阅读说明：本技术 适配体修饰的α-Gal脂质体及其制备方法与应用 (aptamer modified alpha-Gal liposome and preparation method and application thereof ) 是由 裴仁军 洪珊妮 于 2018-05-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种适配体修饰的α-Gal脂质体及其制备方法与应用。所述适配体修饰的α-Gal脂质体包括α-Gal脂质体膜以及适配体,所述适配体采用胆固醇修饰的核酸适配体,所述适配体的胆固醇修饰区域嵌入α-Gal脂质体膜,核酸适配体区域从α-Gal脂质体膜表面露出。所述制备方法包括：将α-Gal脂质体膜与含有胆固醇修饰的核酸适配体的缓冲液进行水合,使得胆固醇修饰的核酸适配体部分嵌入所述α-Gal脂质体膜,形成适配体修饰的α-Gal脂质体。本发明的适配体修饰的α-Gal脂质体生物相容性好,对正常细胞毒性低,适配体的修饰可特异地靶向癌细胞,能够引起自身免疫系统对癌细胞的杀伤。(the invention discloses an aptamer modified alpha-Gal liposome and a preparation method and application thereof. The aptamer-modified alpha-Gal liposome comprises an alpha-Gal liposome membrane and an aptamer, wherein the aptamer adopts a cholesterol-modified nucleic acid aptamer, the cholesterol modification region of the aptamer is embedded into the alpha-Gal liposome membrane, and the nucleic acid aptamer region is exposed from the surface of the alpha-Gal liposome membrane. The preparation method comprises the following steps: hydrating the α -Gal liposome membrane with a buffer comprising a cholesterol-modified aptamer such that the cholesterol-modified aptamer is partially embedded in the α -Gal liposome membrane to form an aptamer-modified α -Gal liposome. The alpha-Gal liposome modified by the aptamer has good biocompatibility and low toxicity to normal cells, and the modification of the aptamer can specifically target cancer cells and can cause the autoimmune system to kill the cancer cells.)

适配体修饰的α-Gal脂质体及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种适配体修饰的α-Gal脂质体及其制备方法，以及基于该适配体修饰的α-Gal脂质体的双特异试剂，以及其应用于制备癌症治疗药物领域的应用。

背景技术

随着肿瘤分子生物学和免疫学的发展，肿瘤靶向治疗和免疫治疗成为癌症治疗的热点。肿瘤靶向治疗具较好的分子特异性、能有效地选择性地杀伤癌细胞，且副作用低。而肿瘤的免疫治疗则具是利用人体自身免疫系统杀伤癌细胞。而肿瘤靶向的免疫治疗能结合二者的优点，特异性地引起自身免疫系统高效杀伤癌细胞。

α-Gal抗原表位(galactose-α-1,3-galactosyl-β-1,4-N-acetyl-glucosamine)，是一种三糖类的抗原，天然产生于糖脂糖蛋白上，普遍存在于各种微生物、非灵长类哺乳动物、有袋动物和新世界猴中，但不存在于人类、猿和旧世界猴。不同的物种α-Gal抗原表位表达的位置也不同。在兔和雌牛的血红细胞膜的糖脂上大量表达，在鼠艾氏腹水癌细胞和淋巴瘤细胞中则大量表达在细胞膜上的糖蛋白，牛科、犬科和猪科动物则表达于甲状腺球蛋白。人体约1％的循环IgG是抗α-Gal的天然抗体。它是由于肠道菌落持续地抗原刺激B细胞产生的。不同的物种α-Gal抗原表位表达的位置也不同。

α-Gal脂质体通常是由兔血红细胞膜提取的纳米载体，主要组分为α-Gal糖脂、磷脂和胆固醇。目前α-Gal脂质体被用于肿瘤免疫治疗中，需直接注射于肿瘤部位，由于α-Gal脂质体能募集抗α-Gal的抗体于脂质体表面，抗原抗体的结合激活补体依赖的细胞毒作用(CDC)以及抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)，诱导巨噬细胞和自然杀伤细胞裂解α-Gal脂质体附近的癌细胞。然而这种脂质体并不能区分正常细胞和癌细胞，极有可能会引起自身免疫疾病。因此发展能特异靶向癌细胞的α-Gal脂质体有望成为肿瘤靶向免疫治疗的新策略。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种适配体修饰的α-Gal脂质体及其制备方法与应用，以克服现有技术中的不足。

为实现上述发明目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明实施例提供了一种适配体修饰的α-Gal脂质体，其包括：α-Gal脂质体膜以及适配体，所述适配体采用胆固醇修饰的核酸适配体，所述适配体的胆固醇修饰区域嵌入α-Gal脂质体膜，核酸适配体区域从所述α-Gal脂质体膜表面露出。

在一些实施例中，所述核酸适配体包括AS1411。

本发明实施例还提供了一种适配体修饰的α-Gal脂质体的制备方法，其包括：

提供α-Gal脂质体膜；

将所述α-Gal脂质体膜与含有胆固醇修饰的核酸适配体的缓冲液进行水合，使得胆固醇修饰的核酸适配体部分嵌入所述α-Gal脂质体膜，形成适配体修饰的α-Gal脂质体。

在一些实施例中，所述制备方法还包括：将所述α-Gal脂质体膜与含有胆固醇修饰的核酸适配体的缓冲液进行水合，之后进行挤压处理，获得粒径均一的适配体修饰的α-Gal脂质体。

本发明实施例还提供了一种双特异试剂，其包含前述的适配体修饰的α-Gal脂质体。

本发明实施例还提供了前述的适配体修饰的α-Gal脂质体或双特异试剂于制备癌症靶向免疫治疗药物中的用途。

进一步地，所述适配体修饰的α-Gal脂质体能够特异性靶向癌细胞激起机体自身免疫系统攻击靶向的癌细胞。

本发明实施例还提供了一种癌症靶向免疫治疗药物，其包含前述的适配体修饰的α-Gal脂质体或双特异试剂。

较之现有技术，本发明的有益效果在于：

本发明提供的适配体修饰的双特异α-Gal脂质体是一种新型肿瘤免疫治疗的双特异试剂。采用胆固醇修饰的核酸适配体作为主要的靶向剂，生物相容性好，对正常细胞毒性低，适配体的修饰可特异地靶向癌细胞，治疗的关键在于脂质体上的α-Gal抗原表位也能因此附于肿瘤细胞上，募集人体内大量存在的anti-Gal抗体至癌细胞表面，抗原抗体结合激活自身免疫系统，诱导巨噬细胞和自然杀伤细胞裂解α-Gal脂质体附近的癌细胞，从而提高了α-Gal脂质体的治疗效果；同时，本发明的制备方法简单，与常规脂质体的区别在于该双特异脂质体主要原材料源于细胞膜，易于获得，制备成本低且过程易于控制。

附图说明

图1是本发明一典型实施方案中的适配体修饰的α-Gal脂质体应用于肿瘤靶向免疫治疗的原理图。

图2是本发明一典型实施方案中的适配体修饰的α-Gal脂质体的结构示意图。

图3是本发明一典型实施方案所获适配体修饰的α-Gal脂质体(Apt-Lip)的TEM形貌图。

图4a是本发明一典型实施方案所获适配体修饰的α-Gal脂质体(Apt-Lip)、无修饰的α-Gal脂质体(Lip)的水合粒径分析图。

图4b是本发明一典型实施方案所获适配体修饰的α-Gal脂质体(Apt-Lip)、无修饰的α-Gal脂质体(Lip)的zeta电位比较图。

图5是本发明一典型实施方案所获适配体修饰的α-Gal脂质体对癌细胞和抗α-Gal抗体的识别对比图。

图6是本发明一典型实施方案所获适配体修饰的α-Gal脂质体在MCF-7细胞中的细胞毒性测定结果示意图。

图7是分别将PBS、α-Gal脂质体和适配体修饰的α-Gal脂质体应用于不同比例的PBMC和MCF-7细胞中细胞裂解比较图。

图8a是抗α-Gal抗体对适配体修饰的α-Gal脂质体引起的细胞裂解的影响示意图。

图8b是本发明适配体修饰的α-Gal脂质体应用于正常细胞和癌细胞裂解比较图。

图9是本发明一典型实施方案所获适配体修饰的α-Gal脂质体应用于全血中的细胞裂解比较图。

具体实施方式

针对现有技术的诸多缺陷，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案，其主要是首先从细胞膜中提取脂质体成分，通过加入含有适配体的缓冲液对脂质体膜进行水合，获得适配体修饰的α-Gal脂质体。如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。但是，应当理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以相互结合，从而构成新的或者优选的技术方方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

作为本发明技术方案的一个方面，其所涉及的系一种适配体修饰的α-Gal脂质体，其包括：α-Gal脂质体膜以及适配体，所述适配体采用胆固醇修饰的核酸适配体，所述适配体的胆固醇修饰区域嵌入α-Gal脂质体膜，核酸适配体区域从所述α-Gal脂质体膜表面露出。

在一些实施例中，所述核酸适配体可优选为AS1411，但不限于此。

在一些实施例中，所述适配体修饰的α-Gal脂质体的粒径相对均一，约为129.1～171.1nm左右，且表面zeta电位会显著降低，如-16.26～-12.14mV左右。

进一步地，所述适配体修饰的α-Gal脂质体中适配体的含量为3.25～4.16wt％。

进一步地，1mg/mL的所述α-Gal脂质体膜上所修饰的适配体的浓度约为294nM。

在一较佳实施方案之中，所述适配体修饰的α-Gal脂质体具有如图2所示的结构。

进一步地，所述α-Gal脂质体膜的主要成分包括α-Gal糖脂、磷脂和胆固醇等。

进一步地，所述适配体修饰的α-Gal脂质体具有双分子层结构。

作为本发明技术方案的另一个方面，其所涉及的系一种适配体修饰的α-Gal脂质体的制备方法，其包括：

提供α-Gal脂质体膜；

将所述α-Gal脂质体膜与含有胆固醇修饰的核酸适配体的缓冲液进行水合，使得胆固醇修饰的核酸适配体部分嵌入所述α-Gal脂质体膜，形成适配体修饰的α-Gal脂质体。

在一些实施例中，所述制备方法还包括：将所述α-Gal脂质体膜与含有胆固醇修饰的核酸适配体的缓冲液进行水合，之后进行挤压处理，获得粒径均一的适配体修饰的α-Gal脂质体。

进一步地，所述挤压处理采用的PC滤膜孔径为200nm。

进一步地，所述挤压处理的次数为30～50次。

进一步地，所述制备方法可具体包括：胆固醇修饰的适配体(包括AS1411)溶于缓冲液中，加至所述α-Gal脂质体膜中进行水合，剧烈振荡使得α-Gal脂质体膜溶解于该缓冲液中，挤压法获得粒径均一的适配体修饰的α-Gal脂质体。最后经超滤去除非特异结合或游离的适配体。

在一较优实施方式中，所述制备方法进一步包括：使用挤压器挤压所述脂质体，获得粒径相对均一的适配体修饰的α-Gal脂质体(如129.1～171.1nm左右)，且适配体修饰后脂质体的表面zeta电位会显著降低(如-16.26～-12.14mV左右)。

在一些实施例中，所述制备方法可包括：使α-Gal糖脂、磷脂、胆固醇和溶剂混合均匀并在室温反应10～16h，之后除去所述溶剂，获得α-Gal脂质体膜。

在一较优实施方式中，从人细胞中获得α-Gal脂质体膜的制备方法进一步包括：以人细胞系为原材料，富集的细胞通过低渗离心获得细胞膜，细胞膜、甲醇和氯仿以1：1：2的体积比混合提取细胞膜中的脂质体膜组分磷脂和胆固醇，加入α-Gal糖脂，充分混匀后，旋转蒸发获得α-Gal脂质体膜。

在另一较优实施方式中，从新鲜兔血中获得α-Gal脂质体膜的制备方法进一步包括：以新鲜兔血为原材料，从新鲜兔血中通过低渗离心法获得兔血红细胞膜，再与甲醇和氯仿混合(1：1：2)，提取获得α-Gal脂质体膜主要成分α-Gal糖脂、磷脂和胆固醇，室温反应时间为10-16h，过滤去除残余红细胞膜和蛋白等，最后经旋转蒸发获得α-Gal脂质体膜。

进一步的，所述细胞膜优选为兔血红细胞膜，但不限于此。

本发明实施例的另一个方面还提供了一种双特异试剂，其包含前述的适配体修饰的α-Gal脂质体。

本发明实施例的另一个方面还提供了前述的适配体修饰的α-Gal脂质体或双特异试剂于制备癌症靶向免疫治疗药物中的用途。

进一步地，所述适配体修饰的α-Gal脂质体能够特异性靶向癌细胞激起机体自身免疫系统攻击靶向的癌细胞，其原理可参见图1。该基于适配体修饰的α-Gal脂质体及双特异试剂采用适配体作为主要的靶向剂，适配体具有良好的生物相容性、生物毒性低、分子特异性高、能选择性地靶向癌细胞。适配体的修饰使得α-Gal脂质体成为双特异试剂，能特异性地靶向癌细胞，并在癌细胞附近富集，引起自身免疫系统裂解癌细胞，从而提高了α-Gal脂质体的治疗效果。经试验发现，该双特异试剂裂解癌细胞的能力明显高于无适配体修饰的α-Gal脂质体。

例如，本发明实施例的另一个方面还提供了一种癌症靶向免疫治疗药物，其包含前述的适配体修饰的α-Gal脂质体或双特异试剂。

藉由上述技术方案，本发明的适配体修饰的α-Gal脂质体采用适配体作为主要的靶向剂，生物相容性好，对正常细胞毒性低，适配体的修饰可特异地靶向癌细胞，能够引起自身免疫系统对癌细胞的杀伤。

下面结合若干优选实施例及附图对本发明的技术方案做进一步详细说明，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。以下实施例中采用的实施条件可以根据实际需要而做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。

实施例1以兔血红细胞作为原材料为例，基于适配体修饰的α-Gal脂质体的制备方法具体步骤如下：

(1)新鲜兔血稀释于1×PBS中，多次离心去除血清和淋巴细胞等，离心速度为3000rpm/min，获得红细胞。

(2)再稀释于0.25×PBS中低渗裂解红细胞，多次离心洗去血红蛋白等，离心速度为13000rpm/min，获得红细胞膜。

(3)红细胞膜、甲醇、氯仿以1：1：2体积混合，室温搅拌10h，过滤去除残留的红细胞膜和蛋白质等，获得提取液为α-Gal脂质体膜组分α-Gal糖脂、磷脂和胆固醇，旋转蒸发去除有机溶剂获得α-Gal脂质体膜。

(4)称取膜重量后，加入含胆固醇修饰的适配体缓冲液至α-Gal脂质体膜中，充分震荡，水合获得适配体修饰的α-Gal脂质体，最终浓度为8mg/mL，对应适配体浓度为8mM。同理，无修饰的α-Gal脂质体则使用缓冲液水合即可。

(5)使用200nm的滤膜与挤压器，对获得的所述脂质体多次挤压，获得粒径均一的适配体修饰的α-Gal脂质体(以下可简称为Apt-Lip)。

(6)使用100KDa的超滤管对所获得Apt-Lip离心超滤去除多余未修饰上的游离的适配体，最终获得适配体修饰的α-Gal脂质体。

实施例2以人体细胞作为原材料为例，基于适配体修饰的α-Gal脂质体的制备方法具体步骤如下：

(1)富集细胞，稀释于1×PBS中，多次离心洗去培养基，离心速度为3000rpm/min，获得细胞。

(2)再稀释于0.25×PBS中低渗裂解细胞，多次离心清洗，离心速度为13000rpm/min，获得细胞膜。

(3)细胞膜、甲醇、氯仿以1：1：2体积混合，室温搅拌10h，过滤去除残留的细胞膜和蛋白质等，获得提取液为磷脂和胆固醇，加入α-Gal糖脂充分搅拌混匀，旋转蒸发去除有机溶剂获得嵌入α-Gal糖脂的α-Gal脂质体膜。

(4)称取膜重量后，加入含胆固醇修饰的适配体缓冲液至α-Gal脂质体膜中，充分震荡，水合获得适配体修饰的α-Gal脂质体，最终浓度为8mg/mL，对应适配体浓度为8mM。同理，无修饰的α-Gal脂质体(Lip)则使用缓冲液水合即可。

(5)使用200nm的滤膜与挤压器，对获得的所述脂质体多次挤压，获得粒径均一的适配体修饰的α-Gal脂质体(Apt-Lip)。

(6)使用100KDa的超滤管对所获得Apt-Lip离心超滤去除多余未修饰上的游离的适配体，最终获得适配体修饰的α-Gal脂质体。

对本发明一典型案例所获适配体修饰的α-Gal脂质体进行测试，结果如下：

一、经测定，适配体修饰的α-Gal脂质体(Apt-Lip)的TEM形貌图，如图3所示。

二、经测定，Apt-Lip和Lip的水合粒径如图4a所示，zeta电位如图4b所示。本次的测试使用了马尔文粒度仪进行粒度分析，得到的粒径为Apt-Lip的粒径为181.9±0.178nm，而没有连适配体的Lip粒径为191.4±0.123nm。两者的粒径比较接近。由于DNA带负电，连有适配体的脂质体Apt-Lip电势(-14.2±2.06mV)比Lip的电势(-6.56±0.8mV)更低，这表明脂质体已成功修饰适配体。

三、适配体修饰的α-Gal脂质体对癌细胞和抗α-Gal抗体的识别检测。

MCF-7细胞(人乳腺癌细胞系)经胰酶消化成悬浮细胞，并在稀释成5×10⁵个细胞至1.5mL的离心管中，分别加入1mg/mL的Apt-Lip、Lip和PBS，使用离心管旋转培养器于37℃中培养1h后，冰1×PBS离心2次，洗去与MCF-7细胞非特异性吸附的脂质体。人IgG以10μg/mL稀释于冰1×PBS中，于4℃与细胞孵育1h后，加入含10μg/mLFITC修饰的抗IgG抗体的冰1×PBS，继续于4℃与细胞孵育1h，最终使用流式细胞分析仪检测FL-1的荧光强度，分析所结合上的FITC修饰的抗IgG抗体的荧光。每个实验组和对照组均做4个平行样。本发明的Apt-Lip处理的MCF-7细胞荧光明显高于Lip处理的细胞(图5)，表明本发明的Apt-Lip能特异性地靶向MCF-7细胞，溶液中的IgG更易于结合至癌细胞表面的脂质体。

四、适配体修饰的α-Gal脂质体的细胞毒性检测。

用CCK-8法来测定本发明双特异脂质体在MCF-7细胞中的细胞毒性(图5)。96孔板中以每孔7000细胞的密度种入，置于CO₂培养箱中，37℃培养至细胞密度为60-70％，将不同浓度的脂质体(0.1-4mg/mL)稀释于完全培养基，过滤除菌。然后加入96孔板中，每孔加入100μL，对照组加入100μL完全培养基，继续培养24h。最后将培养基替换为新鲜为培养基，每孔加入10μL CCK-8，培养箱中接着培养2h，使用酶标仪测定450nm处的吸收值。每个浓度梯度及对照组做4个平行样。根据吸光值计算细胞的相对存活率。空白组即不加细胞及脂质体溶液，对照组不加脂质体溶液。

细胞相对存活率(％)＝100％×(OD实验组-OD空白组)/(OD对照组-OD空白组)

如图6所示，MCF-7细胞与本发明双特异脂质体孵育后的存活率有浓度依赖性，低于0.2mg/mL时均接近100％，至4mg/mL时仍在90％以上。这表明本发明适配体修饰的α-Gal脂质体生物毒性低。

五、在不同比例的PBMC和MCF-7细胞中双特异脂质体对MCF-7细胞的裂解检测。

使用人外周血单个核细胞分离液试剂盒，从新鲜人血中提取人外周血单个核细胞(PBMC细胞)。CFDA-SE细胞增殖示踪探针标记MCF-7细胞，并将标记的MCF-7细胞以5×10⁵稀释于1.5mL离心管中，加入含有人IgG的不同密度梯度的PBMC细胞，以及Apt-Lip、Lip，37℃中低速旋转4h，最后在每管中加入终浓度为5μg/mL碘化丙啶(PI)孵育10min标记死亡细胞，使用流式细胞仪分析细胞裂解比率。每个浓度梯度及对照组做4个平行。

细胞裂解率(％)＝100％×(SL-STCL-SECL)/(ML-STCL)

SL表示实验组的细胞裂解率，STCL表示自发的细胞裂解率，SECL表示自发的效应细胞裂解率，ML表示最高的细胞裂解率。

如图7所示，本发明的Apt-Lip处理过的MCF-7细胞与不同比例的PBMC混合，裂解率皆高于无适配体修饰的Lip。免疫效应细胞PBMC细胞(E)与MCF-7细胞(T)比例为20：1和40：1时，Apt-Lip引起的细胞裂解率显著提高。这表明本发明的Apt-Lip能高效靶向癌细胞，并引起PBMC细胞对癌细胞的杀伤。

六、检测抗α-Gal抗体对适配体修饰的α-Gal脂质体引起的细胞裂解的影响，以及比较适配体修饰的α-Gal脂质体引起的正常细胞和癌细胞的裂解。

MCF-7细胞、HEVEC细胞(人脐静脉内皮细胞)分别使用CFDA-SE标记，并将标记的细胞分别以5×10⁵个细胞稀释于1.5mL离心管中，加入含有人IgG的PBMC细胞(E:T＝20:1)，以及Apt-Lip、Lip或PBS，37℃中低速旋转4h，同时设置一组实验，MCF-7细胞与不含IgG的PBMC混合和脂质体，检测抗体的存在与否对裂解效率的影响。最后在每管中加入终浓度为5μg/mL碘化丙啶(PI)孵育10min标记死亡细胞，使用流式细胞仪分析细胞裂解比率。每个浓度梯度及对照组做4个平行。结果显示，体系中IgG的缺失，会使得细胞裂解率显著降低(图8a)，表明IgG和Apt-Lip的存在是MCF-7细胞和PBMC细胞之间的桥梁，刺激ADCC效应，引起对MCF-7细胞的裂解。与人正常细胞HEVEC细胞比较(图8b)，表明本发明Apt-Lip能特异性地靶向癌细胞。

七、测定适配体修饰的α-Gal脂质体在全血中对癌细胞的裂解率。

CFDA-SE标记的MCF-7细胞预先分别与Apt-Lip、Lip孵育15min。为模拟肿瘤病人样品，将上述预处理的MCF-7细胞与健康人血混合，37℃中低速旋，在不同的时间点取出血液样品，使用血红细胞裂解液裂解血红细胞以排除红细胞的干扰。加入PI对死MCF-7细胞染色，经流式细胞分析仪分析细胞的裂解率。上述结果表明Apt-Lip能更有效地结合MCF-7细胞(图9)，由于人全血中含有大量的IgG，能被结合在MCF-7细胞表面的脂质体募集而与α-Gal抗原结合，引起ADCC效应。因而Apt-Lip能有效地刺激MCF-7细胞的裂解。

需要说明的是，在本文中，在一般情况下，由语句“包括……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的步骤、过程、方法或者实验设备中还存在另外的相同要素。

应当理解，以上所述实例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。