阅读说明：本技术 ω-转氨酶突变体及其在制备西他列汀中间体中的应用 (Omega-transaminase mutant and application thereof in preparation of sitagliptin intermediate ) 是由 柳志强 程峰 陈秀玲 张晓健 郑裕国 何人宝 金逸中 林娇华 于 2019-08-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种ω-转氨酶突变体及其在制备西他列汀中间体中的应用,该ω-转氨酶突变体由SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第56位或第134位进行单突变获得；第56位的苯丙氨酸替换成缬氨酸、组氨酸或酪氨酸；第134位的苏氨酸替换成甘氨酸。本发明通过分子对接和同源建模等方式获得一些可能影响其催化活性的位点,对其进行了定点突变,最终得到的ω-转氨酶突变体不仅具有较高的酶活,酶活均高于300U/g,至少是野生型的2.7倍,而且能够高效催化西他列汀中间体前体酮1-哌啶-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-二丁酮合成西他列汀中间体(R)-3-氨基-1-哌啶-4-(2,4,5-三氟苯基)-1-丁酮,转化率高达85％。(The invention discloses a omega-transaminase mutant and application thereof in preparing sitagliptin intermediates, wherein the omega-transaminase mutant is obtained by performing single mutation on the 56 th site or the 134 th site of an amino acid sequence shown in SEQ ID No. 2; a substitution of phenylalanine at position 56 with valine, histidine or tyrosine; threonine at position 134 is replaced with glycine. According to the invention, some sites which may influence the catalytic activity of the mutant are obtained through molecular docking, homologous modeling and other modes, site-directed mutation is carried out on the mutant, and the finally obtained omega-transaminase mutant not only has higher enzyme activity which is higher than 300U/g and at least 2.7 times of that of a wild type, but also can efficiently catalyze sitagliptin intermediate precursor ketone 1-piperidine-4- (2,4, 5-trifluorophenyl) -1, 3-dibutyrup to synthesize the sitagliptin intermediate (R) -3-amino-1-piperidine-4- (2,4, 5-trifluorophenyl) -1-butanone, and the conversion rate is as high as 85%.)

ω-转氨酶突变体及其在制备西他列汀中间体中的应用

技术领域

本发明涉及生物化工技术领域，具体涉及一种ω-转氨酶突变体及其在制备西他列汀中间体中的应用，尤其涉及是在制备西他列汀中间体1-哌啶-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-二丁酮中的应用。

背景技术

西他列汀(sitagliptin)由美国Merck公司和Codexis公司研制和开发，是首个获得FDA批准用于治疗Ⅱ型糖尿病的二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制剂(2016年10月)，也是II型糖尿病口服治疗药捷诺维(盐酸西他列汀片，JANUVIA)的活性成分。西他列汀是一种二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制剂，通过酰胺部分与DPP-4活性部分结合抑制其活性，延长降血糖素(Incretin)的半衰期，使得血浆中GLP-1和GIP活性提高的同时只是轻度增加其含量，却不会引起因GLP-1含量过高而产生的副作用，具有较好的安全性和耐受性。

在联合用药方面，与二甲双胍或吡格列酮联合用药时均优于其各自单独用药。临床上对于西他列汀的应用相比于同类药物其用药优势突出，基于其良好的市场前景，西他列汀具有较好的研究价值。捷诺维(Januvia)，目前已在全世界70多个国家批准使用，近年来销售额都在40亿美元左右(2016年与二甲双胍联合销售合计61亿美元)，是国际上药物销售额前20强的药物。

制备光学纯西他列汀及其中间体主要有化学合成法、手性拆分法和不对称合成法。化学合成法工艺步骤繁多，所需要的合成试剂价格昂贵，导致成本投入高，而且部分试剂对环境和人体都有一定的毒害作用，无法满足当今的绿色环保要求。手性拆分制备光学纯西他列汀及其中间体过程用到手性试剂，拆分收率最高仅为50％，且手性拆分过程复杂。不对称合成法具有立体选择性严格、反应条件温和，收率高以及容易分离纯化等优点，适用于大规模制备西他列汀及其中间体。对于不对称合成法而言关键就是要获得一种ω-转氨酶，其能够催化不对称转氨反应得到光学纯的西他列汀中间体。

国际专利申请W02004087650公开了默克公司关于西他列汀中间体的合成路线，利用手性钌催化剂对酮进行不对称氢化构建手性醇，然后将手性醇转化成手性胺。该合成方法中，需要用到钌催化的不对称氢化，催化剂价格昂贵，总收率只有52％，工艺中用到高压氢气，立体选择性也不高。

国际专利申请W02007050485公开了默克公司关于西他列汀中间体的合成方法，采用了手性锗催化剂对烯胺的不对称氢化来合成手性胺，产率达到84％，ee值94％，但该方法需要用昂贵的锗手性催化剂，去除与回收也较为困难。

中国专利申请文献CN102838511A公开了浙江海翔药业关于西他列汀中间体的生产方法，采用格式试剂对手性环氧氯丙烷进行亲核取代，而后用氰化物进行取代水解合成beta-羟基酸，该方法总收率仅40％，而且采用剧毒氰化物，应用受限。

中国专利申请文献CN102485718A公开了浙江海翔药业关于西他列汀中间体合成的路线，通过采用甲硫氨酸作为手性源进行合成，但是产率仅14％。

中国专利申请文献CN103014081A公开了苏州汉酶公司利用转氨酶将3-碳基-4-(2，4，5-三氟苯基)-丁酸甲酯转氨化为(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯，但是并没有公开具体转氨酶的序列以及克隆方法。

近年来，由于不对称合成法具有高选择性及对环境友好的优势，逐步成为合成手性医药化学品及其中间体的首选方案。ω-转氨酶是生产西他列汀的关键酶，许多ω-转氨酶基因已在不同的宿主(大肠杆菌、毕赤酵母等)中表达，获得了酶活和选择性都较高的基因工程菌。尽管如此，仍然存一些ω-转氨酶对特定的底物酶活力不高、转化率较低的问题尤其是当底物中含有如苯环等大的基团。

发明内容

本发明提供了一种ω-转氨酶突变体及其在制备西他列汀中间体中的应用，尤其涉及是在制备西他列汀中间体1-哌啶-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-二丁酮中的应用，该突变体不仅具有较高的酶活，而且能够高效催化西他列汀中间体前体酮1-哌啶-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-二丁酮合成西他列汀中间体(R)-3-氨基-1-哌啶-4-(2,4,5-三氟苯基)-1-丁酮，转化率高达85％。

具体技术方案如下：

ω-转氨酶突变体，所述ω-转氨酶突变体由SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第56位或第134位进行单突变获得；

其中，第56位的苯丙氨酸突变成缬氨酸、组氨酸或酪氨酸；第134位的苏氨酸突变成甘氨酸。

SEQ ID No.2所示氨基酸序列的为来自卡明斯节杆菌(Arthrobacter cumminsii)的野生型ω-转氨酶的氨基酸序列，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明通过分子对接和同源建模等方式获得一些可能影响其催化活性的位点，这些位点分布在活性口袋附近、PLP结合区域以及远离活性中心的一些位点上，本发明从中选出了合适的位点，并对其进行了定点突变，最终得到了具有高ω-转氨酶活力的突变体。

本发明还提供了一种所述ω-转氨酶突变体的编码基因。

上述ω-转氨酶突变体由SEQ ID No.2所示氨基酸序列第56位的苯丙氨酸(密码子为TTC)突变为缬氨酸(密码子为GTC)、组氨酸(密码子为CAC)、酪氨酸(密码子为GAC)；或者，由第134位的苏氨酸(密码子为ACT)突变为甘氨酸(密码子为GGT)。

本发明还提供了一种包含所述编码基因的重组载体。

本发明还提供了一种包含所述编码基因的基因工程菌。

本发明还提供了所述的ω-转氨酶突变体在生物催化西他列汀中间体前体酮1-哌啶-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-二丁酮合成西他列汀中间体(R)-3-氨基-1-哌啶-4-(2,4,5-三氟苯基)-1-丁酮中的应用。

本发明还提供了所述的基因工程菌在催化西他列汀中间体前体酮1-哌啶-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-二丁酮合成西他列汀中间体(R)-3-氨基-1-哌啶-4-(2,4,5-三氟苯基)-1-丁酮中的应用。

本发明还提供了一种生物催化西他列汀中间体前体酮1-哌啶-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-二丁酮合成西他列汀中间体(R)-3-氨基-1-哌啶-4-(2,4,5-三氟苯基)-1-丁酮的方法，包括：以1-哌啶-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-二丁酮为底物，权利要求1所述ω-转氨酶突变体或权利要求4所述基因工程菌为生物催化剂，异丙胺为氨基供体，磷酸吡哆醛为辅酶，在缓冲溶液中进行生物催化合成反应，得到(R)-3-氨基-1-哌啶-4-(2,4,5-三氟苯基)-1-丁酮。

进一步地，反应体系中，反应温度为40～45℃，搅拌速度为500-600rpm，反应时间为40～50h。

进一步地，以反应体系中缓冲液的总体积计，所述底物的终浓度为2-50g/L，所述氨基供体的终浓度为25-95g/L，所述辅酶的终浓度为0.3-0.5g/L，所述生物催化剂的添加量为10-50g/L。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明通过分子对接和同源建模等方式，在336个氨基酸(1008个DNA碱基中)中通过大量计算分析，获得一些可能影响其催化活性的位点，对其进行了定点突变，最终得到的ω-转氨酶突变体不仅具有较高的酶活(酶活均高于245U/g，至少是野生型的2倍)，而且能够高效催化西他列汀中间体前体酮1-哌啶-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-二丁酮合成西他列汀中间体(R)-3-氨基-1-哌啶-4-(2,4,5-三氟苯基)-1-丁酮：突变体T134G在反应24h转化率就可以达到80％，反应36h转化率高达85％；比较野生型酶不仅反应时间缩短了一半转化率就可以达到80％，而且总体转化率也得到了较大提高。

附图说明

图1为本发明利用ω-转氨酶催化西他列汀中间体前体酮1-哌啶-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-二丁酮合成西他列汀中间体(R)-3-氨基-1-哌啶-4-(2,4,5-三氟苯基)-1-丁酮的反应方程式示意图。

图2为实施例2中转氨酶纯化后的SDS-PAGE图；

其中，泳道1为蛋白质分子量Marker，泳道2为纯化后的转氨酶AbTA。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。

实施例1转氨酶AbTA突变体的构建与筛选

1、突变体构建

根据Genbank收录的来自卡明斯节杆菌(Arthrobacter cumminsii)的亲本转氨酶基序列(序列为SEQ ID NO.2所示，核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示)进行同源建模和分子对接等，在336个氨基酸(6720种可能的突变类型)中通过大量计算分析选择了第56位、134位引入单突变，设计定点突变的突变引物，利用快速PCR技术，以重组载体pETDuet/AbTA为模板，引物为：

引物1：F56D Pr CGCATTTCCATCGACGACCAGGGCTTTTAT

F56D Pf AAAGCCCTGGTCGGTCATGGAAATGCGCGC

引物2：F56H Pr CGCATTTCCATCCACGACCAGGGCTTTTAT

F56H Pf AAAGCCCTGGTCGGTGATGGAAATGCGCGC

引物3：F56V Pr CGCATTTCCATCGTCGACCAGGGCTTTTAT

F56V Pf AAAGCCCTGGTCGGACATGGAAATGCGCGC

引物4：T134G Pr GGTTACTCTTCTGGTCCGTTCACCCGTGAT

T134G Pf ACGGGTGAACGGACCAGAAGAGTAACCACG

PCR反应体系(总体积50μL)：2×Phanta Max Buffer(含Mg2+)25μL，10mM dNTPmixture(dATP、dCTP、dGTP和dTTP各2.5mM)1μL，正向引物1μL，反向引物1μL，模板DNA 1μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1μL，加入无核酸水至50μL。

PCR反应条件：预变性95℃5min，95℃变性20s，65℃退火20s，72℃延伸5.5min，共30个循环，最后72℃延伸10min。

取5μL的将PCR产物转入大肠杆菌BL21(DE3)的感受态细胞中，转化条件42℃，热击90秒，迅速置于冰上冷却2min，向管中加入600μL的LB液体培养基，37℃，200r/min培养60min，12000rpm离心1min，弃去600μL上清液，将剩下的100μL菌液充分混匀后涂于氨苄青霉素LB抗性平板，待菌液完全被培养基吸收后，37℃倒置培养12h。

在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB抗性平板上挑取单克隆3-6个，送杭州擎科测序公司进行序列检测，利用软件分析测序结果，结果表明：经以上引物扩增到的核苷酸序列长度为1008bp，该序列编码一个完整的开放阅读框。

2、突变体的序列测定及诱导表达

将含有完整开放阅读框的ω-转氨酶突变体按照上述第1部分获得湿菌体的方式进行培养，获得的湿菌体可直接作为生物催化剂用于后续的酶活测定或者用于蛋白纯化。

湿菌体(即：基因工程菌)的制备方法为：将含有ω-转氨酶突变体编码基因的重组大肠杆菌接种至含有50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃，200rpm下培养8-10h，获得种子液；再将种子液以体积浓度1-2％接种量接种至新鲜的含有50μg/ml氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，150rpm下培养至菌体OD₆₀₀达0.6-0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃下诱导培养12h后，4℃、8000rpm离心10min，弃去上清液，收集湿菌体；所述LB培养基组成：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L，溶剂为蒸馏水，pH值自然。

3、AbTA突变体的酶活测定

得到含有突变蛋白的大肠杆菌后，对25g/L终浓度西他列汀中间体前体酮进行生物转化进行筛选，催化体系(10ml)终浓度组成及催化条件如下：三乙醇胺15g/L，pH 8.5-9.0三乙醇胺缓冲液，25g/L底物西他列汀中间体前体酮1-哌啶-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-二丁酮，DMSO终浓度为50％(v/v)，磷酸吡哆醛0.5g/L，异丙胺40g/L。

反应条件：温度45℃、搅拌速度600r/min，反应时间2h。同样条件下，以未突变湿菌体加入的反应液作为空白对照。反应结束后，取样进行HPLC检测。

HPLC检测条件为：流动相A：10mM乙酸铵；流动相B：纯乙腈；按照流动相A：流动相B＝1:1；流速：1ml/min；检测波长：205nm，从检测结果中获得了几个优良的突变体，部分优良突变体酶活如表1所示。

以下突变体分别是将SEQ ID NO：2所示第134位的苏氨酸取代为甘氨酸，或者，第56位的苯丙氨酸取代为缬氨酸、组氨酸或酪氨酸。

	底物终浓度	酶活(U/g)
			野生型	25g/L	110
突变体T134G	25g/L	377
			突变体F56V	25g/L	301
突变体F56H	25g/L	310
			突变体F56D	25g/L	315

实施例2转氨酶(AbTA)的分离纯化

将实施例1中获得的湿菌体结合三乙醇胺缓冲液(0.015g/mL，pH 9.0)重悬后，经超声破碎(冰浴条件下，70％功率破碎15min，工作1s暂停1s)，8000rpm离心10min，上清与经上述结合液平衡过的Ni亲和层析树脂孵育后，再用冲洗缓冲液(50mM，pH8.0磷酸钠缓冲液，含300mM NaCl，50mM咪唑)冲洗至基本无杂蛋白，随后以洗脱缓冲液(50mM，pH 8.0磷酸钠缓冲液，含300mM NaCl，500mM咪唑)洗脱并收集目的蛋白，电泳鉴定纯度后合并目的蛋白并以透析缓冲液(0.015g/mL，pH 9.0乙醇胺缓冲液)透析10h(透析袋分子截留量14KD)。

采用考马斯亮蓝法测定蛋白含量为2.2mg/mL，将酶液用50mM，pH 9.0磷酸钠缓冲液稀释至终浓度为0.5mg/mL分装，冻存于-80℃(转氨酶AbTA纯化后的蛋白电泳图见附图2)。

实施例3野生型转氨酶AbTA在制备西他列汀中间体(R)-3-氨基-1-哌啶-4-(2,4,5-三氟苯基)-1-丁酮中的应用

以实施例1方法获得的含有表达重组质粒的重组大肠杆菌BL21/pETDuet-AbTA湿菌体或通过实施例2的方法得到AbTA纯酶作为生物催化剂，以西他列汀中间体前体酮[1-哌啶-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-二丁酮]为底物，进行生物催化反应合成西他列汀中间体(R)-3-氨基-1-哌啶-4-(2,4,5-三氟苯基)-1-丁酮。

催化体系(100ml)终浓度组成及催化条件如下：湿菌体0.75g，pH 8-8.5三乙醇胺缓冲液，底物西他列汀前体酮50g/L，DMSO终浓度为20％(v/v)，磷酸吡哆醛2mmol/L，异丙胺80g/L。

反应条件：温度45℃、搅拌速度300r/min，反应时间48h。同样条件下，以无菌体加入的反应液作为空白对照，以大肠杆菌BL21/pETDuet湿菌体代替上述重组大肠杆菌BL21/pETDuet-AbTA作为阴性对照。反应结束后，取样进行HPLC检测(条件同实施例1)，反应体系的底物48h的转化率为50％，ee>99％。

实施例4转氨酶AbTA突变体(T134G)在制备西他列汀中间体中(R)-3-氨基-1-哌啶-4-(2,4,5-三氟苯基)-1-丁酮的应用

以实施例1方法获得的酶活力最高的转氨酶突变体，我们将其命名为突变体1。将突变体1进行诱导表达后获得的重组大肠杆菌BL21/pETDuet-AbTA湿菌体或通过实施例2的方法得到AbTA纯酶作为生物催化剂，以西他列汀中间体前体酮[1-哌啶-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-二丁酮]为底物，进行生物催化反应合成西他列汀中间体(R)-3-氨基-1-哌啶-4-(2,4,5-三氟苯基)-1-丁酮。

催化体系(100ml)终浓度组成及催化条件如下：湿菌体5g，pH 8-8.5三乙醇胺缓冲液，底物西他列汀前体酮50g/L，DMSO终浓度为20％(v/v)，磷酸吡哆醛2mmol/L，异丙胺80g/L。反应条件：温度45℃、搅拌速度300r/min，反应时间36h。同样条件下，以无菌体加入的反应液作为空白对照，以大肠杆菌BL21/pETDuet湿菌体代替上述重组大肠杆菌BL21/pETDuet-AbTA作为阴性对照。反应结束后，取样进行HPLC检测(条件同实施例1)，反应体系的底物36h的转化率为85％，ee>99％。

采用本实施例的方法对另外三个突变体进行转化率测定实验，反应36h后经HPLC检测结果如下：

	底物终浓度	转化率
			突变体F56V	50g/L	80％
突变体F56H	50g/L	81％
			突变体F56D	50g/L	83％

。

序列表

<110> 浙江工业大学

浙江永太科技股份有限公司

浙江永太药业有限公司

<120> ω-转氨酶突变体及其在制备西他列汀中间体中的应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1008

<212> DNA

<213> 卡明斯节杆菌(Arthrobacter cumminsii)

<400> 1

atggctttta gcgctgatac tccggaaatc gtttacactc atgataccgg tctggactac 60

atcacctact ccgatcacga actggacccg gcgaaccctc tggctggcgg cgctgcgtgg 120

attgaaggtg cgttcgtacc gccgtctgaa gcgcgcattt ccatcttcga ccagggcttt 180

tatacttccg atgcgactta caccaccttc catgtttgga acggcaacgc tttccgcctg 240

ggcgatcata tcgagcgtct gttctctaac gcagagtcta tccgtctgat tccaccgctg 300

acccaggatg aagtaaaaga aatcgcgctg gaactggtgg cgaaaaccga gctgcgtgaa 360

gcgatggtaa ctgttaccat cactcgtggt tactcttcta ctccgttcac ccgtgatatc 420

accaaacatc gtcctcaggt gtacatgtct gcatgtccgt accagtggat cgttcctttc 480

gatcgtattc gtgacggcgt tcacctgatg gtcgcccaga gcgtgcgtcg ttctccgcgc 540

tccagcatcg acccgcaagt gaaaaacttc cagtggggtg atctgattcg tgctatccag 600

gaaacccacg accgcggctt cgaactgcct ctgctgctgg attgcgataa cctgctggcg 660

gaaggtccgg gtttcaacgt agtagtgatt aaagacggtg ttgtgcgttc tcctggtcgc 720

gctgcgctgc cgggtatcac ccgtaaaacg gttctggaaa ttgcagaatc cctgggccat 780

gaagcaatcc tggccgacat tacgccggct gaactgtacg atgctgacga agtactgggt 840

tgctccacgg gcggcggcgt ctggccgttt gtgtctgttg atggcaatag catctctgac 900

ggtgtaccgg gcccagttac ccagtccatt attcgtcgtt actgggagct gaacgtagaa 960

ccgagcagcc tgctgacgcc tgtgcactac catcatcatc atcaccat 1008

<210> 2

<211> 336

<212> PRT

<213> 卡明斯节杆菌(Arthrobacter cumminsii)

<400> 2

Met Ala Phe Ser Ala Asp Thr Pro Glu Ile Val Tyr Thr His Asp Thr

1 5 10 15

Gly Leu Asp Tyr Ile Thr Tyr Ser Asp His Glu Leu Asp Pro Ala Asn

20 25 30

Pro Leu Ala Gly Gly Ala Ala Trp Ile Glu Gly Ala Phe Val Pro Pro

35 40 45

Ser Glu Ala Arg Ile Ser Ile Phe Asp Gln Gly Phe Tyr Thr Ser Asp

50 55 60

Ala Thr Tyr Thr Thr Phe His Val Trp Asn Gly Asn Ala Phe Arg Leu

65 70 75 80

Gly Asp His Ile Glu Arg Leu Phe Ser Asn Ala Glu Ser Ile Arg Leu

85 90 95

Ile Pro Pro Leu Thr Gln Asp Glu Val Lys Glu Ile Ala Leu Glu Leu

100 105 110

Val Ala Lys Thr Glu Leu Arg Glu Ala Met Val Thr Val Thr Ile Thr

115 120 125

Arg Gly Tyr Ser Ser Thr Pro Phe Thr Arg Asp Ile Thr Lys His Arg

130 135 140

Pro Gln Val Tyr Met Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Trp Ile Val Pro Phe

145 150 155 160

Asp Arg Ile Arg Asp Gly Val His Leu Met Val Ala Gln Ser Val Arg

165 170 175

Arg Ser Pro Arg Ser Ser Ile Asp Pro Gln Val Lys Asn Phe Gln Trp

180 185 190

Gly Asp Leu Ile Arg Ala Ile Gln Glu Thr His Asp Arg Gly Phe Glu

195 200 205

Leu Pro Leu Leu Leu Asp Cys Asp Asn Leu Leu Ala Glu Gly Pro Gly

210 215 220

Phe Asn Val Val Val Ile Lys Asp Gly Val Val Arg Ser Pro Gly Arg

225 230 235 240

Ala Ala Leu Pro Gly Ile Thr Arg Lys Thr Val Leu Glu Ile Ala Glu

245 250 255

Ser Leu Gly His Glu Ala Ile Leu Ala Asp Ile Thr Pro Ala Glu Leu

260 265 270

Tyr Asp Ala Asp Glu Val Leu Gly Cys Ser Thr Gly Gly Gly Val Trp

275 280 285

Pro Phe Val Ser Val Asp Gly Asn Ser Ile Ser Asp Gly Val Pro Gly

290 295 300

Pro Val Thr Gln Ser Ile Ile Arg Arg Tyr Trp Glu Leu Asn Val Glu

305 310 315 320

Pro Ser Ser Leu Leu Thr Pro Val His Tyr His His His His His His

325 330 335

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgcatttcca tcgacgacca gggcttttat 30

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaagccctgg tcggtcatgg aaatgcgcgc 30

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgcatttcca tccacgacca gggcttttat 30

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aaagccctgg tcggtgatgg aaatgcgcgc 30

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgcatttcca tcgtcgacca gggcttttat 30

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aaagccctgg tcggacatgg aaatgcgcgc 30

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggttactctt ctggtccgtt cacccgtgat 30

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

acgggtgaac ggaccagaag agtaaccacg 30