发明，检测分子可以在5'末端处和/或发夹结构内包括至少一种荧光修饰或氧化还原修饰或发光修饰。

本发明意义上的发夹结构是指具有通过内部碱基配对对准的序列片段的线性核酸分子或寡核苷酸的二级结构。这些结构发生于同一分子的两个区域——通常具有回文核苷酸序列——形成双螺旋时，其在末端以未配对的环终止。

在形成发夹结构后，位于5'末端(第二区域)的荧光供体或荧光接受体和第三区域的荧光供体或荧光接受体可以相互作用，导致荧光信号(FRET)的抑制。作为第二和第三区域中检测分子的荧光供体和荧光接受体修饰的替代，可以使用其他产生信号的修饰，诸如但不限于氧化还原分子、化学发光共振能量转移(CRET)对和***分子。

释放后，中介体扩散地存在于反应溶液中并且可以与定位于发夹形检测分子的3'末端的未配对序列区段的检测分子的第一区域相互作用。检测分子可以固定在固相上或存在于溶液中。与检测分子结合的中介体的延伸可以被合适的辅助分子影响，(例如链置换聚合酶)，其中，与检测分子的内部序列区段互补杂交并且因此形成发夹结构的检测分子的第二区域(5'末端)，分别通过聚合酶或中介体的延伸的3'末端置换。这通过置换5'末端增加了荧光接受体和荧光供体之间的距离，并恢复了先前抑制的荧光供体的荧光信号。或者，位于检测分子5'末端的氧化还原分子相对于检测分子的3'末端变化了或CRET的效率变化了或分子的***变化了，这是由于中介体或其延伸产物与检测分子的双重结构的形成。通过置换杂交的5'末端，消除了二级结构或发夹结构的形成。在这种情况下，中介体可以通过所述辅助分子互补地延伸直至检测分子的5'末端。

根据本发明系统的优选设计，检测分子具有分子信标的结构并且包括至少一个中介体结合区。分子信标是一类特殊的具有自身互补的链末端的双标记检测分子，其在其天然状态下形成发夹结构。分子信标可以在链末端负载标记物诸如荧光供体和荧光接受体，由此标记物可以在优选形式中彼此相互作用。发夹结构使荧光供体和荧光接受体彼此紧密靠近，从而抑制荧光信号。与中介体的杂交在空间上分离了荧光供体和荧光接受体，这可能作为扩增反应的一部分，扩增反应中介体延伸并产生荧光信号。分子信标形式的检测分子优于携带内部标记的检测分子的优点是末端标记(诸如荧光标记)的合成成本较低。

在另一个优选的设计中，本发明涉及一种系统，其包括至少一种根据本发明的中介探针和至少一种检测分子，其特征在于至少一种检测分子包括两个寡核苷酸，其中

-第一寡核苷酸包括与至少一种中介体相互作用的第一区域，和具有荧光接受体或荧光供体和/或用于结合固相的化学基团和/或化学保护基团和/或氧化还原修饰和/或发光修饰的第二区域，以及

-第二寡核苷酸包括第三区域，该第三区域具有荧光供体或荧光接受体和/或用于结合固相的化学基团和/或化学保护基团和/或氧化还原修饰和/或发光修饰，

-其中，第一和第二寡核苷酸具有彼此杂交的区域。

根据该设计，检测分子可以由两个杂交的标记寡核苷酸组成，其中两个寡核苷酸的两个标记可以各自是附连于寡核苷酸末端的至少一个荧光接受体或荧光供体，其中二聚体中的荧光信号通过两个标签的空间接近而衰减或抑制。一个或两个寡核苷酸也具有中介体结合区。通过将中介体附连至中介体结合区和随后的延伸，标记的核苷酸被分离并且标记的5'和3'末端在空间上彼此分离，使得可检测的信号增加。该结构的优点在于这种末端和单荧光标记的寡核苷酸的合成成本非常低。检测分子的这种设计的优选变体在图19中示出。

根据本发明系统的优选设计，检测分子包括位于检测分子3'末端的第六区域，其具有用于结合固相的化学基团和/或化学保护基团。

本发明意义上的保护基团是指引入分子中以暂时保护特定官能团并且因此防止不希望的反应的取代基。在分子上的其他地方进行所需的反应后，可以再分离该保护基团。

在优选的设计中，检测分子自由存在于溶液中。在另一个优选的设计中，检测分子结合到固相。在适合于各个检测方法的反应容器中将检测分子固定在固相上。可以将所需的样品和试剂加入反应容器中并且然后可以将混合物在合适的条件下温育。样品可以由DNA、RNA和/或肽或蛋白质组成。如果存在靶分子，中介体被中介探针置换或释放并且可以在反应混合物中扩散到固定的检测分子。

在本发明的优选形式中，在中介体释放并与检测分子结合后，通过固相上的电化学检测检测到信号变化。检测分子固定在同时代表固相的电极上。释放的中介体可以与检测分子的中介体结合区杂交，并且例如通过聚合酶延伸。成功延伸后，氧化还原分子可嵌入检测分子的二聚体和延伸的中介体中，并且产生可检测的电化学信号。

另外，还可能的是足够长的中介体与检测分子杂交且不延伸。氧化还原分子可以嵌入检测分子和中介体的二聚体中并产生电化学信号。该设计的变体在图20中示出。

在另外的形式中，中介体和/或检测分子标记有一个或多个氧化还原分子。如果中介体标记有氧化还原分子，则释放的中介体与固定的检测分子的结合导致信号变化，这是由于氧化还原修饰和电极表面的空间接近。本发明的这种形式的变体在图21中示出。

每个靶标和/或模板分子释放多个中介体以获得更强的信号可能是有利的。每种靶分子释放几个中介体可以通过例如将中介体附连到几个不同的引物上来实现。

在另外的形式中，例如，标记有氧化还原修饰的中介体可以在与检测分子杂交后通过聚合酶延伸，由此可以实现双链的有利稳定化(图22)。

在其他形式中，标记有氧化还原修饰的中介体可以结合从电极表面移除的检测分子的链末端。中介体可以在更长的检测分子处延伸，或者中介体已经具有与检测分子相似的长度并且不延伸。氧化还原分子和电极之间的电荷转移经由DNA的电导率发生，其中通过形成双链增加电导率。这种设计的变体在图23中示出。

在另外的形式中，检测分子可以负载氧化还原分子并且中介体可以是无标记的。释放的中介体现在可以与检测分子结合并延伸，如图24中所示。或者，已经足够长的中介体可以与检测分子结合。双链的形成增加了DNA的电导率，这是由于可能的分子内和分子间电荷转移机制。因此，可以检测到电极处的信号变化。

电化学检测可以通过测量各种参数诸如阻抗变化、循环伏安法、方波伏安法或电容变化来进行。

在本发明的优选形式中，中介体释放和结合检测分子之后信号变化的检测经由全内反射荧光显微术(TIRF)进行。在该设计中，检测分子固定在TIRF照明装置上方的固相上。由全反射形成的消逝场穿透到样品体积中并触发其定位于检测分子和/或中介体和/或探针处或嵌入二聚体中的荧光分子，由此可以检测荧光信号的变化。

在其他优选的设计中，释放的中介体与检测分子的结合可以通过表面等离子共振光谱法检测。通过中介体的释放和随后将中介体结合到固定在表面上的检测分子，可以检测到样品中折射率的变化。检测分子可以直接固定在等离子体是激活的金属表面上，或者例如，直接固定在直接定位于金属表面上的膜内/上。

检测分子与固相的结合或固定也有利于通过重量测量证明中介体的释放和与检测分子的结合。例如，将检测分子固定在载体表面上，其重量可以用振荡石英测定。因此可以检测由于中介体与检测分子的结合导致的重量变化。

或者，检测分子可以固定在磁性颗粒上。这使得能够通过磁弛豫测量法检测目标分子。在磁弛豫测量中，磁性粒子通过短磁脉冲磁化并且检测到感应磁矩的时间劣化。中介体经由固定在颗粒上的检测分子与之结合并延伸的颗粒的流体动力学阻力更大，即相对于没有中介体与之结合的颗粒的流体动力学阻力。因此中介体与之结合的并且任选地延伸的颗粒与无中介体与之结合的颗粒相比，它们的感应磁矩更慢地降低。因此，所述颗粒的感应磁矩的弛豫时间彼此不同，从而可以检测中介体的释放。通过将磁弛豫法与熔解曲线分析相结合，可以在一个样品中同时检测不同的靶分子。

根据本发明，中介体和/或检测分子可以标记有至少一个荧光分子、氧化还原分子、发光分子或其他产生信号的分子。

根据本发明，检测分子可以是单链核酸分子或核酸衍生物。几个标记的探针可以与这种检测分子杂交。释放中介体后，它与检测分子结合并延伸。这释放了与检测分子杂交的标记的探针，导致从探针标记发出的可检测的信号变化。例如，由于荧光供体和荧光接受体的空间分离，标记有荧光供体和荧光接受体的探针的释放导致荧光增加。单链检测分子可以是线性的或环状的，它可以在溶液中是均质的或固定在固相上并且可以具有几个中介体结合位点。本发明的这种形式优选用于等温扩增方法以确保标记的探针在不存在靶分子的情况下与检测分子结合，并且不会与检测分子发生由于产生的高热能(例如通过PCR)导致的解离。这里所示的本发明的形式的实例在实施例9中示出。

如果检测分子是环状的并且***了几个中介体结合位点，则快速检测反应可以在良好的动态范围内通过同时结合位于不同位点几个中介体发生。检测分子的环状结构允许实现灵敏度的额外增加，因为检测分子上的中介体的杂交和延伸释放了所有结合的标记的探针，而不管中介体与之结合的位点。具有在不同波长处发射的不同荧光供体和荧光接受体的探针可以与检测分子结合。通过组合不同的荧光染料，不同的荧光染料也可以以不同的浓度使用(其由每种检测分子的标记的探针的数量决定)，从而可以增加多重的程度。可以将某些的浓度比例指定给确定的检测分子。

在优选的设计中，根据本发明的系统还包括至少一个结合分子，至少一个第一和/或至少一个第二探针在从检测分子释放后可以与至少一个结合分子结合。结合分子可用于防止释放的探针(例如，标记有荧光供体或荧光接受体的那些)再次与检测分子结合。本发明的相应实例在图7中示出。

在某些形式中，检测分子由几个寡核苷酸组成，其中未标记的寡核苷酸与较短的荧光标记的寡核苷酸杂交。未标记的寡核苷酸可以与几个荧光标记的寡核苷酸杂交。荧光接受体和/或荧光供体附连至较短的寡核苷酸。它们以荧光团和猝灭剂在空间上彼此靠近的方式布置。释放的未标记中介体与未标记的检测分子具有比荧光标记的检测分子更高的结合能，并且因此置换例如标记有猝灭剂的较短寡核苷酸。可以调节结合能使得中介体在反应条件下优先结合引物而不结合检测分子。本发明的相应实例在图25中示出。

此外，本发明涉及用于检测至少一种靶分子的方法，包括以下步骤：

a)提供至少一种根据权利要求1至3中任一项的中介探针和/或根据权利要求4或5的系统，

b)使至少一种中介探针的第一寡核苷酸的探针区与模板分子和/或靶分子的序列的结合，

c)扩增至少一种中介探针的第一寡核苷酸和/或模板分子和/或靶分子，

d)通过至少一种辅助分子释放至少一种中介体，

e)任选地，使至少一种释放的中介体与至少一种检测分子结合，以及

f)检测信号变化。

根据本发明的方法的扩增步骤可以包括等温和/或非等温扩增方法。

在等温或等温扩增中，各个反应通过链转移聚合酶在恒定温度(等温)下进行。由于等温扩增是在恒定温度下进行的，因此其也可以在没有任何主要技术设备的情况下进行。链置换聚合酶，例如，来自噬菌体Φ29的Φ29DNA聚合酶置换现有双链DNA的第二条链，而它使用第一条链来产生具有相同序列的新链以形成第二条链。

DNA等温扩增的方法包括但不限于多重置换扩增、等温组装、重组酶聚合酶扩增(RPA)、环介导的等温扩增(LAMP)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、切口酶扩增反应(NEAR)、滚环扩增(RCA)和链置换扩增(SDA)。

在非等温扩增方法中，使用了热稳定聚合酶，因为温度在反应期间变化。热循环仪可以用于此目的。非等温扩增方法的实例是聚合酶链反应(PCR)、实时PCR和聚合酶链置换反应(PCDR)。

根据本发明的方法的一个重要优点是中介体释放和随后的信号产生，例如通过中介体与检测分子的相互作用，可以应用于不同的扩增方法并且不限于特定的扩增系统。通过巧妙地利用不同扩增方法中的各个条件，上述中介体释放可以容易地适应各个系统。

在本发明的优选形式中，中介体不是通过使用酶的核酸酶活性从中介探针中分离而释放的，而是通过置换释放的。在这种情况下，优选不切割共价键，因为中介体与中介探针的第一寡核苷酸不是共价结合的。优选地，释放中介体而不切割寡核苷酸。优选地，在本发明方法中不需要使用具有核酸酶活性的酶。

在根据本发明的程序的优选形式中，中介体结合检测分子的第一区域，其中该结合可以是间接的或直接的相互作用。通过中介体与检测分子的第一区域的这种相互作用，可以发生检测分子的物理或化学上可测量的变化。

在根据本发明的程序的优选形式中，至少一种中介体结合检测分子的第一区域并通过至少一种辅助分子酶促延伸，该辅助分子优选与结合中介体的3'末端结合，由此发生检测分子中的物理或化学上可测量的变化。检测分子的这些变化包括但不限于切割、消化、链复制、内部杂交、磷酸化、去磷酸化、酰胺化、化学基团的结合或切割、荧光、磷光或发光变化。

根据本发明程序的另一个优选形式，至少一种中介体与检测分子的第一区域结合，这导致检测分子的物理或化学上可测量的变化。为了产生可测量的变化，不需要中介体的酶促延伸。

在中介探针的第一寡核苷酸的探针区与模板分子和/或靶分子的序列结合后，中介探针的第一寡核苷酸的3'末端优先通过辅助分子酶促延伸。

根据本发明的方法的优选设计的特征在于中介探针的第一寡核苷酸和/或模板分子和/或靶分子的扩增是通过等温或非等温扩增方法进行的。

根据本发明，优选PCR、PCDR或实时PCR作为非等温扩增方法。LAMP或RPA是优选的等温扩增方法。

在非等温扩增反应中，诸如PCR或PCDR，所用的一个或多个引物可以修饰，以使其是中介探针。将样品和试剂置于合适的在其中可以进行扩增的反应容器中并温育混合物。在此过程期间，在反应容器中检测到例如荧光信号的信号变化。

在根据本发明的方法的另外的种形式中，检测分子具有至少一个荧光或发光修饰，并且在通过辅助分子与至少一种中介体反应后，荧光或发光修饰从检测分子除去和/或除去检测分子的发夹结构的5'末端和/或展开发夹结构，并且在检测分子上检测到荧光或发光信号的变化。

在根据本发明的程序的优选形式中，采用每种中介探针几种中介体和/或每种靶分子几种中介探针和/或几种检测分子。

这使得复合多重分析能够在实验方法中同时检测多种分析物。多重分析使得能够检测反应混合物中的几种不同的靶分子和/或模板分子。为了增加根据本发明的方法的多重的程度，可以使用n种不同的中介探针来检测n种不同的靶分子。待检测的每种靶分子可以指定给至少一种中介探针，该至少一种中介探针的探针区与靶分子或模板分子特异性相互作用。中介体结合区和相应中介探针的中介体不与相应的靶分子或模板分子亲和或互补。然而，相应的中介体代表确定的检测分子的特异性相互作用配偶体。因此，每种靶分子间接指定给至少一种检测分子，这由中介探针指定。不同靶分子的检测需要不同的检测分子。

由于中介探针的探针区和中介体结合区可以彼此独立地自由组合，因此在任何探针区的情况下，通过将匹配的中介体结合区和中介体连接和合成，检测分子还可以与其他靶分子相关联。因此，根据本发明的方法允许靶分子不依赖于检测分子而设计。因此，通过标准化的检测分子组，可以在一个样品中检测不同的靶分子，从而通过调整中介探针并使用合适的辅助分子(例如引物或适体)可以有成本效益地使反应适应相应的靶分子。

根据本发明，作为单个中介探针的一部分并与中介探针的相同第一寡核苷酸的中介体结合区结合的几个不同的中介体可以与几个不同的检测分子结合。通过巧妙地组合中介探针的几个中介体与不同的检测分子，根据本发明的程序的多重的程度可以大大增加。先决条件是几个不同的检测分子产生不同的信号，该不同的信号是可区分的并且优选地可以平行或同时检测。

例如，通过每中介探针和靶分子使用n种检测分子和两中介体，可以检测种不同的靶分子。对于给定数量的不同检测分子，二项式系数可以用于计算可检测的靶分子的数量。由于目标分子不仅可以通过生成两个不同的信号来识别，例如具有两个不同波长的两个荧光信号，而且可以通过生成单个信号来识别，二项式系数的值必须增加n才能计算出可检测的靶分子的数量的最大值。通过四个不同的检测分子，可以检测到10种不同的靶分子，而仅5个检测分子就可以区分15种靶分子。相应的实例在图5A中示出。

或者，每种靶分子可以使用几种中介探针，其中一种中介探针可以仅包括一种中介体。

结合相同靶分子或模板分子的一种或多种中介探针可用于本发明程序的优选形式中，其中这些中介探针一种中介体或多种中介体可以同时结合一种或多种检测分子。通过巧妙地组合检测分子中的中介体结合区，例如，可以仅使用两种检测分子来区分三种靶分子。通过使用n种检测分子和每种检测分子至少两种中介体，可以检测“2ⁿ-1”个不同的靶分子。根据本发明的这种形式，检测分子各自包括至少两个不同的中介体结合区，其中与至少两个不同靶序列连接的至少两种中介体各自仅结合一种特异性检测分子。每种靶分子产生特定信号。根据本发明，与第三个或更多个靶序列连接的第三种或更多种中介体可以结合至少两种检测分子，并且因此触发至少两个不同的信号。对于两个释放的中介体同时结合相同的检测分子的足够高的概率，释放的中介体的浓度应该是检测分子浓度的量级。相应的实例在图5B中示出。此外，还可以使用可以结合多于两个不同中介体的检测分子，并且几个不同的中介探针可以结合相同的靶分子。

通过每种靶分子或模板分子使用几种中介探针，在检测靶分子时可以释放几个不同的中介体。例如，可以使用几种中介探针，其各自选择性地结合共同的靶分子或模板分子，其中中介体或这些中介探针的中介体具有不同的序列。不同序列的几个不同中介体可以与一个且相同的检测分子结合，其中检测反应仅通过结合几种中介体来触发。可以通过灵活地利用释放的中介体之间的相互作用来控制信号产生反应，并且从而增加检测方法的特异性。特异性是指正确分类为阴性的事件的比例或者目标分子的缺失也被分类为阴性的概率。例如，由不同中介探针释放的两种中介体可以以这样的方式在检测分子上相互作用，使得只有当两种中介体都与检测分子结合时才发生检测分子的信号变化。相应的实例在图5C中示出。

根据本发明的方法的优选设计的特征在于，靶分子和/或模板分子是选自由组成的组的生物分子：DNA、RNA、肽、蛋白质、适体，和/或其组合。

与现有技术相比，根据本发明的方法的主要优点在于，可以以单个步骤并且在单一反应方法中平行检测不同分子和分子类别，诸如蛋白质和核酸，从而能够创建样品的组合的DNA-RNA-蛋白质谱。

根据本发明的检测方法可以用于例如检测作为靶分子的特定RNA分子，其中通过逆转录(RT)或通过另一种合适的酶系统将RNA转录成cDNA，并且然后扩增了cDNA，其中，cDNA用作模板分子。

根据本发明，靶分子特异性适体可以用作模板分子用于检测靶分子。待检测的靶分子可以是蛋白质或肽，例如，但不限于此。适体结合靶分子并改变其结构，使得在相互作用后适体特异性中介探针和引物可以附连至适体。通过用合适的酶系统处理可以使附连至适体的引物延长，导致位于适体的蛋白质结合区域之外的适体序列的扩增。根据本发明的中介探针可以与适体或扩增的适体序列相互作用。例如，通过将中介探针与线性扩增产物结合，可以打开探针并使用其他引物从中介探针中置换中介体。可以使用特异性的检测分子或合适的检测方法来检测释放的中介体。根据本发明，靶分子特异性的适体可以用作检测靶分子的模板分子，该适体包括侧翼为引物结合区的靶分子结合区。另外，使用了根据本发明的至少一种中介探针，其探针区特异性结合适体的引物结合区之一。在不存在靶分子的情况下，使用中介探针和其他引物可以扩增适体的靶分子结合区，从中介探针释放中介体并检测信号变化。在存在靶分子的情况下，适体结合靶分子，并且由于适体和靶分子之间的结合，中介探针的引物或第一寡核苷酸不能被延长，并且中介体不被释放。如果存在靶分子则与不存在靶分子相比，检测到信号下降。根据本发明的该方法能够进行指数检测反应。

根据本发明方法的另一种形式，辅助分子选自由以下组成的组：聚合酶、RNA聚合酶、DNA聚合酶、连接酶、核酶、催化剂、蛋白质、核酸、天然产物、酶、酶系统、细胞裂解物、细胞组分、衍生自细胞组分的衍生物和/或合成分子。辅助分子优选是来自核酸扩增系统和/或限制酶系统的分子。

连接酶是连接DNA链的酶。它们在磷酸酯残基和糖脱氧核糖之间形成酯键。还已知连接酶还具有在核酸的3'末端处延伸核酸分子的能力。

核酶是具有催化活性的RNA分子，其像酶一样可以催化化学反应。已知某些核酶类似于聚合酶可以延长和扩增核酸分子。核酶还可以催化其他反应，诸如肽键的结合和RNA分子的剪接。

根据本发明方法的优选形式，至少一种辅助分子具有DNA链分离效果和/或聚合效果，辅助分子优选为链置换聚合酶。

令人惊讶的是，当使用具有链置换活性的聚合酶时，不需要额外的酶，诸如具有核酸酶活性的酶，这是相对于现有技术的主要优点。

在根据本发明的方法中，不同的辅助分子可以用于不同的过程步骤。可以借助辅助分子进行的过程步骤包括但不限于扩增根据本发明的中介探针的第一寡核苷酸，扩增靶分子和/或模板分子，切割、释放或置换来自中介探针的中介体，在结合检测分子后中介体的酶促延伸以及检测分子的改变。

在根据本发明方法的优选形式中，荧光、磷光、发光、质量、吸收、光散射、电导率、酶活性和/或亲和力、电化学电势或信号、折射率、表面等离子体的触发或磁弛豫的可测量的变化是通过固定化的或非固定化的检测分子与至少一种中介体之间的直接或间接相互作用而发生的。

在根据本发明的方法的优选设计中，荧光、磷光、发光、质量、吸收、光的散射、电导率、酶活性和/或亲和力、电化学电势或信号、折射率、表面等离子体的触发、磁弛豫、磁性、阻抗或电容的可测量的变化是通过固定化的或非固定化的检测分子与至少一种中介体之间的直接或间接相互作用而发生的。

根据本发明的优选设计的特征在于至少一种中介体的释放是通过借助于等温或非等温扩增方法扩增至少一种中介体来检测的。释放的中介体可以例如在相应的扩增酶的存在下触发滚环扩增。因此，可以通过检测滚环扩增的扩增产物来识别靶分子。例如，滚环扩增的扩增产物可以经由探针或经由pH值变化、凝胶电泳或比色法来序列特异性地检测。

依照根据本发明程序的优选形式，通过测序检测至少一种释放的中介体。通过对游离中介体进行测序，可以同时识别样品中的任何数量的靶分子。

测序是对核酸分子尤其是DNA中的核苷酸序列的测定。本发明含义内的测序方法包括但不限于Maxam和Gilbert方法、Sanger双脱氧法、焦磷酸测序、杂交测序、离子半导体DNA测序系统、桥式合成测序、双碱基测序、配对末端测序和纳米孔测序。

例如，可以通过下一代测序(NGS)来证明检测。NGS方法的一个实例是纳米孔测序，在其中随着分子(诸如核酸)流过膜可以测量孔膜上的电位变化，并且因此可以测定核酸的序列。测序可以用于检测任何数量的中介体的同时释放，每种中介体都表示存在特定的靶分子。与常规方法(诸如荧光测量)相比，多重的程度显著增加。测序方法不限于纳米孔测序。

在根据本发明的方法的优选形式中，至少一种释放的中介体通过杂交与检测分子结合，任选在通过辅助分子与检测分子结合后延伸，并且然后进行熔解曲线分析。这允许通过使用不同的检测分子来实现多重的程度的额外增加，检测分子例如标记有不同的信号分子。根据本发明的优选形式，序列特异性或序列非特异性探针与中介体和/或检测分子相互作用，序列特异性或序列非特异性探针是荧光原和/或色原体标记的或荧光染料。

在根据本发明的方法的优选形式中，至少一种靶分子是RNA，并且RNA被转录成cDNA，并且cDNA用作模板分子。具有序列突出端的引物可以用于RNA的逆写反应/逆转录成cDNA，并且中介探针的探针区可以结合包括至少cDNA的部段和序列突出端的部段两者的区域。

根据本发明方法的另一个优选形式，至少一种靶分子是肽或蛋白质，并且模板分子是适体，其中，适体与肽或蛋白质结合并通过将适体与靶分子结合使得位于适体处的中介探针的探针区的结合位点变得易于到达。

根据本发明，序列特异性或序列非特异性探针、荧光染料或氧化还原分子可以与至少一种中介体和/或检测分子相互作用。

此外，本发明涉及根据本发明和/或方法的系统用于检测混合物中的一种或多种相似的或不同的生物分子的用途。在这种情况下，根据本发明的检测分子可以在3'末端区域具有化学保护基团，该保护基团在与中介体反应并且3'末端OH基团生成之后通过辅助分子从检测分子分离。

此外，本发明涉及试剂盒，其包括至少一种检测分子，和任选地至少一种本发明意义上的中介体、聚合酶和dNTP。

附图说明

在下文中，将借助于附图和实施的实例来解释本发明，但不限于此，如下所示：

图1：本发明实施方式中介探针结构的示意图。

图2：在存在链置换聚合酶的情况下扩增期间中介体置换的示意性序列。

图3：可能的检测分子的示意图。

图4：酶促中介体延伸的示意图。

图5：当每种靶分子使用几种中介体和/或几种中介探针和/或几种检测分子时的排列可能性。

图6：具有分子信标结构的检测分子的结构。

图7：具有荧光供体和荧光接受体标记的杂交探针的线性或环状检测分子。

图8：固相上的电化学检测。

图9：在存在链置换聚合酶的情况下扩增期间中介体置换的示意性序列。

图10：LAMP期间中介体释放和随后的信号产生的机制。

图11：使用根据本发明的中介探针和检测分子的用于检测大肠杆菌(E.coli)(W3110，完整基因组)的LAMP的归一化荧光图。

图12：使用本发明中介探针和检测分子的用于检测HIV-1RNA的RT-LAMP的归一化荧光图。

图13：不作为引物起作用的中介探针的结构。

图14：通过靶分子特异性的适体来检测靶分子的检测方法。

图15：通过另外包括适体区和引物结合区的中介探针来检测靶分子的发明的检测方法。

图16：通过用作引物并且能够进行指数检测反应的中介探针来检测靶分子的发明的检测方法。

图17：检测分子在固相上的固定化。

图18：标记的检测分子在电极上的固定化。

图19：由两个标记的杂交寡核苷酸组成的检测分子。

图20-图24：固相上的电化学检测。

图25：由几个寡核苷酸组成的检测分子。

图26：检测杜克雷嗜血杆菌(H.ducreyi)的LAMP的归一化荧光图。

图27：检测苍白密螺旋体(T.pallidum)的LAMP的归一化荧光图。

图28：检测HTLV-1的RT-LAMP的归一化荧光图。

图29：检测TMV的RT-LAMP的归一化荧光图。

图30：检测100pg G3PDH片段的PCDR的归一化荧光图。

图31：中介体与磁性或可磁化纳米颗粒的结合。

图32：电活性标记的中介体的电化学检测的证据。

图1示出了本发明优选形式的中介探针的可能结构的示意图。

图2示出了存在来自中介探针的链置换聚合酶的情况下扩增期间中介体置换的示意性序列，该自中介探针用作DNA扩增中的引物。

图3(A)示出了可能的检测分子的线性表示。(B)表示在二级结构的形成下3'-固定化的检测分子。相互作用产生检测分子的二级结构的反向互补序列片段显示为黑色区域，中介体结合序列显示为对角条纹区域。

图4示出了酶促中介体延伸的示意图。i)检测分子游离在溶液中或固定在固相上，并在反应条件下呈现确定的二级结构。两个合适的荧光修饰F和Q彼此相互作用，由此抑制F的荧光信号。ii)中介体可以与检测分子在确定的位置(中介体结合区，区域5)相互作用，iii)-iv)，并且从而通过链置换聚合酶被酶促延伸。检测分子的区域1与荧光接受体分子Q一起置换，从而恢复荧光供体F的荧光强度。vi)在区域1的置换后，中介体可以进一步延伸。

图5(A-C)示出了当每种靶分子使用几种中介体和/或几种中介探针和/或几种检测分子时的几种可能的排列。(A)使用每种中介探针的多种中介体或每种靶分子的多种中介探针来增加可检测的靶分子的数量。当每种靶分子使用几种中介体时，作为检测分子数的函数的可检测靶分子的最大数量可以由二项式系数和检测分子的数量来计算。(B)使用具有多个中介体结合区的检测分子来增加可检测的靶分子的数量。(C)每种靶分子使用多种中介体并利用中介体之间的相互作用来增加检测反应的特异性。两种中介体均释放允许它们以彼此的方式相互作用并同时与检测分子相互作用，延长中介体中的一个并引发检测反应。单个中介体的相互作用不会导致检测反应。

图6示出了对应于分子信标结构的检测分子的结构。荧光接受体和荧光供体附连在5'和3'末端，并且中介体结合区定位于环中。

图7示出了荧光供体和荧光接受体标记的探针杂交的线性或环状检测分子。通过使中介体与检测分子杂交并延伸，释放标记的探针并检测信号变化。为了防止标记有荧光供体或荧光接受体的释放探针与检测分子重新结合，可以使用结合分子使得标记的探针在释放后可以与其结合。

图8示出了本发明的一种形式，其中，电化学检测用于固相。检测分子固定在电极上。中介体在检测分子处杂交和延伸后，溶液中存在的氧化还原分子可以嵌入检测分子和延伸中介体的二聚体中，由此可以检测电化学信号的变化。

图9示出了存在来自中介探针的链置换聚合酶的情况下扩增期间中介体置换的示意性序列，该中介探针用作DNA扩增中的引物。中介体和检测分子各自标记有荧光染料，如果中介体通过FRET能量转移与检测分子杂交，则能够被检测到一波长处的荧光强度增加。当使用具有不同数量核苷酸的检测分子时，可以使用熔解曲线分析来区分不同的靶分子。

图10示出了在LAMP期间中介体释放和随后的信号产生的机制。检测分子和中介探针中的中介体结合区缩写为Medc(对应于与中介体互补的序列)。在本发明的该形式中，中介探针同时用作环状引物；因此，中介探针由通过Medc(环状_Medc)延伸的环引物和与其杂交的中介体(Med)组成。在最初始的LAMP步骤后，形成了哑铃状扩增产物，中介探针可以与之结合。通过延伸中介探针并将引物重新连接到其上，中介体通过链置换聚合酶被置换。然后释放的中介体可以通过与检测分子相互作用产生可检测的信号。

图11示出了使用根据本发明的中介探针和检测分子的用于检测大肠杆菌DNA(W3110，完整基因组)的LAMP的归一化荧光图。该图示出了DNA量与荧光过程之间的相关性。将在0min时的荧光强度归一化为初始值。DNA拷贝数表示为每个反应的拷贝数(例如10cp对应于每个总体积为10μl的反应的10个拷贝)。阴性对照每个反应包括0个拷贝(NTC，无模板对照)。

图12示出了使用根据本发明的中介探针和检测分子的用于检测HIV-1RNA的RT-LAMP的归一化荧光图。将在0min时的荧光强度归一化为初始值。RNA拷贝数表示为每个反应的拷贝数(3400cp对应于每个总体积为10μl的反应3400个拷贝)。阴性对照每个反应包括0个拷贝(NTC，无模板对照)。

图13示出了不用作扩增起始点的中介探针的设计。

图14示出了根据本发明的检测方法，通过靶分子特异性适体来检测靶分子。

图15示出了根据本发明的检测方法，通过额外含有适体区和引物结合区的中介探针来检测靶分子。在靶分子不存在的情况下扩增中介探针，而在靶分子存在的情况下引物的延伸被结合的靶分子阻断。因此，在靶分子存在的情况下不会触发可检测的信号，并且在靶分子不存在的情况下产生了可检测信号。

图16示出了根据本发明的检测方法，通过用作引物并且能够进行指数检测反应的中介探针来检测靶分子。在靶分子不存在的情况下线性适体被扩增并且中介体在扩增期间释放，而在靶分子存在的情况下引物的延伸被结合的靶分子阻断。因此，在靶分子存在的情况下不会触发可检测信号，并且在靶分子不存在的情况下产生了可检测的信号。

图17示出了根据本发明的检测方法的设计，其中，在合适反应容器中检测分子固定在固相上。

图18示出了根据本发明方法的检测形式，其中，检测分子固定在电极上。通过中介体在检测分子处的杂交和延伸，与检测分子结合的氧化还原分子在空间上与电极表面分离，从而产生信号的变化。方案a和b示出了在检测分子的两个不同区域中中介体的可能结合位点。

图19示出了由两个标记的杂交寡核苷酸组成的检测分子。荧光接受体和荧光供体分别附连在5'和3'末端；另外，两个寡核苷酸中的一个具有中介体结合区。

图20示出了在固相上进行电化学检测的可能性。检测分子固定在电极上。中介体在检测分子处杂交之后，溶液中存在的氧化还原分子可以嵌入检测分子和中介体的二聚体中，由此可以检测电化学信号的变化。

图21示出了使用标记的中介体在固相上进行的电化学检测。检测分子固定在电极上。通过使标记的中介体与检测分子杂交，可以检测电化学信号的变化。

图22示出了固相上的电化学检测。检测分子固定在电极上。通过检测分子上的标记的中介体的杂交和延伸，可以检测电化学信号的变化。

图23示出了在固相上进行电化学检测的可能性。检测分子固定在电极上。通过检测分子上的标记的中介体的杂交和延伸，可以检测电化学信号的变化。氧化还原分子和电极之间的电荷传输是由双链的形成引起的。

图24示出了固相上的电化学检测。检测分子固定在电极上。通过标记的检测分子上的中介体的杂交和延伸，可以检测电化学信号的变化。氧化还原分子和电极之间的电荷传输是由双链的形成引起的。

图25：检测分子由几个寡核苷酸组成，其中，未标记的寡核苷酸与较短的荧光标记的寡核苷酸杂交。荧光接受体和/或荧光供体附连至较短的寡核苷酸。它们以荧光团和猝灭剂在空间上彼此靠近的方式排列。释放的中介体与未标记的检测分子具有更高的结合能，并且因此置换例如标记有猝灭剂的较短的寡核苷酸。

图26示出了使用根据本发明的中介探针和检测分子的用于检测杜克雷嗜血杆菌的LAMP的归一化荧光图。将在0min时的荧光强度归一化为初始值。阴性对照(NTC，无模板对照)不含杜克雷嗜血杆菌DNA，阳性对照与纯化的杜克雷嗜血杆菌DNA混合。

图27示出了使用根据本发明的中介探针和检测分子的用于检测苍白密螺旋体的LAMP的归一化荧光图。将在0min时的荧光强度归一化为初始值。阴性对照(NTC，无模板对照)不含苍白密螺旋体DNA，阳性对照与纯化的苍白密螺旋体DNA混合。

图28示出了使用根据本发明的中介探针和检测分子的用于检测HTLV-1的RT-LAMP的归一化荧光图。将在0min时的荧光强度归一化为初始值。阴性对照(NTC，无模板对照)不含HTLV-1RNA，阳性对照与纯化的HTLV-1RNA混合。

图29示出了使用根据本发明的中介探针和检测分子的用于检测TMV的RT-LAMP的归一化荧光图。将在0min时的荧光强度归一化为初始值。阴性对照(NTC，无模板对照)不含TMV RNA，阳性对照与纯化的TMV RNA混合。

图30示出了使用根据本发明的中介探针和检测分子的用于检测100pg小鼠G3PDHDNA的PCDR的归一化荧光图。将在0个循环的荧光强度归一化为初始值。

图31示出了与磁性或可磁化纳米颗粒结合的中介体。在靶分子存在的情况下释放后，中介体可以与检测分子结合，检测固相表面上磁性的变化。

图32示出了电活性标记的中介体的电化学检测的功能性证明。在阳性对照(大肠杆菌DNA的60,000拷贝)中，中介体在LAMP反应期间被置换，并且然后可以与检测分子杂交。因此，标记的(此处为亚甲基蓝)中介体积聚在电极表面上，这导致在电化学分析(这里是方波伏安法)中在-0.39V处特征峰的形成。相反，在NTC处没有峰值，这表明没有发生显著的中介体释放。

设计实施例：

在以下解释中，几种中介体可以与根据本发明的中介探针的第一寡核苷酸或特定引物结合和/或几个不同的引物和/或中介探针可以设置有中介体以增加样品中的中介体浓度。

实施例1：中介探针

发明设计实施例包括用于检测至少一种靶分子的中介探针，其中，中介探针包括至少两个寡核苷酸。第一寡核苷酸具有中介体结合区和探针区。中介体结合区定位于寡核苷酸的5'末端，并且探针区位于寡核苷酸的3'末端。第二个或几个其他寡核苷酸、一个中介体(mediator)或多个中介体(mediators)，在化学、生物学和/或物理上与第一寡核苷酸的中介体结合区结合。中介体可以由DNA、RNA、PNA或修饰的RNA诸如LNA组成。第一寡核苷酸的探针区对靶分子和/或模板分子具有亲和力，并且中介体结合区对一个中介体(mediator)或多个中介体(mediators)具有亲和力(图1)。一个中介体(mediator)或多个中介体(mediators)对至少一种检测分子具有亲和力。

实施例2：中介体置换的程序

在探针区与靶分子和/或模板分子结合后，例如使用链置换聚合酶，中介体被中介体结合区置换。该过程可以在靶分子和/或模板分子的扩增期间发生。在本发明的实施例中，中介探针的探针区可以用作DNA扩增中的引物。在探针区与靶分子和/或模板分子结合后，延伸中介探针。然后可以将第二引物附连至延伸的中介探针上并延伸。在扩增过程綦江，一个中介体(mediator)或多个中介体(mediators)从中介体结合区释放，并通过与一个或多个检测分子的相互作用触发可检测信号(图2)。

实施例3：具有6个区域的检测分子

在检测反应的帮助下检测释放的、未标记的中介体。下文描述的反应机理可与上述靶分子和/或模板分子的扩增平行进行。

在本发明的优选形式中，检测分子可以由分成六个区域的寡核苷酸组成(图3)。区域1包括由序列部段和荧光接受体Q组成的检测分子的5'末端。区域3是区域1的反向互补序列并且由区域2分开。区域4将区域3和区域5分开，区域4可以与中介体分子特异性相互作用。区域6包括3'末端的序列区域，其可以具有化学修饰并因此允许寡核苷酸的定向固定。荧光供体F以合适的方式与区域2至区域6的区域相关联，例如区域4。检测分子的区域1和区域3在反应条件下形成确定的二级结构(发夹结构)，其中，5'末端与内部序列区段杂交(图3B)。形成该结构后，荧光供体F和荧光接受体Q相互作用并且抑制F的荧光信号(FRET)。作为区域1和区域4中的检测分子的荧光供体和荧光接受体修饰的替代，可以使用其他产生信号的修饰，诸如氧化还原分子、化学发光共振能量转移(CRET)对和嵌入分子。

实施例4：中介体延伸导致检测分子的信号变化

释放后，中介体扩散地存在于反应溶液中并且可以与检测分子的中介体结合序列(区域5)相互作用(图4i)+ii))。检测分子可以固定在固相上或存在于溶液中。通过合适的辅助分子，例如，链置换聚合酶延长中介体，其中，检测分子的区域1被聚合酶置换。荧光接受体Q和荧光供体F之间的距离通过5'末端的置换而增加，并且恢复先前抑制的荧光供体F的荧光信号(图4iii)+iv))。替代地，相对于检测分子的3'末端检测分子，5'末端的氧化还原分子的距离变化或CRET的效率变化或分子的***变化，这是由于中介体或其延伸产物与检测分子的双链体的形成。如果所描述的置换阻止了区域1和区域3的相互作用，则取消二级结构的形成。在这种情况下，中介体可以在某些条件下通过所述辅助分子互补地延伸直至新形成的检测分子的5'末端(图4v)+vi))。这种完全延伸为延伸的中介体提供了与检测分子的区域1、2和区域3互补的序列片段。

检测反应必须以这样的方式设计，即与中介体形成对比，初始的中介探针不会触发产生信号的反应，并且因此不会产生假阳性结果。最初，中介体与中介探针的第一寡核苷酸结合，例如通过氢键。为了防止通过将中介体与检测分子结合的产生信号的反应，可以相应地调节中介体与中介探针的第一寡核苷酸结合和中介体与检测分子结合之间的平衡。

中介体与检测分子的相互作用事件产生了局部的可检测信号。如果通过中介体延伸激活足够数量的检测分子并导致5'末端的置换，则信号被放大并且可以使用合适的检测装置检测。这允许在反应混合物存在的情况下进行检测并且不需要任何处理步骤。

实施例5：多重分析

多重分析需要检测反应混合物中的几种不同分析物。为了增加根据本发明的反应的多重的程度，计划对于n种不同的靶分子使用n种不同的中介探针。可以为待检测的每种靶分子指定中介探针，该中介探针的探针区与靶分子或模板分子特异性相互作用。中介体结合区和相应中介探针的中介体不与靶分子或模板分子亲和或互补。然而，中介体代表确定的检测分子的特异性相互作用的伴侣。因此，每种靶分子间接分配有由中介探针指定的检测分子。检测不同的靶分子需要不同的检测分子。

由于中介探针的探针区和中介体结合区可以彼此独立地自由组合，因此在任何探针区的情况下，通过将匹配的中介体结合区和中介体连接和合成，检测分子也可以与其他靶分子相关联。因此，根据本发明的方法允许靶分子不依赖于检测分子而设计。因此，利用归一化的检测分子组，可以在一个样品中检测不同的靶分子，其中通过调整中介探针并使用合适的辅助分子(例如引物或适体)可以成本有效地使该反应适应于相应的靶分子。

发明实施的实施例可以包括每种靶分子的多种中介体和/或多种中介探针和/或多种检测分子。以下系列是可能的。

A.与同一中介探针结合的几种中介体可以与几种检测分子结合。通过巧妙地组合中介探针的几种中介体与不同的检测分子，可以大大提高测定的多重的程度。先决条件是检测分子产生具有不同波长的荧光信号。通过每种中介探针和靶分子使用n种检测分子和两种中介体，可以检测+n种不同的靶分子。二项式系数可以用于计算给定数量的不同检测分子的可检测靶分子的数量。由于目标分子不仅可以通过产生具有两个不同波长的两个荧光信号来识别，而且还可以通过产生单个荧光信号来识别，因此二项式系数的值必须增加n以计算可检测的靶分子的最大数量。利用四个不同的检测分子，可以检测到10个不同的靶分子，而仅5种检测分子就允许15种靶分子的分化(图5A)。类似地，每种靶分子可以使用几种中介探针，其中一种中介探针可以仅含有一种中介体。

B.可以使用与相同靶分子或模板分子结合的一个或多个中介探针，并且这种中介探针的一个中介体(mediator)或多个中介体(mediators)可以同时与一个或多个检测分子结合。通过巧妙地组合检测分子中的中介体结合区，例如，可以仅使用两种检测分子来区分三种靶分子。通过每种检测分子使用n种检测分子和至少两种中介体，可以检测“2ⁿ-1”种不同的靶分子。几种不同的中介探针可以结合相同的靶分子。在上述实施例中，其中，可以仅使用两种检测分子了区分三种靶分子，检测分子可以各自含有两个不同的中介体结合区。连接至两个不同靶序列的两种中介体各自仅与一种特异性检测分子结合。每种靶分子产生特定的信号。连接至第三个靶序列的第三种中介体与两种检测分子结合，并且因此触发两个不同的信号。为了确保两个释放的中介体同时与同一检测分子结合的可能性足够高，释放的中介体的浓度应该是检测分子浓度的量级(图5B)。另外，也可以使用能够结合两个以上不同中介体的检测分子。

C.可以使用几种中介探针，每种中介探针选择性地结合共同的靶分子或模板分子，其中这些中介探针的一个中介体(mediator)或多个中介体(mediators)具有不同的序列。几个不同的中介体可以与一个且相同的检测分子结合，其中检测反应仅可以通过结合几种中介体来触发。该方法可用于增加检测反应的特异性。可能的反应序列在图5C中示出。为了确保两个释放的中介体同时与同一检测分子结合的可能性足够高，释放的中介体的浓度应该是检测分子浓度的量级。

实施例6：熔解曲线分析

在本发明的某些形式中，可以在扩增反应后进行与延伸的中介体杂交的检测分子的熔解曲线分析。这允许通过使用不同的检测分子(例如标记有不同的信号分子)来实现多重的程度的额外增加。

实施例7：分子信标形式的检测分子

在本发明的可能形式中，检测分子具有分子信标的结构，其中中介体结合区定位于环中(图6)。通过将中介体附连至所述检测分子并随后延伸，分子信标打开并将标记的5'和3'末端分开，导致可检测的信号增加。这种结构相对于迄今为止所考虑的结构(图3)的优点是末端荧光标记物的合成成本较低。

实施例8：由两个标记的寡核苷酸组成的检测分子

在本发明的另一个形式中，检测分子由几个荧光标记的寡核苷酸组成。标记有猝灭剂和荧光团的两个寡核苷酸可以彼此杂交并在与中介体相互作用时分离，因此可以检测到信号变化。所描述的检测分子可以构建成如图19所示。

实施例9：来自具有杂交探针的单链DNA的检测分子

在该设计中，检测分子可以由单链DNA组成，该单链DNA与标记有荧光供体和荧光接受体的几个探针杂交。在中介体释放后，中介体与检测分子结合并延长，从而释放标记的探针并且荧光供体和荧光接受体在空间上彼此分离，导致荧光增加。检测分子与几个标记的探针的多重杂交导致信号产生的多重效应。检测分子可以是线性的或环状的，它可以在溶液中是均质的或固定在固相上并且可以具有几个中介体结合位点。如果检测分子是环状的并且***了几个中介体结合位点，则通过同时结合位于不同位点的几种中介体可以在良好的动态范围内发生快速检测反应。检测分子的环状结构允许实现灵敏度的额外增加，这是因为检测分子上的中介体的杂交和延伸释放了所有结合的、标记的探针，而不管中介体结合的位点。具有不同在不同波长发射的荧光供体和荧光接受体的探针可以与检测分子结合。通过组合不同的荧光染料，荧光染料也可以以不同的浓度使用(其由每种检测分子的标记的探针的数量决定)，可以增加多重的程度。可以将某些浓度比指定给确定的检测分子。标记的探针在释放后可以与之结合的结合分子(图7)可以用于在较长的时间内防止释放的标记有荧光供体或荧光接受体的探针与检测分子重新结合。所描述的设计优选与等温扩增方法一起使用，从而确保标记的探针在靶分子不存在的情况下与检测分子结合，并且不与检测分子发生由于例如通过PCR产生的高热能导致的解离。

在优选的设计中，标记有荧光供体和荧光接受体的探针未通过延伸中介体而与检测分子分离，而是通过在释放的中介体存在的情况下调节平衡来置换。释放的中介体与未标记的检测分子具有比标记的探针更高的结合能，并且因此置换例如标记有荧光接受体的较短探针(图25)。

实施例10：经由全内反射荧光显微镜(TIRF)或表面等离子共振光谱法进行的检测

与电化学检测类似，可以在某些设计中进行通过内部全反射荧光显微镜(TIRF)的检测。在该方法中，检测分子固定在TIRF发光器上方的玻璃或聚合物测试载体上。由全反射形成的消逝场穿透到样品体积中并激活荧光分子，该荧光分子定位于检测分子和/或中介体和/或定位于探针处或嵌入二聚体中，由此可以检测到荧光信号的变化。在另外的形式中，通过表面等离子共振光谱法检测到中介体与检测分子的结合。通过中介体的释放和随后将其结合到固定在表面上的检测分子，可以检测到样品中折射率的变化。检测分子可以直接固定在等离子体在其中被激活的金属表面上，或者例如，在直接定位于金属表面上的膜内/上。

实施例11：通过重量测量进行的验证

在本发明的优选形式中，可以通过重量测量来证明中介体的释放和与检测分子的结合。例如，将检测分子固定在载体表面上，载体表面的重量可以用振荡石英来测定。因此可以检测到由于中介体与检测分子的结合导致的重量变化。

实施例12：滚环扩增的证明

在本发明的优选形式中，在适当的扩增酶存在的情况下释放的中介体可以触发滚环扩增，并且因此可以通过检测滚环扩增的产物来识别靶分子。滚环扩增的扩增产物可以例如经由探针或经由pH值变化、凝胶电泳或比色法来序列特异性地检测。

实施例13：经由测序的检测

在本发明的优选形式中，释放的中介体可以通过测序来分析并且从而识别。下一代测序的实例是纳米孔测序，其中，带孔的膜上的电势变化可以在分子(诸如核酸)流过它时被测量，因此可以测定核酸的序列。测序可以用于检测任何数量的中介体的同时释放，每种中介体都表示特定的靶分子的存在。与常规方法(诸如荧光测量)相比，多重的程度显著增加。测序方法不限于纳米孔测序，因为可以选择任何测序方法来检测释放的中介体。

实施例14：使用选定的中介体

在本发明的优选形式中，与中介探针结合的中介体可以标记有在特定波长λ₁发射的荧光供体/荧光接受体。在中介探针的置换后，中介体可以与标记有荧光接受体/荧光供体的检测分子结合，荧光接受体/荧光供体在不同于λ₁的第二波长λ₂发射。经由FRET机制从荧光供体到荧光接受体的能量转移导致了荧光接受体的辐射强度的可检测的增加，这允许待检测λ₂的发射。在另外的形式中，可以使用化学发光或生物发光供体分子。不发光的荧光接受体也可以用于设计中。通过使用具有不同核苷酸数的检测分子，通过熔解曲线分析可以同时区分一个样品中的不同靶分子。通过标记中介体，所述检测方法的通用特征不会丢失，这是因为中介体是不依赖于靶序列的通用分子。在另外的设计中，每种靶分子可以使用几个探针或引物，标记有荧光染料的中介体与几个探针或引物结合，其中中介体的序列和荧光染料的发射波长可以不同(图9)。

实施例15：等温扩增方法的使用

在该实施例中，根据本发明的检测方法用于以等温扩增方法例如LAMP检测DNA。LAMP期间中介体释放的机制在图10中详述。LAMP的初始扩增步骤导致哑铃状结构的中间扩增产物。在该实施例中用作引物的中介探针可以与该中间扩增产物结合并在下一步中延伸。通过置换该中间扩增产物，其他引物可以与延伸的中介探针结合并延伸。在此过程期间，中介体通过链置换聚合酶被置换。释放的中介体现在可以与具有发夹结构的检测分子结合并且还可以延伸。在中介体延伸期间，检测分子的闭合发夹结构的5'末端从互补区域被置换，产生荧光信号。

将样品和试剂置于合适的反应容器中并温育该混合物(在约62℃持续10min至60min之间)。在此过程期间，在反应容器中检测到荧光。在下文中，详细描述了使用LAMP实例描述的执行：

对于大肠杆菌DNA(W3110，完整基因组)的实时LAMP检测，使用了表1中列出的引物。LAMP引物取自(Tanner等人，2012)并部分修饰。通过在引物的5'末端添加中介体结合区，将中介探针与LoopF引物组合，该引物可以与中介体杂交。使用VisualOMP(DNA软件，USA)手动产生了中介体、具有中介体结合区的LoopF和检测分子。来自表1的合成寡核苷酸由Biomers(biomers.net，Ulm，Germany)合成。

表1：用于检测大肠杆菌DNA的实时LAMP的引物、中介体和检测分子的序列。

在1x等温扩增缓冲液(New England Biolabs，Frankfurt，Germany)中用Bst2.0WarmStart DNA聚合酶进行LAMP反应。1x等温扩增缓冲液含有20mM Tris-HCl、10mM(NH₄)₂SO₄、50mM KCl、2mM MgSO₄和0.1％20(pH8.8，25℃)。另外，将终浓度8.0mM的MgSO₄(New England Biolabs，Frankfurt，Germany)和终浓度1.4mM的dNTP Mix(Qiagen，Hilden，Germany)，加入缓冲液中。LAMP反应由1.6μM FIP和BIP、0.2μM F3和B3、0.8μMLoopB、0.6μM LoopF、0.2μM具有中介体结合区的LoopF、0.1μM中介体、0.05μM检测分子、320U/ml Bst 2.0WarmStart DNA聚合酶、1x等温扩增缓冲液和1g/l BSA组成。反应在rotorgene 6000(Corbett，Mortlake，Australia，now Qiagen，Hilden，Germany)中在62℃一式三份地进行。将0min时的荧光数据归一化为初始值(图11)。

该检测方法也用于杜克雷嗜血杆菌和苍白密螺旋体的LAMP。性能和反应条件与上述大肠杆菌的LAMP相同，但使用杜克雷嗜血杆菌和苍白密螺旋体的序列特异性引物。将0min时的荧光数据归一化为初始值(图26和图27)。

实施例16：使用RT-LAMP的根据本发明的程序

在另外的实施例中，根据本发明方法的检测可以用于检测RNA，其中使用逆转录(RT)或另一种合适的酶系统将RNA转录成cDNA，并且然后扩增cDNA。在下文中，详细描述了使用RT-LAMP实施的实例：

表2中列出的引物用于RT-LAMP以检测HIV-1RNA。取RT-LAMP引物(Curtis等人，2008)并部分修饰。通过在引物的5'末端添加中介体结合区，将中介探针与LoopF引物组合，其可以与中介体杂交。使用VisualOMP手动产生了中介体、具有中介体结合区的LoopF和检测分子。合成的寡核苷酸中介体、具有中介体结合序列的LoopF和检测分子通过Biomers(biomers.net，Ulm，Germany)合成，引物FIP、BIP、F3、B3、LoopF和LoopB通过Ella Biotech(Martinsried，Germany)合成。模板RNA(HIV、VR-3245SD)通过ATCC，LGC Standards GmbH(Wesel，Germany)合成。

表2：用于检测HIV-1RNA的实时RT-LAMP的引物、中介体和检测分子序列。

在1x等温扩增缓冲液(New England Biolabs，Frankfurt，Germany)中用Bst2.0WarmStart DNA聚合酶(New England Biolabs，Frankfurt，Germany)和Transcriptor逆转录酶(Roche Diagnostics，Mannheim，Germany)进行RT-LAMP反应。1x等温扩增缓冲液含有20mM Tris-HCl、10mM(NH4)₂SO₄、50mM KCl、2mM MgSO₄和0.1％20(pH8.8，25℃)。另外，将终浓度8.0mM的MgSO₄(New England Biolabs，Frankfurt，Germany)和终浓度1.4mM的dNTP Mix(Qiagen，Hilden，Germany)加入缓冲液中。RT-LAMP反应由1.6μMFIP和BIP、0.2μMF3和B3、0.8μMLoopB、0.6μMLoopF、0.2μM具有中介体结合区的LoopF、0.1μM中介体、0.05μM检测分子、320U/ml Bst 2.0WarmStart DNA聚合酶、400U/ml Transcriptor逆转录酶和1x扩增缓冲液组成。该反应在rotor gene 6000(Corbett，Mortlake，Australia，now Qiagen，Hilden，Germany)中在63℃下一式三份地进行。阳性对照含有3400个合成HIV-1RNA的拷贝/反应，阴性对照不含HIV-1RNA。将0min时的荧光数据归一化为初始值(图12)。

该检测方法也成功应用于人T淋巴细胞病毒(HTLV-1)和烟草花叶病毒(TMV)RNA的RT-LAMP。性能和反应条件与已经描述的HIV-1的RT-LAMP相同，但具有HTLV-1和TMV的序列特异性引物。将0min时的荧光数据归一化为初始值(图28和图29)。

实施例17：使用非等温扩增反应的根据本发明的程序

在本发明的其他实施例中，根据本发明的检测方法可以用于检测非等温扩增反应诸如PCR或PCDR中的DNA。这涉及以这样的方式修饰一个或多个引物，使它们代表中介探针。在合适的反应容器中，放置样品和所需的试剂并温育该混合物。在此过程期间，在反应容器中检测到荧光。在下文中，使用PCDR详细描述了执行实施例：

表3中列出的引物用于小鼠DNA的实时PCDR检测。用于扩增G3PDH DNA的PCDR引物取自(Ignatov等人，2014)并部分修饰。使用F3引物通过将中介体结合区附连至引物的5'末端产生了中介探针，其可以与中介体杂交。使用VisualOMP手动产生了中介体、具有中介体结合区的F3和检测分子。通过Biomers(biomers.net，Ulm，Germany)合成引物以及合成的寡核苷酸中介体、具有中介体结合序列的F3和检测分子。待扩增的小鼠G3PDH DNA序列取自(Ignatov等人，2014)，并且G3PDH片段由Integrated DNA Technologies(IDT，Coralville，IA)合成。

表3：用于检测小鼠G3PDH DNA的实时PCDR的引物、中介体和检测分子序列。

在1x SD缓冲液(Bioron，Ludwigshafen，Germany)中用SD Hotstart DNA聚合酶进行了PCDR。另外，将终浓度2.75mM的MgCl₂(Bioron，Ludwigshafen，Germany)和终浓度0.25mM的dNTP(New England Biolabs，Frankfurt，Germany)加入缓冲液中。PCDR反应由各自0.1μM的F3和具有中介体结合区的F3、0.2μM R3、0.1μM F2和R2、0.05μM F1和R1、0.05μM中介体、0.05μM检测分子、200U/ml SD Hotstart DNA聚合酶和1xSD缓冲液组成。该反应在rotor gene 6000(Corbett，Mortlake，Australia，now Qiagen，Hilden，Germany)中根据以下方案(Ignatov等人，2014)进行：在92℃初始变性2min，然后在92℃(15sec)和66℃(40sec)循环45次。将0次循环的荧光数据归一化为初始值(图30)。阳性对照每次反应含有100μg G3PDH片段，阴性对照不含模板DNA。

实施例18：不用作引物的发明的中介探针

在另外的实施例中，根据本发明方法的检测可以用于检测具有增加的特异性的DNA或RNA。引物不用作中介探针，而使用不作为扩增的起始点的特定探针。在靶分子不存在的情况下，探针闭合。一旦靶分子在反应混合物中，中介探针与靶分子或模板分子结合，由此引物可以与现在打开的中介探针的3'末端结合。通过用合适的酶系统处理，附连的引物可以延伸，从而中介体被中介探针置换。借助于特异性的检测分子可以检测释放的中介体。酶促扩增过程可包括但不限于等温过程(图13)。

实施例19：靶分子特异性的适体的使用

在另外的形式中，可以应用根据本发明的检测方法用于通过靶分子特异性的适体来检测靶分子。将靶分子特异性的适体、待研究的样品和检测分子置于合适的反应容器中。待检测的靶分子可以是蛋白质或肽，例如，但不限于此。适体结合靶分子并改变其结构，使得适体特异性的中介探针和引物可在相互作用之后附连。通过用合适的酶系统处理，附连至适体的引物可以延长(图14：适体中的白色标记物)，导致适体序列在蛋白质结合区域外扩增。通过将中介探针与线性扩增产物结合，探针打开并使用其他引物从中介探针置换中介体。可以使用特异性的检测分子或合适的检测方法来检测释放的中介体。酶促扩增过程可以包括但不限于等温过程(图14)。

实施例20：修饰的中介探针，其具有适体区、中介体结合区和引物结合区。

在优选的设计中，巧妙的检测方法可以用于使用修饰的中介探针来检测靶分子，该修饰的中介探针具有适体区、中介体结合区和引物结合区。待检测的靶分子可以是蛋白质或肽，例如，但不限于此。在靶分子不存在的情况下，引物与中介探针结合并且可以通过用合适的酶系统处理来延长，从中介探针中置换出中介体。释放的中介体可以使用特异性的检测分子或方法触发可检测的信号。如果靶分子存在，则中介探针的适体区与靶分子结合，由此附连至引物结合区的引物不能延伸(图15)。如果靶分子存在，则与靶分子不存在相比，检测到信号下降。酶促扩增过程可以包括但不限于等温过程。

实施例21：该适体包括侧翼为引物结合区的蛋白质结合区的适体的使用

为了产生指数检测反应，使用了中介探针，该中介探针由在5'末端具有中介体杂交序列的引物和与其杂交的中介体组成。另外，使用了适体，其是侧翼为引物结合区的蛋白质结合区。在靶分子存在的情况下，适体与靶分子结合。由于与靶分子的结合，与适体结合的引物不能延伸。因此，不释放中介体，并且在靶分子存在的情况下，与靶分子不存在相比检测到信号下降。在靶分不存在子的情况下，引物可以与适体结合并延长，这通过中介体释放使得信号增加。酶促扩增过程可以包括但不限于等温方法(图16)。

实施例22：检测分子的固定化

在根据本发明的检测方法的其他优选形式中，检测分子可以在合适反应容器中固定在固相上。然后将样品和所需试剂加入反应容器中，并在适当条件下温育该混合物。样品可以由DNA、RNA和/或肽或蛋白质组成。如果靶分子存在，则中介体被中介探针置换并且可以在反应混合物中扩散到固定的检测分子。该程序包括但不限于等温扩增程序(图17)。

实施例23：弛豫测量法的使用

在另外的形式中，根据本发明的检测方法可以用于与磁弛豫测量法结合来检测靶分子。检测分子可以与磁性颗粒结合并允许通过磁弛豫测量法进行检测。在磁弛豫测量中，磁性颗粒被短磁脉冲磁化，并且检测到感应磁矩的时间劣化。中介体经由固定在颗粒上的检测分子与之结合并延伸的颗粒的流体动力学阻力更大，即相对于无中介体与之结合的颗粒的流体动力学阻力。中介体与之结合并延伸的颗粒因此比无中介体与之结合的颗粒更慢地降低它们的感应磁矩。因此，所述颗粒的感应磁矩的弛豫时间彼此不同，由此可以检测到中介体的释放。通过将磁弛豫测量法与熔解曲线分析结合，可以在一个样品中同时检测不同的靶分子。该程序包括但不限于等温扩增程序。

实施例24：磁性或可磁化颗粒的使用

在其他设计中，根据本发明的检测方法可以用于与磁性或可磁化颗粒组合以检测靶分子(图31)。中介体与磁性或可磁化纳米颗粒结合。几种中介体可以同时结合一个颗粒。根据本发明，中介体最初与引物杂交。在靶分子或模板分子的扩增期间，中介体被引物置换，并且然后可以与固定在固相上的检测分子杂交。释放的中介体和检测分子之间的结合将纳米颗粒带到固相表面，这使得能够检测磁性的变化。为了检测固相表面上的信号变化，尤其可以使用磁场传感器，例如但不限于，基于电磁、磁阻(magneto-resistive)、磁光效应或基于约瑟夫森效应。为了防止由于未释放的中介体/颗粒单元沉积在固相上而导致的假阳性信号，可以通过施加弱磁场将未释放的中介体/颗粒单元与固相分离。

实施例25：用具有发夹结构的检测分子进行的电化学检测

在另外的形式中，根据本发明的检测方法可以用于与电化学检测结合来检测靶分子。在该形式中，检测分子固定在电极上，该电极同时代表固相。释放的中介体可以与检测分子在中介体结合区中杂交并通过聚合酶延伸。中介体结合区可以定位于检测分子的不同区域。检测分子可具有发夹结构并在5'末端标记有氧化还原分子。中介体的延伸置换检测分子的5'末端并打开后者。由于标记的5'末端的置换，氧化还原分子和电极表面之间的距离增加，导致可检测的信号变化。该程序包括但不限于等温扩增程序(图18)。

实施例26：固相上的电化学检测证明

在该优选设计中，通过电化学检测的检测可以在固相上进行。在该形式中，检测分子固定在电极上，该电极同时代表固相。释放的中介体可以与检测分子在中介体结合区中杂交并通过聚合酶延伸。延伸后，氧化还原分子可以嵌入检测分子和延伸的中介体的二聚体中并产生可以检测的电化学信号(图8)。根据图20，信号产生也可以在没有的中介体延伸的情况下进行。中介体可以是无标记的并且可以使用嵌入的氧化还原分子和/或中介体可以标记有一个或多个氧化还原分子。如图21-图23所示，如果中介体标记有氧化还原分子，则释放的中介体与检测分子的结合和必要时随后的中介体的延伸导致信号产生。在另一形式中，检测分子标记有一个或多个氧化还原分子。根据图24，释放的中介体与检测分子的结合和可能随后的中介体的延伸导致信号变化。每种靶分子和/或扩增子释放几种中介体以获得更强的信号可能是有利的。例如，通过将中介体附连至几个不同的中介探针，可以实现每种靶分子释放几种中介体。

在下文中，将讨论根据图21的电化学检测。中介体标记有(a)氧化还原分子并在扩增期间释放。在该形式中，未标记的检测分子固定在电极上，该电极同时代表固相，并且释放的中介体可以与检测分子在中介体结合区中杂交。由于中介体上的氧化还原分子与电极表面之间的空间接近，可以检测到信号变化。检测可以在扩增反应期间实时进行或通过将扩增产物转移至电极表面作为终点检测进行。下面使用大肠杆菌的LAMP扩增产物的电化学终点检测详细描述了执行的实施例：

如实施例15中所述进行了LAMP反应。然而，对于电化学检测中介体，相应地调整了具有中介体结合序列的LoopF和检测分子(表4)。具有中介体结合序列的LoopF和检测分子通过Biomer(biomers.net，Ulm，Germany)合成，用亚甲蓝衍生物(Atto MB2)修饰的中介体通过IBA Lifesciences(Germany)合成。

表4具有中介体结合序列的LoopF、中介体和检测分子序列用于大肠杆菌的LAMP的电化学检测。

在如实施例15中所述进行了大肠杆菌DNA的LAMP后，将反应混合物转移到具有电极的室中，检测分子固定在该电极上。通过方波伏安法对阳性对照反应中释放的中介体(大肠杆菌DNA的60,000个拷贝)进行了电化学检测(图32)。在阳性对照中，中介体在LAMP反应期间被置换并且在将反应混合物转移到电极室中之后可以与检测分子杂交。因此，标记的(此处为亚甲基蓝)中介体积聚在电极表面上，这引起电化学分析(这里是方波伏安法)中-0.39V处特征峰的形成。相反，阴性对照(NTC)中没有峰，表明没有显著的中介体释放。在此，根据本发明的检测方法与电化学检测结合的应用证明是特别有利的，这是因为在扩增反应之后不需要进行另外的修饰或反应步骤。

实施例27：DNA、RNA、肽和/或蛋白质的平行检测

在根据本发明的方法的优选形式中，通过所述方法以一种方法平行检测DNA、RNA和肽或蛋白质或所述物质类别的其他组合。该程序包括但不限于等温扩增程序。

参考文献

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序列表

<110> 阿尔伯特-路德维希-弗莱堡大学（Albert-Ludwigs-Universität Freiburg）

哈恩-希卡尔特应用研究学会公司 （Hahn-Schickard-Gesellschaft für angewandteForschung e.V.）

<120> 两部分式中介探针

<130> PN19026256P

<160> 30

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 1

ctgccccgac gataggctta atcgtggtct ggtgaagttc tacgg 45

<210> 2

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 2

ccagtgcgac ctgctgggtg ggtattgttc gccgccagta c 41

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 3

gatcaccgat ttcaccaacc 20

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 4

cttttgagat cagcaacgtc ag 22

<210> 5

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 5

tgcgccatgt cccgct 16

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 6

tgagttaacc cacctgacg 19

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 中介体

<400> 7

tccgcagcaa gtgggctcta cgacc 25

<210> 8

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 中介探针的第一部分

<400> 8

ggtcgtagag cccacttgct gcggatgcgc catgtcccgc t 41

<210> 9

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 检测分子

<400> 9

gaccggccaa gacgcgccgg tctgttggtc gtagagccca gaacga 46

<210> 10

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 10

cagcttcctc attgatggtt tctttttaac accatgctaa acacagt 47

<210> 11

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 11

tgttgcacca ggccagataa ttttgtactg gtagttcctg ctatg 45

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 12

attatcagaa ggagccacc 19

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 13

catcctattt gttcctgaag g 21

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 14

tttaacattt gcatggctgc ttgat 25

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 15

gagatccaag gggaagtga 19

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 中介体

<400> 16

ccatgcctca ggagctcagt tcggtcagtg 30

<210> 17

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 中介探针的第一部分

<400> 17

cactgaccga actgagctcc tgaggcatgg tttaacattt gcatggctgc ttgat 55

<210> 18

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 检测分子

<400> 18

caccggccaa gacgcgccgg tgtgttcact gaccgaactg gagca 45

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 19

gtgaaggtcg gtgtgaacgg a 21

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 20

ttctgccgat gcccccatgt 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 21

gcatcctgca ccaccaactg 20

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 22

ggtttcttac tccttggagg c 21

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 23

cagatccacg acggacacat t 21

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 24

gagcttcccg ttcagctctg 20

<210> 25

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 中介体

<400> 25

taaagccata gccgtactag ctgctccagt tcggtcagtg 40

<210> 26

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 中介探针的第一部分

<400> 26

cactgaccga actggagcag ctagtacggc tatggcttta gcatcctgca ccaccaactg 60

<210> 27

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 检测分子

<400> 27

caccggccaa gacgcgccgg tgtgttcact gaccgaactg gagca 45

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 中介体

<400> 28

tcgttctggg ctctacgacc 20

<210> 29

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 中介探针的第一部分

<400> 29

ggtcgtagag cccagaacga tgcgccatgt cccgct 36

<210> 30

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 检测分子

<400> 30

tttttttttt ggtcgtagag cccagaacga 30

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.用于检测至少一种靶分子的中介探针，其中，所述中介探针包括至少两个寡核苷酸，其特征在于

a)第一寡核苷酸包括探针区和中介体结合区，其中

i所述探针区对靶分子和/或模板分子具有亲和力，

ii所述中介体结合区对至少一种中介体具有亲和力，以及

iii所述中介探针的第一寡核苷酸不包括用于产生信号的标记，

b)至少一个另外的寡核苷酸是中介体，所述中介体

i经由所述中介体结合区与所述中介探针的所述第一寡核苷酸结合，以及

ii对至少一种检测分子具有亲和力，其中，所述中介体从所述中介探针的所述第一寡核苷酸释放后通过与所述检测分子相互作用触发可检测的信号。

2.根据权利要求1所述的中介探针，其特征在于，所述中介体不包括用于产生信号的标记物。

3.根据权利要求1所述的中介探针，其特征在于，所述中介体含有一种或多种用于产生信号的标记物，优选荧光分子、氧化还原分子、发光分子或其他产生信号的单元。

4.包括至少一种根据权利要求1至3之一所述的中介探针和至少一种检测分子的系统，其特征在于，所述至少一种检测分子包括一个或多个寡核苷酸并且包括与至少一种中介体相互作用的至少一个第一区域，以及

a)第二区域，包括荧光接受体或荧光供体和/或用于结合固相的化学基团和/或化学保护基团和/或氧化还原修饰和/或发光修饰，和/或

b)第三区域，包括荧光供体或荧光接受体和/或用于结合固相的化学基团和/或化学保护基团和/或氧化还原修饰和/或发光修饰，或者

c)至少一个第四区域，所述至少一个第四区域与具有荧光供体和/或荧光接受体的至少一种第一探针相互作用，和/或

d)至少一个第五区域，所述至少一个第五区域与包括荧光供体和/或荧光接受体至少一种第二探针相互作用。

5.根据前述权利要求所述的系统，其特征在于，所述检测分子具有发夹结构。

6.一种检测至少一种靶分子的方法，包括以下步骤：

a)提供至少一种根据权利要求4或5所述的系统，

b)使所述至少一种中介探针的第一寡核苷酸的探针区与所述模板分子和/或靶分子的序列的结合，

c)扩增所述至少一种中介探针的第一寡核苷酸和/或模板分子和/或靶分子，

d)通过至少一种辅助分子释放所述至少一种中介体，

e)使所述至少一种释放的中介体与所述至少一种检测分子的结合，以及

f)检测信号的变化。

7.根据前述权利要求所述的方法，其特征在于，所述至少一种中介体结合所述检测分子的第一区域并通过所述至少一种辅助分子来酶促延伸，所述辅助分子优选与结合中介体的3'末端结合，由此在所述检测分子中发生物理或化学可测量的变化。

8.根据权利要求6或7之一所述的方法，其特征在于，在所述中介探针的第一寡核苷酸的探针区与模板分子和/或靶分子的序列结合后，所述中介探针的第一寡核苷酸的3'末端通过辅助分子酶促延伸。

9.根据权利要求6至8中任一项所述的方法，其特征在于，所述中介探针的第一寡核苷酸和/或模板分子和/或靶分子的扩增是经由等温或非等温扩增方法进行的。

10.根据权利要求6至9之一所述的方法，其特征在于，所述检测分子具有至少一种荧光或发光修饰，并且在与所述至少一种中介体反应后，所述荧光或发光修饰可以借助于辅助分子从所述检测分子切掉，和/或除去所述检测分子的发夹结构的5'末端和/或展开所述发夹结构，并在所述检测分子上检测所述荧光信号或发光信号的变化。

11.根据权利要求6至10之一所述的方法，其特征在于，每种中介探针使用几种中介体和/或每种靶分子使用几种中介探针和/或几种检测分子。

12.根据权利要求6至11中任一项所述的方法，其特征在于，所述至少一种辅助分子具有DNA链分离效应和/或聚合效应，其中，所述辅助分子优选为链置换聚合酶。

13.根据权利要求6至12中任一项所述的方法，其特征在于，所述靶分子和/或模板分子是选自由以下组成的组的生物分子：DNA、RNA、肽、蛋白质、适体，和/或其组合。

14.根据权利要求6至13中任一项所述的方法，其特征在于，所述辅助分子选自由以下组成的组：聚合酶、催化剂、蛋白质、核酸、天然物质、酶、酶系统、细胞裂解物、细胞组分、衍生自细胞组分的衍生物和/或合成分子。

15.根据权利要求6至14中任一项所述的方法，其特征在于，荧光、磷光、发光、质量、吸收、光散射、电导率、酶活性和/或亲和力、电化学电位或信号、折射率、表面等离子体的触发、磁弛豫、磁性、阻抗或电容的可测量变化是通过固定或非固定的检测分子与至少一种中介体之间的直接或间接相互作用而发生的。

16.根据权利要求6至15中任一项所述的方法，其特征在于，所述至少一种中介体的释放是借助于等温或非等温扩增方法扩增所述至少一种中介体来检测的。

17.根据权利要求6至16之一所述的方法，其特征在于，所述至少一种释放的中介体通过测序检测。

18.根据权利要求6至17之一所述的方法，其特征在于，所述至少一种释放的中介体通过杂交与所述检测分子结合，任选在与所述检测分子结合后通过辅助分子延伸，并且然后进行熔解曲线分析。