具体实施方式

本申请的发明人将重组促性腺激素释放激素(GnRH)蛋白对4周龄的实验大鼠接种之后，对由此导致的睾丸大小及重量变化、血液中睾酮浓度变化进行了分析。结果显示，将利用本发明的重组GnRH蛋白实施疫苗接种的组与对照组比较，睾丸的大小及重量减少了，血液中睾酮的浓度降低了。由此可以确认，包含本发明重组GnRH蛋白的疫苗组合物具有免疫阉割效果及由此产生的雄臭消除效果，从而完成了本发明。

因此，本发明可以提供一种雄臭消除用疫苗组合物，其融合CTB(Cholera toxin Bsubunit)及n个GnRH(Gonadotropin-releasing hormone)的重组蛋白为有效成分，所述n为1至20之间的整数。

本说明书中使用的术语“CTB(Cholera toxin B subunit)”或“霍乱毒素B亚单位”是指针对宿主细胞具有结合活性的多肽。优选地，可以由包含序列号5的碱基序列的多核苷酸编码。最优选地，可以由序列号5所示的多核苷酸编码，但可以由与序列号5的碱基序列具有80％以上，更加优选地具有90％以上，更更优选地具有95％以上序列同源性的碱基序列编码。例如：包含具有70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同源性的多核苷酸。多核苷酸的“序列同源性％”可以通过将两个最佳排列的序列与比较区域进行比较确认。与两个序列最佳排列的参考序列(不包括添加或删除)相比，比较区域的多核苷酸序列一部分可以包含添加或删除(即，空位)。霍乱毒素是A1及A2亚单位与5个B亚单位结合形态的复合体，为了霍乱毒素的内载化及活化，CTB与粘膜免疫系统(mucosal immune system)的M细胞(microfold cell)结合。在这种情况下，CTB与细胞膜双层的GM1-神经节苷脂(ganglioside)经过特异反应结合后，再使与CTB结合的A亚单位或抗原蛋白通过细胞膜。CTB通过穿透粘膜屏障的结合抗原的吸收增加及结合抗原的有效表达改善抗原的免疫原性，从而可用作旨在增强粘膜免疫的强力粘膜佐剂(adjuvant)及载体(carrier)分子。

本说明书中使用的术语“多核苷酸”包括脱氧核糖核酸(DNA)及核糖核酸(RNA)。一般情况下，表现为包含通过磷酸二酯(phosphodiester)键彼此结合的2个以上连接核苷酸或核苷酸衍生物的低聚物或聚合物。多核苷酸还包括含有除了核苷酸类似物或磷酸二酯键之外的“骨架”键，例如，磷酸三酯键、氨基磷酸酯键、硫代磷酸酯键、硫酯键或肽键(肽核酸)的DNA及RNA衍生物。多核苷酸包括单链及/或双链多核苷酸，例如：不仅包括脱氧核糖核酸(DNA)及核糖核酸(RNA)，还包括RNA或DNA中任意一种类似物。

本说明书中使用的术语“GnRH(gonadotropin-releasing hormone)”是指促性腺激素释放激素。优选地，如果由序列号1的氨基酸序列构成的GnRH，或者能够诱导针对GnRH的免疫反应，就并非仅限定于此。另外，本发明的GnRH中序列号1的变异体包含在本发明的范围内。具体讲，所述肽包含与序列号1的氨基酸序列具有80％以上，更加优选地具有90％以上序列同源性的氨基酸序列。众所周知，GnRH由10个氨基酸构成，在所有动物中均由几乎相同的氨基酸构成。GnRH在下丘脑中生成，作用于脑垂体，从而促进性激素即FSH及LH的生成。因此，如果将GnRH用作抗原给动物接种，就会生成识别GnRH的抗体。所述抗体将体内存在的GnRH清除，以便阻断雄性及雌性动物的性成熟，由此就能够产生阉割效果，从而就可以获得消除雄臭的效果。

本说明书中使用的术语“重组蛋白”或“重组融合蛋白”是指2种以上的蛋白质人为地连接形态的蛋白质。在本发明中是指连接了CTB与GnRH形态的蛋白质。如上所述，重组融合蛋白在确定各自的伙伴之后可以通过化学合成或者基因重组方法进行表达及提炼而获得。优选地，可以通过将对CTB进行编码的多核苷酸和对GnRH进行编码的多核苷酸连接起来的融合基因在细胞表达系统中进行表达而获取。

关于用于本发明重组蛋白的GnRH，与具有一个拷贝(one copy)GnRH氨基酸序列的情况相比，具有两个或多个拷贝(two or more copies)的效果会更好。在具有多个拷贝(multiple copy)的情况下，就能够进一步增强针对GnRH的免疫原性。因此，关于GnRH的氨基酸序列，优选地，可以采用序列号1的氨基酸序列为2个以上的多聚体。如果GnRH的个数能够容纳于表达载体内，就没有特别的限制。但是，优选地，可以采用2个至20个，更加优选地为2个至10个连接的多聚体形态。更更优选地，可以采用6个连接的六聚体。在本发明的具体实施例中，将GnRH蛋白连续六次重复而制作。所述连接6个GnRH的多肽可以由序列号2的氨基酸序列构成，但并非仅限定于此。

另外，所述重组融合蛋白的CTB与GnRH既可以直接连接，也可以通过接头等氨基酸连接子进行连接。另外，即使在包含多个拷贝GnRH的情况下，各个GnRH既可以直接连接，也可以通过接头等连接子进行连接。在通过接头进行连接的情况下，优选整体免疫原性(immunogenicity)并不因此而减少。

关于本说明书中使用的术语“接头(linker)”是指，在将CTB与GnRH连接起来制造重组蛋白的情况下或者将多个GnRH连接起来的情况下，为了增加这些蛋白质结构的柔韧性以便确保能够增进结合的各个蛋白质的活性而在蛋白质与蛋白质之间插入的肽。接头只要是能够使免疫反应达到最小化，则其种类或者氨基酸个数没有限制。但是，优选地，氨基酸为1个至20个。更加优选地，氨基酸为1个至5个。在本发明的具体实施例中，为了将各个蛋白质连接起来，使用了载体多克隆位点上的限制酶部位的序列或者丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸(AGA)接头。

本说明书中使用的术语“疫苗(vaccine)”是指，作为含有引起生物免疫反应的抗原的生物制剂，为了预防感染症或者针对特定抗原诱导产生抗体而给动物注射或者喂食，从而使生物产生免疫的免疫原，所述动物是指非人动物，其实例在后面进行了介绍。

本发明的“疫苗组合物”可以分别按照常用的方法制成粉剂、颗粒、片剂、胶囊、悬浮液、乳液、糖浆、气雾剂等口服剂型及灭菌注射溶液形态的剂型使用。在制造剂型时，可以使用常用的填充剂、增量剂、结合剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂等稀释剂或赋形剂进行制造。用于口服的固体制剂包括片剂、丸剂、粉剂、颗粒、胶囊等，这种固体制剂可以通过向所述卵磷脂类似乳化剂中至少加入一种以上赋形剂(例如：淀粉、碳酸钙(calciumcarbonate)、蔗糖(sucrose)或乳糖(lactose)、明胶等)进行混合调配。另外，除了单纯的赋形剂之外，还可以使用硬脂酸镁、滑石粉等润滑剂。用于口服的液体制剂可以使用悬浮剂、内用液剂、乳剂、糖浆等，除了常用的单纯稀释剂即水、液体石蜡之外，还包括多种赋形剂，例如：湿润剂、甜味剂、芳香剂、防腐剂等。非口服的制剂包括经过灭菌处理的水溶液、非水溶性制剂、悬浮剂、乳剂、冻干制剂，非水溶性制剂、悬浮剂可以使用丙二醇(propyleneglycol)、聚乙二醇、橄榄油等植物性油脂以及油酸乙酯等可以进行注射的酯类等。

本发明疫苗组合物的给药途径优选为口腔、静脉内、肌肉内、动脉内、骨髓内、硬膜内、心脏内、经皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、肠管、局部、舌下或直肠给药，但并非仅限于此。优选经口给药或非经口给药。本发明中使用的术语“非经口”包括皮下、皮内、静脉内、肌肉内、关节内、滑液囊内、胸骨内、硬膜内,病灶内及头盖骨内注射或注入技术。本发明的疫苗组合物还可以制作成方便直肠给药的栓剂形态，但是本发明并非仅限定于上述列举的给药方法，还可以通过能将活性物质移动到目标细胞的任意装置进行给药。本发明的疫苗组合物可以诱导体液性或选择性细胞-媒介性免疫反应及/或上述两种免疫反应的组合。

本发明疫苗组合物的用药量应当考虑个体的年龄、体重、性别、身体状态等因素进行选择。在没有特殊副作用的情况下，用于诱导个体发生免疫反应所需的量可以根据用作免疫原的重组蛋白及赋形剂的随机变化而相应地进行变化。

另外，本发明的免疫阉割用疫苗组合物可以由抗原、药学上可接受的载体、合适的助剂、其它普通物质构成，按照免疫学有效量进行给药。本说明书中使用的术语“免疫学有效量”是指能够获得免疫阉割效果的充足量和不会引起副作用或者严重或过度免疫反应的量，精确的给药浓度随着需要给药的特定免疫原不同而变化，为了检验免疫反应的发生，可以采用本领域的技术人员公知的方法对其进行确定。另外，也会随着给药形态及途径、受体的年龄、健康状况及体重、症状的特性及程度、现在治疗方法的种类以及治疗次数等因素不同而发生变化。

另外，本发明的重组蛋白还可以追加融合猪免疫球蛋白Fc片段(porcine Fcfragment；pFc2)。所述pFc2可以在GnRH的C-末端方向融合，但并非仅限定于此。

本说明书中使用的术语“Fc片段(Fc fragment)”是指，当免疫球蛋白通过木瓜蛋白酶(papain)消化时，只有重链(heavy chain；H chain)部分通过S-S键连接，在这种情况下，将不具有抗原结合部位的部分称为Fc片段。优选地，本发明的Fc片段是指猪的Fc片段。更加优选地，为由序列号6的氨基酸序列构成的猪Fc片段，但与重组蛋白融合时，如果是使重组蛋白的表达量及溶解性增加的Fc片段，则并非限定于此。另外，本发明的Fc片段中序列号6的变异体包含在本发明的范围内。具体讲，所述肽包含与序列号6的氨基酸序列具有90％以上，更加优选地具有95％以上，最优选地具有98％以上序列同源性的氨基酸序列。

另外，本发明的重组蛋白还可以追加融合BiP(chaperone binding protein)。所述BiP可以在GnRH或CTB的N-末端方向融合，但并非仅限定于此。

本说明书中使用的术语“BiP(chaperone binding protein)”是一种用于使表达的重组蛋白向内质网移动的物质。优选地，为由序列号8的氨基酸序列构成的BiP，但与重组蛋白融合时，如果是使重组蛋白向内质网移动的BiP，则并非限定于此。另外，本发明的BiP中序列号8的变异体包含在本发明的范围内。具体讲，所述肽包含与序列号8的氨基酸序列具有90％以上，更加优选地具有95％以上，最优选地具有98％以上序列同源性的氨基酸序列。当所述BiP表达时或表达后，可以将肽的一部分切掉，只留下一部分肽。

另外，本发明的重组蛋白还可以追加融合HDEL(His-Asp-Glu-Leu)。所述HDEL可以在GnRH或pFc2的C-末端方向融合，但并非仅限定于此。

本说明书中使用的术语“HDEL”是指，由组氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-亮氨酸构成的目标肽序列，所述HDEL可以防止重组蛋白从内质网(endoplasmic reticulum)分泌或者使其在内质网内保持稳定，所述HDEL可以由序列号11的碱基序列编码，但并非仅限定于此。

另外，本发明的重组蛋白可以是依次融合BiP、CTB、GnRH、pFc2及HDEL的，与之相关的所述重组蛋白可以由序列号12的氨基酸序列构成。但是，本发明并不受所述融合顺序或氨基酸序列限制。

本发明的疫苗组合物对于消除雄臭(boar taint)具有非常良好的效果。

另外，为了改善或增强免疫反应，本发明的疫苗组合物可以含有一种以上的佐剂(adjuvant)。

本说明书中使用的术语“佐剂(Adjuvant)”是指，添加到疫苗或具有药学活性的成分中增加免疫反应或者施加影响的物质或组合物，比较具有代表性的佐剂，通常是指免疫原(immunogen)用载体或辅助物质及/或其它具有药学活性的物质或组合物。比较典型的实例，术语“佐剂”应当从广义的概念去解释，它是指能够提高与所述佐剂融合或者与所述佐剂一起注射的抗原的免疫原性(immunogenicity)的广义物质或策略(stratagerm)。另外，所述佐剂可以分为免疫增强剂(immune potentiator)、抗原传递系统或其组合，并非仅限定于此。作为合适的佐剂实例，包括：氢氧化铝、弗朗德完全或不完全佐剂、DEAE葡聚糖、左旋咪唑、PCG及poly I:C或poly A:U。在本发明的一个实施例中，作为水包油乳剂(Emulsigen)-类佐剂，采用了含有双十八烷基二甲基溴化铵(DDA，dimethyldioctadecylammonium bromide)的水包油乳剂-D佐剂。

本发明的重组蛋白不仅包含具有野生型(wild type)氨基酸序列的蛋白质，而且还包含重组融合蛋白的变异体。重组蛋白的变异体是指，与正常氨基酸序列相比，通过一个以上氨基酸残基缺失、插入、非保全性或保全性取代或其组合而具有不同序列的蛋白质。从整体上不改变分子活性的蛋白质及肽水平下的氨基酸交换的方法属于本领域公知(H.Neurath et al.,1979)。另外，所述重组蛋白也可以通过磷酸化(phosphorylation)、甲基化(methylation)、硫化(sulfation)、丙烯酸化(acrylation)、糖化(glycosylation)、法尼基化(farnesylation)等方法进行修饰(modification)。虽然所述变异体或修饰体是表现出与天然蛋白质相同生物学活性的功能性等价物，但是根据需要也可以是使其蛋白质特性发生改变的变异体或修饰体。优选为通过氨基酸序列上的变异和修饰增加蛋白质的热、pH等的结构稳定性或者增加蛋白质活性的。

本发明的重组GnRH蛋白可以通过化学方法合成或者通过基因重组方法生产。优选地，可以利用重组载体使其转化到宿主细胞中，然后将由此表达的蛋白质通过分离、提炼进行生产。

因此，作为本发明的另一形态，本发明提供一种雄臭消除用重组载体，其包含由序列号3的碱基序列构成的GnRH基因及由序列号5的碱基序列构成的CTB基因。

重组载体通常是指插入外来DNA片段的载体，一般情况下，是指双链的DNA片段。本说明书中使用的术语“外来DNA”是指源于外来品种的DNA，或者是指在源于相同品种的情况下，从本来的形态发生实质性改变的形态。外来基因利用需要转录的特定目标核酸对多肽进行编码。对重组载体来说，为了提高在宿主细胞内转化的基因表达水平，所述基因必须与在被选择的表达宿主内发挥功能的转录及破译表达调节序列按照可发挥作用地方式连接。所述重组载体是指包含确保基因插入物能够在个体的细胞内表达而按照可发挥作用的方式连接的必需调节要素的基因构筑物(construct)，为了制造这种基因构筑物，可以采用标准重组DNA技术。如果能够在原核细胞及真核细胞的各种宿主细胞内表达目标基因并发挥生成目标蛋白质的功能，重组载体的种类就没有特别的限定。但是，最好选择以下载体，即既拥有显示强大活性的启动子与较强的表达力，又能够大量生产与自然状态类似形态外来蛋白质的载体。优选地，重组载体至少包含启动子、起始密码子、对目标蛋白质编码的基因、终止密码子及终止子。除此之外，还可以适当包含对信号肽编码的DNA、增强子序列、目标基因的5'末端及3'末端的非翻译区域(UTR)、筛选标记区域或可复制单位等。

在本发明的具体实施例中，将通过向含有6拷贝的GnRH基因片段的pCAMBIA13000载体插入CTB基因片段制造的重组载体转化到烟草植物(Nicotiana benthamiana)中。所述载体是一种带有35S启动子和HSP(heat shock protein)终止子系统，对烟草植物大量生产蛋白质非常有用的载体。

本说明书中使用的术语“载体(vector)”是指，含有按照可发挥作用的方式与能够在适当的宿主内表达DNA的合适调节序列连接的DNA序列的DNA构筑物。载体可以是质粒、噬菌体颗粒或简单的潜在性基因组(genome)插入物。如果转化到合适的宿主中，则不论宿主的基因组如何，载体均可以进行复制并发挥功能，或者有时可以融合到基因组自身中。质粒是当前载体最常用的形态，因此术语“质粒(plasmid)”及“载体(vector)”有时候可以相互交换使用。但是，本发明包含具有与本领域公知或掌握情况同等功能的载体的其它形态。

另外，在本发明中，所述重组载体，还包括：从对由序列号6的氨基酸序列构成的pFc2编码的多核苷酸、对由序列号8的氨基酸序列构成的BiP编码的多核苷酸及由序列号11的碱基序列构成的HDEL基因组成的组中选择的1种以上序列。

作为本发明的另一形态，本发明提供一种利用本发明重组载体制造的雄臭消除用重组蛋白。

另外，本为本发明的另一形态，本发明提供一种利用本发明重组载体转化的转基因生物。

本说明书中使用的术语“转化(transformation)”是对通过注入的DNA使生物的遗传性质发生改变的总称，“转化体(transgenic organism或transformant)”是指通过分子遗传学方法注入外部的基因制造的有机体。优选地，包含通过本发明的重组载体转化的有机体，只要是为了实现本发明的目的，所述有机体就没有限制。

作为本发明的另一形态，本发明提供一种动物的雄臭消除方法，其包括：将本发明的疫苗组合物向除人之外的动物给药的步骤。

如何动物的种类如何，利用本发明疫苗组合物的雄臭消除方法均可用于除人之外的所有动物。所述动物最好选用哺乳动物，例如：可以选用狗、鲸鱼、猫、大猩猩、鹅、豚鼠、野鸡、骆驼、狍子、骡子、鸡、毛驴、海豚、猪、美洲驼、马、水牛、鹿、黄牛、驯鹿、羊驼、牦牛、绵羊、山羊、红毛猩猩、鸭子、猴子、雪貂、老鼠、火鸡、鸵鸟或兔子，但并非仅限定于此。

关于本发明的方法，给药最好实施2次以上。例如：第1次接种(initialvaccination)之后，可以1周至10周为间隔，实施1次到4次左右的加强接种(boosterinjections)。但是，这也可以根据相关动物的种类不同由本领域的技术人员适当变化实施。

本说明书及权利要求书中使用的术语或者单词不应当仅限定于常用意义或者字典释义进行解释，而应当本着发明人为了通过最佳的方法介绍自己的发明而可以对术语的概念进行适当定义的原则按照符合本发明技术思想的涵义与概念进行解释。

下面，为了有助于对本发明的理解，将列举理想的实施例。但是，下述实施例仅是为了能够更加容易对本发明进行理解而列举的，本发明的内容并不受以下实施例的限制。

[实施例]

实施例1:BiP-CTB-GnRH-pFc2-HDEL融合蛋白的表达及提炼

为了诱导GnRH的免疫原性，如图1所示，制作出了用于表达将CTB、pFc2、BiP及HDEL融合到GnRH中的重组GnRH的载体。由10个氨基酸构成的GnRH有6个连续通过丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸(AGA)接头连接，6个连接的GnRH的氨基酸序列及碱基序列分别示于序列号2及序列号3中。另外，CTB的氨基酸序列及碱基序列分别示于序列号4及序列号5中，pFc2的氨基酸序列及碱基序列分别示于序列号6及序列号7中，BiP的氨基酸序列及碱基序列分别示于序列号8及序列号9中，HDEL的氨基酸序列及碱基序列分别示于序列号10及序列号11中。同时，表达盒(cassette)的全部氨基酸序列及碱基序列分别示于序列号12及序列号13中。

将利用所述载体转化的根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)接种到烟草植物的叶子中完成了瞬时表达(transient expression)。从植物的叶子中提取总蛋白(Totalprotein)并进行离心分离后，将溶液中含有的水溶性(soluble)形态的蛋白质利用安装有蛋白A琼脂糖凝胶柱(protein A-sepharose column)的AKTA prime(GE Healthcare,美国)分离出pFc2融合GnRH蛋白。

实施例2:重组GnRH蛋白浓度确认

为了确认及测定所述实施例1中分离、提炼的重组GnRH蛋白浓度，以已知浓度的牛血清白蛋白(BSA，bovine serum albumin)为标准品(standard)，实施了SDS-PAGE及布拉德福德定量分析(bradford assay)。将分离、提炼的重组GnRH蛋白按照1、2μl进行上样后，为了进行定量处理，使其中含有0.5、1、2μg的BSA。Gel通过考马斯亮蓝染色(Coomassie bluestaining)最终确认了蛋白条带。布拉德福德定量分析将BSA用作标准品绘制标准曲线(standard curve)，并制定公式，然后代入GnRH的UV值计算出了浓度。

其结果如图2所示，重组GnRH蛋白获得了充分表达，从而确认了分离、提炼过程。经确认，GnRH重组蛋白的浓度约为2μg/μl。同时，将上述确认的重组GnRH蛋白用于下述实施例3的动物实验中。

实施例3:重组GnRH蛋白的注射效果确认

3.1.实验动物、注射条件及日程

为了确认重组GnRH蛋白的免疫阉割效果，对4周龄雄性斯泼累格多雷(SD，SpragueDawley)大鼠按照表1中记载的注射条件和图3所示的日程注射了含有本发明重组GnRH蛋白的疫苗组合物，对照组注射相同量的PBS(p hosphate-buffered saline)，实验组注射了所述疫苗组合物100μg/180μl及E-D佐剂20μl(参照表1)。使入库的4周龄大鼠驯化4天左右。然后，按照14天到15天的注射间隔总共注射了3次，采血分别是在注射前及实验结束时实施。注射3次后，在经过4周的时刻摘除睾丸，测定其重量及大小，然后对血液中睾酮(testosterone)的浓度进行了测定。

【表1】

3.2.睾丸的肉眼评估

将本发明的疫苗组合物注射3次后，在经过4周的时刻摘除睾丸，对其进行了肉眼评估。其结果如表2及图4所示。

【表2】

如上述表2及图4所示，与非接种对照组比较，包含重组GnRH蛋白的疫苗接种组睾丸的重量及长度明显减少。另外，正如通过重量比可以确认的那样，与个体的总体重对比，疫苗接种组睾丸的重量所占的比例明显更低。疫苗接种组的睾丸平均长度也一样，与非接种组对比，其表现出64％～86％的水平。

通过上述结果可以确认，通过注射含有本发明重组GnRH蛋白的疫苗组合物成功实施了免疫性阉割。

3.3.睾酮(testosterone)ELISA结果

将本发明的疫苗组合物注射3次以后，在经过4周的时刻进行采血，并对血液中睾酮的浓度进行了测定。测定是利用的ELISA试剂盒按照制造商的指南进行操作的。具体讲，就是在涂布有睾酮的测试板上加入50μL的血清，然后再立即加入相同量的生物素化检测(biotinylated Det ection)抗体，接着在37℃条件下使其反应45分钟。然后，再利用350μL的冲洗缓冲液(washing buffer)清洗了3次。接着，再加入100μL的HRPconjugate溶液，然后在37℃条件下培养了30分钟。按照与上述过程相同的方法清洗5次之后，再添加90μL的基质液，接着在37℃条件下培养了15分钟。然后，加入50μL的反应终止液，接着再通过ELISA仪测定了450nm波长下的OD值。为了对血液中睾酮的实际量进行定量处理，将睾酮标准蛋白质按照0.1、0.4、1.6、5、20ng/ml添加完成了反应。然后，利用通过这种操作获得的OD值绘制标准曲线，并将前面获得的样品OD值代入其中，完成了睾酮的定量，其结果记载到了表3及图5中。

【表3】

其结果如所述表3及图5所示，与非接种对照组比较，包含重组GnRH蛋白的疫苗接种组血液中睾酮的浓度明显减少。

上述结果与所述实施例3.2.的结果一致，通过注射含有本发明重组Gn RH蛋白的疫苗组合物成功实施了免疫性阉割。因此，可以确认消除了雄臭。

上述本发明的说明是针对本发明实施例进行的介绍，具有本发明所属技术领域一般知识的技术人员在不改变本发明的技术思想或者必要特征的前提下，完全能够轻松按照其它具体形态进行改变。因此，以上列举的实施例是为了从各个方面对本发明进行说明，并非对本发明进行限定。

【产业上的可利用性】

本发明涉及一种雄臭消除用疫苗组合物，其包含融合CTB(Cholera toxin Bsubunit)及GnRH(Gonadotropin-releasing hormone)的重组蛋白。所述疫苗组合物利用包含GnRH的多肽序列的重组蛋白诱导注射该疫苗组合物的个体产生针对GnRH的抗体，从而确认了睾丸的萎缩效果。因此，本发明可用于以较低的费用、较高的安全性及最小的副作用对公猪实施免疫性阉割，从而消除雄臭。所以，预计本发明在产业上的利用价值将非常大。

<110> 巴伊沃爱普有限公司

<120> 雄臭消除用重组蛋白及包含该重组蛋白的疫苗组合物

<130> MPCT20-062

<150> KR 10-2020-0035897

<151> 2020-03-24

<160> 13

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> GnRH的氨基酸序列

<400> 1

Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly

1 5 10

<210> 2

<211> 78

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 6X GnRH的氨基酸序列

<400> 2

Ala Gly Ala Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Ala Gly Ala

1 5 10 15

Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Ala Gly Ala Glu His Trp

20 25 30

Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Ala Gly Ala Glu His Trp Ser Tyr Gly

35 40 45

Leu Arg Pro Gly Ala Gly Ala Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro

50 55 60

Gly Ala Gly Ala Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly

65 70 75

<210> 3

<211> 234

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 6X GnRH的DNA序列

<400> 3

gcaggagcag aacattggtc ttacggtctt agacctggag ctggagctga acattggagt 60

tatggtttaa gacctggagc tggagctgaa cattggtctt atggacttag accaggtgca 120

ggtgctgagc attggtcata tggattgaga ccaggagctg gtgctgagca ttggtcttat 180

ggtctaagac ctggagctgg agctgaacat tggtcttacg gactcagacc cggt 234

<210> 4

<211> 102

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CTB的氨基酸序列

<400> 4

Thr Pro Gln Asn Ile Thr Asp Leu Cys Ala Glu Tyr His Asn Thr Gln

1 5 10 15

Ile His Thr Leu Asn Asp Lys Ile Phe Ser Tyr Thr Glu Ser Leu Ala

20 25 30

Gly Lys Arg Glu Met Ala Ile Ile Thr Phe Lys Asn Gly Ala Thr Phe

35 40 45

Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp Ser Gln Lys Lys Ala

50 55 60

Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Ala Tyr Leu Thr Glu Ala

65 70 75 80

Lys Val Glu Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro His Ala Ile

85 90 95

Ala Ala Ile Ser Met Ala

100

<210> 5

<211> 306

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CTB的DNA序列

<400> 5

actcctcaga acataaccga tttgtgcgct gaataccata acactcaaat acacacactc 60

aacgataaga ttttctctta cactgaatca cttgctggaa agagagagat ggcaattatc 120

acctttaaaa acggagctac tttccaggtt gaagtgcctg gtagtcaaca tatcgattca 180

cagaagaaag caatagagag gatgaaggat acacttagga ttgcttattt gaccgaagca 240

aaagttgaga aactctgtgt gtggaataac aaaacccctc acgctatcgc tgctatctct 300

atggcc 306

<210> 6

<211> 229

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pFc2的氨基酸序列

<400> 6

Arg Ala Val Gly Arg Pro Cys Pro Ile Cys Pro Ala Cys Glu Gly Pro

1 5 10 15

Gly Pro Ser Ala Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Gln Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln

35 40 45

Glu Asn Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Thr Ala Gln Thr Arg Pro Lys Glu Ala Gln Phe Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Glu Asp Trp Leu Lys Gly

85 90 95

Lys Glu Phe Glu Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Thr Arg Ile Ile Ser Lys Ala Lys Gly Pro Ser Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Ser Pro Ser Ala Glu Glu Leu Ser Arg Ser Lys Val Ser

130 135 140

Ile Thr Cys Leu Val Thr Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu

145 150 155 160

Trp Lys Ser Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Gly Asn Tyr Arg Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Gln Gln Asp Val Asp Gly Thr Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

180 185 190

Ala Val Asp Lys Ala Ser Trp Gln Arg Gly Asp Pro Phe Gln Cys Ala

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Val Ser

210 215 220

Lys Thr Gln Gly Lys

225

<210> 7

<211> 681

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pFc2的DNA序列

<400> 7

gttggaagac catgccctat atgtcctgct tgtgaaggtc caggtccctc tgcttttata 60

ttcccaccaa agccgaagga taccttgatg atttcacgta caccacaagt tacttgtgtt 120

gttgtggatg tttcacaaga aaatcctgag gtacaattca gctggtatgt tgatggggta 180

gaagtgcaca ctgcacagac tcgaccaaag gaggcccagt ttaactcgac ttatagagtt 240

gtttctgttc tcccaatcca acacgaagat tggctgaagg gcaaggaatt tgaatgcaag 300

gttaacaata aagatctacc agcaccaatt accaggatta tttctaaggc aaaaggaccc 360

tccagagagc cccaagttta cacattgtct ccttctgctg aggagcttag tagaagtaaa 420

gtgagcatta cctgcttagt gacgggattc taccctccag acatcgacgt cgaatggaaa 480

tctaatggtc aacctgagcc agaaggtaac tataggacta ctccaccaca acaggacgtc 540

gatggcacat actttcttta ttcaaaactt gctgtcgata aggcaagttg gcaaagagga 600

gatccatttc agtgtgctgt aatgcatgag gctttgcata atcattatac acagaaatca 660

gtttctaaaa cacaagggaa a 681

<210> 8

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BiP的氨基酸序列

<400> 8

Ile Glu Glu Ala Thr Lys Leu

1 5

<210> 9

<211> 273

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BiP的DNA序列

<400> 9

atggctcgct cgtttggagc taacagtacc gttgtgttgg cgatcatctt cttcggtgag 60

tgattttccg atcttcttct ccgatttaga tctcctctac attgttgctt aatctcagaa 120

ccttttttcg ttgttcctgg atctgaatgt gtttgtttgc aatttcacga tcttaaaagg 180

ttagatctcg attggtattg acgattggaa tctttacgat ttcaggatgt ttatttgcgt 240

tgtcctctgc aatagaagag gctacgaagt taa 273

<210> 10

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HDEL的氨基酸序列

<400> 10

His Asp Glu Leu

1

<210> 11

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HDEL的DNA序列

<400> 11

cacgatgagc tc 12

<210> 12

<211> 428

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1300-BiP:CTB:GnRH:pFc2:HDEL的全部氨基酸序列

<400> 12

Ile Glu Glu Ala Thr Lys Leu Arg Ile Leu Thr Pro Gln Asn Ile Thr

1 5 10 15

Asp Leu Cys Ala Glu Tyr His Asn Thr Gln Ile His Thr Leu Asn Asp

20 25 30

Lys Ile Phe Ser Tyr Thr Glu Ser Leu Ala Gly Lys Arg Glu Met Ala

35 40 45

Ile Ile Thr Phe Lys Asn Gly Ala Thr Phe Gln Val Glu Val Pro Gly

50 55 60

Ser Gln His Ile Asp Ser Gln Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp

65 70 75 80

Thr Leu Arg Ile Ala Tyr Leu Thr Glu Ala Lys Val Glu Lys Leu Cys

85 90 95

Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro His Ala Ile Ala Ala Ile Ser Met Ala

100 105 110

Thr Ser Ala Gly Ala Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Ala

115 120 125

Gly Ala Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Ala Gly Ala Glu

130 135 140

His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Ala Gly Ala Glu His Trp Ser

145 150 155 160

Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Ala Gly Ala Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu

165 170 175

Arg Pro Gly Ala Gly Ala Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly

180 185 190

Ala Arg Ala Arg Ala Val Gly Arg Pro Cys Pro Ile Cys Pro Ala Cys

195 200 205

Glu Gly Pro Gly Pro Ser Ala Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

210 215 220

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Gln Val Thr Cys Val Val Val Asp

225 230 235 240

Val Ser Gln Glu Asn Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Tyr Val Asp Gly

245 250 255

Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Arg Pro Lys Glu Ala Gln Phe Asn

260 265 270

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Glu Asp Trp

275 280 285

Leu Lys Gly Lys Glu Phe Glu Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro

290 295 300

Ala Pro Ile Thr Arg Ile Ile Ser Lys Ala Lys Gly Pro Ser Arg Glu

305 310 315 320

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Ser Pro Ser Ala Glu Glu Leu Ser Arg Ser

325 330 335

Lys Val Ser Ile Thr Cys Leu Val Thr Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile

340 345 350

Asp Val Glu Trp Lys Ser Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Gly Asn Tyr

355 360 365

Arg Thr Thr Pro Pro Gln Gln Asp Val Asp Gly Thr Tyr Phe Leu Tyr

370 375 380

Ser Lys Leu Ala Val Asp Lys Ala Ser Trp Gln Arg Gly Asp Pro Phe

385 390 395 400

Gln Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

405 410 415

Ser Val Ser Lys Thr Gln Gly Lys His Asp Glu Leu

420 425

<210> 13

<211> 1565

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1300-BiP:CTB:GnRH:pFc2:HDEL的全部DNA序列

<400> 13

tctagaatta ttacatcaaa acaaaaaatg gctcgctcgt ttggagctaa cagtaccgtt 60

gtgttggcga tcatcttctt cggtgagtga ttttccgatc ttcttctccg atttagatct 120

cctctacatt gttgcttaat ctcagaacct tttttcgttg ttcctggatc tgaatgtgtt 180

tgtttgcaat ttcacgatct taaaaggtta gatctcgatt ggtattgacg attggaatct 240

ttacgatttc aggatgttta tttgcgttgt cctctgcaat agaagaggct acgaagttaa 300

ggatcctcac tcctcagaac ataaccgatt tgtgcgctga ataccataac actcaaatac 360

acacactcaa cgataagatt ttctcttaca ctgaatcact tgctggaaag agagagatgg 420

caattatcac ctttaaaaac ggagctactt tccaggttga agtgcctggt agtcaacata 480

tcgattcaca gaagaaagca atagagagga tgaaggatac acttaggatt gcttatttga 540

ccgaagcaaa agttgagaaa ctctgtgtgt ggaataacaa aacccctcac gctatcgctg 600

ctatctctat ggccactagt gcaggagcag aacattggtc ttacggtctt agacctggag 660

ctggagctga acattggagt tatggtttaa gacctggagc tggagctgaa cattggtctt 720

atggacttag accaggtgca ggtgctgagc attggtcata tggattgaga ccaggagctg 780

gtgctgagca ttggtcttat ggtctaagac ctggagctgg agctgaacat tggtcttacg 840

gactcagacc cggtgcccgg gcagttggaa gaccatgccc tatatgtcct gcttgtgaag 900

gtccaggtcc ctctgctttt atattcccac caaagccgaa ggataccttg atgatttcac 960

gtacaccaca agttacttgt gttgttgtgg atgtttcaca agaaaatcct gaggtacaat 1020

tcagctggta tgttgatggg gtagaagtgc acactgcaca gactcgacca aaggaggccc 1080

agtttaactc gacttataga gttgtttctg ttctcccaat ccaacacgaa gattggctga 1140

agggcaagga atttgaatgc aaggttaaca ataaagatct accagcacca attaccagga 1200

ttatttctaa ggcaaaagga ccctccagag agccccaagt ttacacattg tctccttctg 1260

ctgaggagct tagtagaagt aaagtgagca ttacctgctt agtgacggga ttctaccctc 1320

cagacatcga cgtcgaatgg aaatctaatg gtcaacctga gccagaaggt aactatagga 1380

ctactccacc acaacaggac gtcgatggca catactttct ttattcaaaa cttgctgtcg 1440

ataaggcaag ttggcaaaga ggagatccat ttcagtgtgc tgtaatgcat gaggctttgc 1500

ataatcatta tacacagaaa tcagtttcta aaacacaagg gaaacacgat gagctctagc 1560

tcgag 1565