阅读说明：本技术 抗衰老物质的筛选方法 (Screening method of anti-aging substance ) 是由 江连智畅 丰田美乡 于 2018-07-17 设计创作，主要内容包括：课题在于开发抗衰老物质的筛选方法。发现了衰老细胞分泌的真皮衰老因子通过与正常细胞作用,降低真皮成分生成、促进真皮成分的分解的现象,从而开发出以真皮衰老因子为指标来筛选抗衰老物质的方法。(The object is to develop a method for screening an anti-aging substance. The inventors have found that a dermal senescence factor secreted from senescent cells acts on normal cells to reduce the production of dermal components and promote the decomposition of dermal components, and developed a method for screening an anti-aging substance using the dermal senescence factor as an index.)

抗衰老物质的筛选方法

技术领域

本发明涉及以真皮衰老因子的表达为指标的抗衰老物质的筛选方法。

背景技术

与年龄增加相伴的各种各样的衰老现象是不可避的问题，从而以抑制衰老进行或改善衰老为目的，科学地分析衰老的研究发展起来。对于美容上关注最高的皮肤衰老的原因，宏观上来看年龄增加是重要的因素，除此之外，由干燥、氧化、紫外线等带来的影响也作为与皮肤衰老相关的直接因素被列举。作为皮肤衰老的外观现象，可以举出皮肤的皱纹(深纹和细纹)、松弛、斑、暗沉、纹理的恶化等，作为其原因，可以举出胶原的减少、胶原交联反应、以透明质酸为代表的粘多糖类的减少、黑色素的增加、表皮新陈代谢的降低。这些原因主要分成真皮性原因和表皮性原因，需要各自应对。针对真皮性原因，已阐明促进透明质酸的生成、抑制基质金属蛋白酶(MMP)的生成或活性、促进胶原的生成、阻碍酯酶活性的作用对于真皮的抗衰老是有效的。作为这样的抗衰老研究，已实行将表皮或真皮层的细胞激活，最近还研究了利用将干细胞、特别是成体干细胞激活的皮肤抗衰老的技术。

干细胞定义为具有自我复制能力和分化成其它种类的细胞的分化能力的细胞。作为干细胞，已知存在如胚胎干细胞(ES细胞)、诱导性多功能干细胞(iPS细胞)这样具有能够分化成形成完整个体的全部系统的细胞种类的分化万能性的干细胞，以及在成人体内的各组织中存在虽然没有分化万能性但具有能够分化成多个系统的分化多能性的成体干细胞。已知成体干细胞有助于组织损伤时的组织修复、组织恒定性的维持、衰老。已知成体干细胞在各种各样的组织中存在，作为存在于皮肤组织中的干细胞，已知存在于表皮层的表皮干细胞、和存在于真皮层和皮下脂肪层的间充质干细胞等。

众所周知对表皮而言，表皮干细胞存在于表皮基底层，还有报道在毛囊的被称为隆突部的区域中存在毛囊上皮干细胞、皮肤色素干细胞。另一方面，有报道在真皮中，存在分化成脂肪、胶质、软骨、肌肉等多种细胞系的皮肤源性前体细胞(skin-derivedprecursors:SKP)(非专利文献1：Wong CE et al.,J Cell Biol.175:1005-1015,2006)，进一步分离到被称为真皮间充质干细胞的细胞(专利文献1：WO2011/034106)。

已知间充质干细胞在皮肤受到外伤时被导引到外伤部位。可认为被导引到外伤部位的间充质干细胞将周围的皮肤细胞激活促进细胞增殖，同时自身也分化成皮肤细胞堵住外伤，从而对治疗有贡献，某种黄酮类化合物显示出具有间充质干细胞的导引作用(非专利文献2：PLOS ONE DOI:10.137/journal.pone.0144166)。认为参与皮肤损伤的治愈的间充质干细胞是介由血管运输而来的来自骨髓的间充质干细胞、以及存在于皮下组织的脂肪干细胞、已存在于皮脂腺、汗腺、毛囊等器官周围或血管附近的真皮间充质干细胞。作为间充质干细胞，以往来自骨髓的干细胞成为主要研究对象，但当由脂肪组织分离出脂肪干细胞时，由于其易于获得性、和具有能够分化成各种细胞系的多份化能力，因此可期待在各种各样的再生治疗中应用(非专利文献3：World J Stem Cells 2014January 26；6(1):65-68)。真皮间充质干细胞存在于血管附近，但对于其分化能力、性质未知方面尚多，对于其应用可期待今后的研究。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2011/034106号

专利文献2：日本特表2013-507956号公报

非专利文献

非专利文献1：J Cell Biol.175:1005-1015,2006

非专利文献2：PLOS ONE DOI:10.137/journal.pone.0144166

非专利文献3：World J Stem Cells 2014January 26；6(1):65-68

发明内容

发明所要解决的课题

本发明以开发抗衰老物质的筛选方法为课题。

用于解决课题的手段

本发明者们对于真皮进行了衰老研究，结果令人惊奇地发现衰老细胞分泌的因子(以下记作真皮衰老因子)通过与正常细胞作用而降低真皮成分生成、促进真皮成分的分解的现象。本发明者们基于该看法，通过以真皮衰老因子为指标，从而开发出筛选抗衰老物质的方法。更具体而言，本发明涉及以下[1]～[17]。

[1]一种抗衰老物质的筛选方法，其以真皮衰老因子的表达为指标。

[2]根据项目1所述的筛选方法，其中，包括以下工序：

在含有候选药物的培养基中培养包含真皮成纤维细胞的皮肤细胞培养物的工序，

测定培养物中真皮衰老因子的表达的工序，

选择能够抑制真皮衰老因子表达的候选药物的工序。

[3]根据项目2所述的筛选方法，其中，皮肤细胞培养物进一步包含干细胞。

[4]根据项目1～3中任一项所述的筛选方法，其中，真皮衰老因子的表达通过测定真皮衰老因子的基因表达或蛋白质的量而进行。

[5]根据项目1～4中任一项所述的筛选方法，其中，真皮衰老因子是IGFBP7、CFD、或RSPO4。

[6]一种真皮衰老因子的表达抑制剂，其含有姜黄提取物或野蔷薇果提取物。

[7]根据项目6所述的真皮衰老因子的表达抑制剂，其中，真皮衰老因子是CFD。

[8]一种姜黄提取物或野蔷薇果提取物，其用于介由抑制真皮衰老因子的表达而在治疗皱纹、松弛、或肌肤衰老中使用。

[9]一种用于改善皱纹、松弛、或肌肤衰老的美容或非治疗方法，该方法中，施与含有姜黄提取物或野蔷薇果提取物的组合物。

[10]根据项目9所述的方法，其中，介由抑制真皮衰老因子的表达而改善皱纹、松弛、或肌肤衰老。

[12]根据项目9或10所述的方法，其中，针对患有皱纹、松弛、或肌肤衰老的对象施与。

[13]一种姜黄提取物或者野蔷薇果提取物的使用，其用于制造真皮衰老因子的表达抑制剂。

[14]一种皮肤改善方法，其包括对患有皱纹、松弛、或肌肤衰老的对象，施与含有姜黄提取物或野蔷薇果提取物的组合物。

[15]一种用于改善皱纹、松弛、或肌肤衰老的美容或非治疗方法，其特征在于，抑制真皮衰老因子的表达。

[16]根据项目15所述的美容或者非治疗方法，其中，所述真皮衰老因子是IGFBP7、CFD、或RSPO4。

[17]根据项目16所述的美容或者非治疗方法，其中，包括为了抑制真皮衰老因子的表达，而施与姜黄提取物或者野蔷薇果提取物。

发明的效果

本发明的筛选方法能够以真皮衰老因子为指标筛选抗衰老物质。通过阐明介由真皮衰老因子的衰老这个新的衰老机制、以这样的因子为指标，由此能够获取不能由以往的筛选方法筛选到的物质作为抗衰老物质。

附图说明

图1：图1(A)表示Transwell系统的示意图，在上层培养通常(年轻)成纤维细胞，在下层培养衰老成纤维细胞。图1(B)～(D)是表示(B)胶原1A1(COL1A1)、(C)弹性蛋白(ELN)、以及(D)基质金属蛋白酶1(MMP1)，在未在下层培养细胞的情况下(空白)、与在下层培养衰老成纤维细胞的情况下(+衰老)基因表达量的比较的图。

图2：图2是表示在Transwell系统下层的衰老成纤维细胞中抑制了CFD的基因表达的情况下(A)，上层成纤维细胞中的MMP1基因表达的变化的图(B)。

图3：图3是表示衰老因子(A)IGFBP7、(B)RSPO4、和(C)CFD的基因表达量在衰老成纤维细胞与通常(年轻)成纤维细胞之间的比较的图。

图4：图4是表示在添加了IGFBP7和RSPO4的情况下，(A)MMP1基因用量依赖性地表达增加、和(B)胶原1基因表达降低的图。

图5：图5是表示在衰老成纤维细胞与间充质干细胞的共培养体系中，由于存在间充质干细胞而使衰老因子(IGFBP7)的表达降低的图。

图6：图6是表示在对衰老成纤维细胞的培养物添加姜黄提取物或野蔷薇果提取物进行培养的情况下，作为衰老因子的RSPO4的表达相对于对照降低的图。

具体实施方式

本发明涉及以真皮衰老因子的表达为指标的抗衰老物质的筛选方法。更具体而言，该筛选方法包括以下工序：

在含有候选药物的培养基中培养包含真皮成纤维细胞的皮肤细胞培养物的工序，

测定培养物中真皮衰老因子的表达的工序，

选择能够抑制真皮衰老因子表达的候选药物的工序。

本发明的筛选方法可以在含有候选药物的培养基中培养包含真皮成纤维细胞的皮肤细胞培养物的培养工序之前，进一步包括在未添加候选药物的培养基中，培养包含真皮成纤维细胞的皮肤细胞培养物的预培养工序。预培养可以在任意时间进行，通常可以进行直到皮肤细胞培养物接种后达到亚汇合或汇合。在含有候选药物的培养基中培养包含真皮成纤维细胞的皮肤细胞培养物的工序可以通过对预培养工序的培养基添加候选药物、或者替换成含有候选药物的培养基来实现。

对于在含有候选药物的培养基中培养包含真皮成纤维细胞的皮肤细胞培养物的培养工序的培养时间，从确保候选药物与细胞作用的时间的观点考虑，为24小时以上，优选3天以上，进一步优选5天以上。可以在含有候选药物的培养基中培养包含真皮成纤维细胞的皮肤细胞培养物的培养工序之后，进一步包括在未添加候选药物的培养基中进一步培养包含真皮成纤维细胞的皮肤细胞培养物的后培养工序。

对于培养基，只要细胞能够生存，则可以是任意溶液，可以使用通常用于培养皮肤细胞培养物的任意培养基。作为一例，使用DMEM、EMEM、RPMI1640等。培养条件使用通常用于培养皮肤细胞培养物的培养条件。作为一例，在5％CO₂、37℃、加湿气氛下进行培养。

所谓真皮衰老因子，是主要由衰老细胞分泌的因子，是指与正常的真皮细胞作用而抑制真皮成分生成、或者促进分解的因子。作为真皮衰老因子，可以举出IGFBP7、CFD、以及RSPO4等作为一例。可以通过以这些因子中的一个或两个、或者全部组合的表达为指标来筛选抗衰老物质。

所谓测定培养物中真皮衰老因子的表达的工序，是指通过任意方法测定培养物中真皮衰老因子的基因表达量或蛋白质的量的工序。衰老因子的表达量可以使用分子生物学方法适当测定。作为一例，在测定蛋白质的量的情况下，可以制作针对各真皮衰老因子的特异性抗体，通过使用蛋白质印迹(Western blot)、ELISA等方法，而测定蛋白质的量。对于真皮衰老因子的基因表达量，可以通过使用下述引物进行RT-PCR来测定，但并不限于这些方法。关于内标，只要是本领域技术人员就能够适当选择。

表1

CFD正向引物	CATCTGGTTGGTCTTTATTGAGC(序列号9)
		CFD反向引物	CATGCTGATCTCGAACTCCTG(序列号10)
IGFBP7正向引物	TCAAAGGACAGAACTCCTGCCTGGTGA(序列号11)
		IGFBP7反向引物	GCTGAAGCCTGTCCTTGGGAATTGGATG(序列号12)
RSP04正向引物	CCAGCAGAGGCTCTTCCTGTTCATCC(序列号13)
		RSP04反向引物	TCCTGGCTGAAGCAGCTCTCACAAG(序列号14)

选择能够抑制真皮衰老因子表达的候选药物的工序是指在真皮衰老因子的表达降低的情况下选择候选药物作为抗衰老因子的工序。作为比较对象，可以在仅在没有添加候选药物的这一点上有所不同的对照组中，测定培养物中真皮衰老因子的表达，与对照组的测定结果相比较。对于对照组的实验可以与本发明的筛选方法同时进行，也可以预先进行对于对照组的实验，仅比较结果。别的方式中，可以将添加候选药物前的真皮衰老因子的表达量与添加后真皮衰老因子的表达量相比较，在真皮衰老因子的表达降低的情况下，选择候选药物作为抗衰老因子。真皮衰老因子的表达比对照组降低即可，也可以具有显著性差异地降低。

皮肤细胞的培养物可以是构成皮肤的任意细胞的培养物。作为构成皮肤的细胞，可列举表皮的角化细胞、真皮的成纤维细胞、以及存在于皮下脂肪层的脂肪细胞、其它细胞例如朗格汉斯细胞、黑色素细胞、梅克尔细胞、组织细胞、肥大细胞、浆细胞、干细胞等，也可以包括构成存在于皮肤的各器官例如皮脂腺、汗腺、毛囊等的细胞。可以将真皮成纤维细胞单独培养，也可以与其它细胞共培养。作为共培养的一个方式，可以对通过将真皮成纤维细胞与表皮细胞共培养而构建成的皮肤三维模型的培养物添加候选药物。进而在别的方式中，也可以使用将真皮成纤维细胞与干细胞共培养的培养物。作为干细胞，可以举出存在于表皮的表皮干细胞、存在于真皮、皮下脂肪组织的间充质干细胞。

真皮成纤维细胞是属于间充质的细胞，是生成胶原纤维、弹性纤维、粘多糖的细胞。成纤维细胞***速度较快，通过反复传代可以获得衰老的成纤维细胞。

所谓间充质干细胞，通常是指来自被分类成间充质的任意组织的干细胞。作为被分类成间充质的组织，可以举出骨髓、胎盘、脂肪组织、真皮等，作为来自这些组织的干细胞的例子，可以举出来自骨髓的间充质干细胞(以下简称为骨髓干细胞)、来自胎盘的间充质干细胞、来自脂肪组织的间充质干细胞(以下简称为脂肪干细胞)、来自牙髓的间充质干细胞、来自脐带血的间充质干细胞、来自真皮的间充质干细胞(以下简称为真皮干细胞)等，一部分毛***细胞也被认为是间充质干细胞。

来自骨髓的间充质干细胞是存在于骨髓的干细胞。骨髓干细胞具有向心肌细胞、骨骼肌细胞、血管内皮细胞、软骨细胞、骨细胞、脂肪细胞这些多样的组织的分化能力。来自骨髓的间充质干细胞具有以CD105、CD73、CD90作为阳性标志物的特征，但不限于表达这些标志物的细胞。认为骨髓间充质干细胞根据组织损伤等信号释放到血液中，从而实现对创伤部位的治疗功能。

所谓来自脂肪组织的间充质干细胞，也可以简称为脂肪干细胞，是存在于脂肪组织中的一种间充质干细胞。已知脂肪干细胞具有游走能力(非专利文献3和专利文献2)，认为其能够在脂肪组织中移动。脂肪干细胞具有表达CD90标志物、CD105标志物等附带特征，但不限于表达这些标志物的细胞。

所谓来自真皮的间充质干细胞，也可以简称为真皮干细胞，是存在于真皮的干细胞。真皮干细胞介由分化成成纤维细胞、或激活成纤维细胞来补充成纤维细胞，从而有助于维持真皮层的恒定性。真皮间充质干细胞在真皮层中主要以周细胞样细胞团的形式存在于微血管部位、或皮脂腺、汗腺、毛囊等器官的周围。认为在皮肤损伤时激活，分化成成纤维细胞、肌成纤维细胞，从而有助于皮肤的再生和修复。真皮干细胞具有CD34和NG2双重阳性的特征，但不限于表达这些标志物的细胞。由于在真皮干细胞所存在的各器官周围遍布毛细血管，因此认为真皮干细胞通过血管而补充。所以真皮干细胞可以具有与骨髓间充质干细胞近似的性质。

由于必须在添加候选药物前生成衰老因子，因此优选使用的细胞是衰老的细胞。作为衰老的细胞，优选使用进行一定时间、例如3个月以上传代培养、增殖变慢的细胞(例如倍增时间少于0.5/周，Pdl＞50)。此外，也可以通过从老人获取初代细胞来获取衰老的细胞。作为优选的方式，在这样得到的衰老细胞中，优选使用确认表达选自IGFBP7、CFD和RSPO4中的衰老因子的细胞。只要是皮肤含有的细胞，衰老细胞可以是任意细胞，但从选自IGFBP7、CFD、和RSPO4中的衰老因子表达的观点考虑，优选是真皮成纤维细胞。

皮肤细胞培养物仅包含真皮成纤维细胞的情况下，由筛选方法选择的抗衰老物质能够通过与衰老的真皮成纤维细胞直接作用来抑制衰老因子的表达。另一方面，在皮肤细胞培养物是真皮成纤维细胞与其它细胞的共培养物的情况下，由筛选方法选择的抗衰老物质能够通过与衰老的真皮成纤维细胞直接作用、或介由共培养的其它细胞间接地作用来抑制衰老因子的表达。作为间接的作用，认为例如介由共培养的细胞的活性控制衰老因子在衰老真皮成纤维细胞中的表达。示出了间充质干细胞能够通过与真皮成纤维细胞间接地作用抑制衰老因子(IGFBP7)的表达(图5)。

进行共培养的情况下，真皮成纤维细胞与其它细胞可以在相同位置混合接种，也可以层叠培养，还可以在相同培养容器内隔离培养。在相同培养容器内隔离培养的情况下，可以交换培养基，但也可以通过介由阻碍细胞迁移的程度的孔混合培养基，由此一方细胞分泌的因子影响另一方的细胞。1的实施方式中，可以将干细胞与真皮成纤维细胞共培养。这样的干细胞具有分化成真皮成纤维细胞的分化能力，并且能够通过释放某些因子与周围的细胞作用。所以通过使用该共培养体系，可以筛选出能够与干细胞作用来抑制由衰老真皮成纤维细胞带来的衰老因子生成的抗衰老物质。

所以，根据本发明的筛选方法选择的抗衰老物质是与其使用的体系相应地，可以是直接与衰老细胞作用而抑制衰老因子分泌的抗衰老物质，也可以是通过与其它细胞、例如干细胞作用来间接地抑制衰老因子分泌的抗衰老物质。与衰老细胞直接作用的抗衰老物质也可以称为衰老因子的表达抑制剂。衰老因子抑制真皮成分生成、或促进分解。所以，衰老因子的表达抑制具有使胶原、弹性蛋白等真皮成分增加的作用。所以，抗衰老物质可以以作为真皮成分的增加促进剂、和皱纹或松弛改善剂、抗衰老剂而配合到化妆品、药品中。与干细胞作用而间接地抑制衰老因子分泌的抗衰老物质能够作为干细胞激活剂使用，也可以单独使用，但通过与干细胞治疗合并，或者与干细胞导引剂联合施与，可以进一步发挥所期待的抗衰老作用。

使用多种化妆品原料作为候选药物实行本发明的筛选方法后，能够筛选出姜黄提取物和野蔷薇果提取物作为抗衰老因子表达抑制剂。

姜黄提取物是指原产于印度的姜黄科姜黄属(Curcuma Longa)的多年生草本植物的提取物。作为提取的部位，可以举出全株、叶、花、根，但特别优选根茎。提取方法可以使用任意方法，作为一例，可以通过对干燥后的根进行水蒸气蒸馏、溶剂提取得到提取物。此外作为溶剂，可以使用任意提取溶剂，可以使用50％丁二醇等。

所谓野蔷薇果提取物，是指原产于东亚的野蔷薇(Rosa multiflora)的附果或果实的提取物。提取方法可以使用任意方法，作为一例，可以通过将干燥后的附果或果实进行水蒸气蒸馏或溶剂提取来获得提取物。此外，作为溶剂，可以使用任意提取溶剂，可以使用乙醇水溶液、50％丁二醇等。

作为候选药物，可以使用属于任意库的药物。作为库，可以使用有机化合物库、提取物库、化妆品原料库、药品库等。从将候选药物透皮施与的观点考虑，优选使用已经显示透皮施与的稳定性的化妆品原料作为候选药物。

根据本发明的方法筛选出的抗衰老物质可以配合在任意组合物、例如化妆品、药品、或准药品中。配合了抗衰老物质的化妆品、药品、或准药品用于对皱纹、松弛等肌肤衰老烦恼的对象。这样的对肌肤衰老烦恼的对象也可以称为皮肤中衰老因子表达高的对象。特别是由于在美容领域希望抗衰老，因此优选配合在化妆品中。配合的化妆品的剂型是任意的，可以以液体、凝胶、泡沫、乳液、霜剂、软膏、片剂等形态配合使用。作为配合的化妆品，可以应用于外用药用制剂、化妆水、乳液、霜剂、软膏、洗剂、油、面膜等基础化妆品、洗面奶或皮肤清洁剂、除毛剂、脱毛剂、须后水、须前水、剃须膏、粉底、口红、腮红、眼影、眼线、睫毛膏等彩妆化妆品、洗发水、护发素、头发护理、头发预护理、整发液、烫发剂、头发营养液、染发剂、生发养发剂等发用化妆品、洗浴用剂等各种各样的制品。

在本发明中，IGFBP7、CFD、和RSPO4被确定为衰老因子。因此，通过调查这些因子的表达，能够确定细胞的衰老程度。例如通过测定在作为内标的基因中的表达量，能够确定细胞的衰老程度。也能对从生物体获取的细胞、特别是皮肤细胞确定衰老程度，还能够针对培养细胞确定衰老程度。所以，本发明的又一别的方式中，本发明涉及以衰老因子的表达量为指标的细胞的衰老程度确定方法。

在本说明书中所谈及的全部文献其整体通过引用而援引到本说明书中。

以下说明的本发明的实施例仅以例示为目的，不限定本发明的技术范围。本发明的技术范围仅被权利要求书的记载限定。以不脱离本发明的主旨为条件，可以进行本发明的变更，例如本发明的构成要素的追加、删除和替换。

实施例1：衰老细胞对正常细胞的影响

细胞培养

将由成人(21岁)的背部皮肤建立的真皮成纤维细胞用添加有10％FBS的杜氏改良伊格尔培养基(DMEM，Dulbecco's modified Eagle's medium)培养。作为通常的成纤维细胞(年轻成纤维细胞)，使用培养时间少于1个月、Pdl＜30的细胞。将相同细胞培养3个月以上，使用增殖变慢的细胞(倍增时间少于0.5/周，Pdl＞50)作为衰老成纤维细胞。将通常的成纤维细胞以1250细胞/cm²的密度接种于装满了添加有10％FBS的DMEM的6孔Transwell系统(Falcon；Franklin Lakes,NJ)的上层。将亚汇合状态的衰老成纤维细胞和通常的成纤维细胞分别接种在Transwell系统下层的两个孔中。将Transwell系统的上层和下层组合，在37℃5％CO₂加湿气氛下培养2天后，分别使用Qiazole(Qiagen)回收上层的细胞和下层的细胞。

定量的RT-PCR

根据制品说明书使用RNeasy Protect Kit(Qiagen)从回收的细胞裂解物中提取RNA，然后使用Superscript VILO(Invitrogen)按照产品说明书翻译成cDNA。以28SrRNA为内标，使用针对下述基因的引物对，用LightCycler(销售商)进行实时PCR。结果示于图1。将由Lightcycler software ver.3.5计算的循环阈值(Ct值)对各样品的GAPDHmRNA归一化。

表2

MMP1正向引物	ATTTGCCGACAGAGATGAAGTCC(序列号1)
		MMP1反向引物	GGGTATCCGTGTAGCACATTCTG(序列号2)
ELN正向引物	TGTCCATCCTCCACCCCTCT(序列号3)
		ELN反向引物	CCAGGAACTCCACCAGGAAT(序列号4)
COL1A1正向引物	AGCAGGCAAACCTGGTGAAC(序列号5)
		COL1A1反向引物	AACCTCTCTCGCCTCTTGCT(序列号6)
GAPDH正向引物	GAAGGTGAAGGTCGGAGT(序列号7)
		GAPDH反向引物	GAAGATGGTGATGGGATTTC(序列号8)

如图1(A)所示，将衰老成纤维细胞接种在下层的情况下，与没有将细胞接种在下层的情况相比，MMP1的表达有意义地增加，此外，弹性蛋白和胶原的表达有意义地减少。将通常的成纤维细胞(年轻的成纤维细胞)接种在下层的情况下，与没有将细胞接种在下层的情况相比，没有显示出有意义的变化(数据未标示)。由该结果可以明确通过由衰老细胞分泌某些衰老因子，由此在共用培养基的真皮成纤维细胞中发生基因表达的变化。

在衰老成纤维细胞中表达增加的基因的确定

通过微阵列分析调查基因表达在年轻成纤维细胞与衰老成纤维细胞之间的差异。与年轻成纤维细胞的基因表达量相比较，鉴定出显示2.5倍以上表达量的基因。将下述表中记载的基因作为衰老因子的候选：

表3

这些衰老因子的候选基因中，设计siRNA使其敲减CFD(SI00030100或SI00030107；Qiagen，二者具有同样的阻碍效果)，使用siRNA(SI030640318；Qiagen)作为阴性对照。将siRNA导入衰老成纤维细胞中，按照上述细胞培养法将敲减了CFD基因的细胞接种在Transwell系统的下层，与上层细胞一起进行2天培养。分别获取下层细胞和上层细胞，对下层细胞调查CFD的表达，对上层细胞调查MMP1的基因表达。在将敲减了CFD的衰老成纤维细胞接种在下层的情况下，来自上层细胞的MMP1表达降低。将结果示于图2。由该结果特定出CFD是衰老因子。

衰老因子在衰老细胞中的表达

将由本发明者们确定的衰老因子(CFD)和候选衰老因子(IGFBP7，RSPO4)的表达在衰老成纤维细胞与年轻成纤维细胞中比较。分别培养衰老成纤维细胞和年轻成纤维细胞，使用Qiazole(Qiagen)回收。使用与上述RT-PCR同样的方法对回收的细胞裂解物调查衰老因子的表达。使用下述的引物对。将结果示于图3。显示本发明中特定出的衰老因子和候选衰老因子均在衰老成纤维细胞中表达增高。

表4

CFD正向引物	CATCTGGTTGGTCTTTATTGAGC(序列号9)
		CFD反向引物	CATGCTGATCTCGAACTCCTG(序列号10)
IGFBP7正向引物	TCAAAGGACAGAACTCCTGCCTGGTGA(序列号11)
		IGFBP7反向引物	GCTGAAGGCTGTCCTTGGGAATTGGATG(序列号12)
RSP04正向引物	CCAGCAGAGGCTCTTCCTGTTCATCC(序列号13)
		RSP04反向引物	TCCTGGCTGAAGCAGCTCTCACAAG(序列号14)
GAPDH正向引物	GAAGGTGAAGGTCGGAGT(序列号7)
		GAPDH反引物	GAAGATGGTGATGGGATTTC(序列号8)

衰老因子的添加

在培养年轻成纤维细胞的培养基中以0μg/ml、10μg/ml的浓度添加候选衰老因子(IGFBP7、RSPO4)的蛋白质(Serotec，从R&D SYSTEMS购买)，培养2天后，分别使用Qiazole(Qiagen)回收细胞。与定量的RT-PCR栏中记载的同样地对回收的细胞裂解物调查MMP1和胶原的表达量。将结果示于图4。IGFBP7和RSPO4使胶原的表达降低，此外使MMP1的表达增加。由此显示IGFBP7和RSPO4也作为衰老因子起作用。

实施例2：间充质干细胞带对衰老因子的抑制

细胞培养

以1250细胞/cm²的密度将衰老成纤维细胞接种在装满了添加有10％FBS的DMEM的6孔Transwell系统(Falcon；Franklin Lakes，NJ)的上层。间充质干细胞(MSC)由Lonza购买，用MessenPro培养基培养。将亚汇合状态的MSC接种在Transwell系统下层的孔中。在24小时后将培养基替换成含有10％FBS、250μM抗坏血酸的DMEM，开始共培养。在2天后使用Qiazole(Qiagen)回收细胞。使用与上述RT-PCR同样的方法对回收的细胞裂解物调查衰老因子(IGFBP7)的基因表达。将结果示于图5。作为对照组，在无MSC的条件下单独培养成纤维细胞。MSC存在下IGFBP7的基因表达有意义地减少(学生t检验：P＜0.05)。

实施例3：以衰老因子为指标的筛选方法

以2500细胞/cm²的密度将衰老成纤维细胞接种在24孔板中。在接种24小时后，分别以0.5％的浓度加入作为化妆品原料的下述提取物：野蔷薇果提取物、姜黄提取物。将仅添加了提取物的提取溶剂的组作为对照。在添加提取物24小时后，使用Qiazol(Qiagen)回收细胞。用与定量的RT-PCR栏中记载的相同的方法对回收的细胞裂解物调查RSPO4的表达量。以对照组的RSPO4表达为100表示添加组中的RSPO4表达。将结果示于图6。