一种肌醇甘露寡糖缀合物、制备方法及作为抗结核糖疫苗的应用
阅读说明：本技术 一种肌醇甘露寡糖缀合物、制备方法及作为抗结核糖疫苗的应用 (Inositol mannan oligosaccharide conjugate, preparation method and application of inositol mannan oligosaccharide conjugate as anti-ribose vaccine ) 是由 高健 张晗 周示好 于 2020-05-15 设计创作，主要内容包括：本发明具体涉及一种肌醇甘露寡糖缀合物、制备方法及作为抗结核糖疫苗的应用。本发明基于结核杆菌表面的LM分子结构以设计并化学合成一系列结构确证的寡糖分子,将合成的寡糖半抗原与具有免疫原性的载体(蛋白或糖脂)共价偶联以制备结构新颖的全合成/半合成糖缀合物疫苗。经该策略制备的糖缀合物疫苗中糖抗原结构明确,重现性好。寡糖与免疫载体偶联后可以增强糖抗原免疫原性,使其转化为T细胞依赖性抗原,是对儿童和成人都具有长期免疫保护作用,同时可以克服由天然多糖导致的疫苗制备和质量控制困难等问题,是一种市场前景良好的抗结核糖疫苗。(The invention particularly relates to an inositol mannooligosaccharide conjugate, a preparation method and application as an anti-ribose vaccine. The invention is based on the LM molecular structure of tubercle bacillus surface to design and chemically synthesize a series of oligosaccharide molecules with confirmed structure, and covalently couple synthesized oligosaccharide hapten with carrier (protein or glycolipid) with immunogenicity to prepare fully-synthesized/semi-synthesized glycoconjugate vaccine with novel structure. The glycoconjugate vaccine prepared by the strategy has definite glycoantigen structure and good reproducibility. After being coupled with an immune carrier, the oligosaccharide can enhance the immunogenicity of a saccharide antigen and convert the saccharide antigen into a T cell dependent antigen, has long-term immune protection effect on children and adults, can overcome the problems of difficult vaccine preparation and quality control caused by natural polysaccharide and the like, and is an anti-ribose vaccine with good market prospect.)
技术领域
本发明属于抗结核糖疫苗技术领域，具体涉及一种肌醇甘露寡糖缀合物、所述肌醇甘露寡糖缀合物的制备方法及在制备抗结核糖疫苗中的应用。
背景技术
公开该
背景技术
部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。结核病是由结核杆菌引起的重大传染性疾病，严重威胁人类健康。据世界卫生组织统计，全球约有三分之一的人口已成为结核杆菌携带者，每年新增结核病例近1000万，并有约200万人死于结核病，致死人数居各类传染性疾病之首。我国是全世界22个结核病高负担国家之一，每年新增发病人数约占全球的10％，同时我国四分之一以上的结核病人为耐药结核或多药耐药结核病例，高发病人数和高耐药率使得我国结核病的防治形势异常严峻(Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2001,2,569-577.)。临床上对结核病人的传统抗生素疗法一般需要较长的治疗周期和多种抗生素的联合使用，这不仅会给病人身体造成很大伤害，而且会导致细菌耐药性不断增强。卡介苗(BCG)是目前预防结核病的唯一疫苗，自1921年应用于临床以来，已在全世界不同国家和地区广泛使用，但BCG仅能诱导婴幼儿产生较强的保护性免疫反应，对成年人的保护效果不佳，针对不同地区的人群，BCG的免疫效果也存在显著差异(New.Engl.J.Med.2007,356,656-659；Nat.Rev.Microbiol.2008,6,41-52.)。因此，研究开发安全有效的新型结核疫苗对于全球结核病的防治具有重要意义，这也是全世界亟待解决的一项课题。
糖类疫苗在防治细菌感染方面具有无可替代的作用。细菌表面的天然多糖具有免疫原性和结构保守性，是研发抗细菌糖疫苗的理想靶标抗原，基于此类抗原研发的多种糖类疫苗已广泛应用于临床(Nat.Rev.Drug Discov.2010,9,308-324；Lancet 2011,378,360-368.)。但是，糖类疫苗的研发也面临一些重大关键技术问题，主要包括：(1)多糖免疫原性较差，无法诱导T细胞依赖性的抗体免疫反应，通常导致由多糖单独形成的疫苗临床效果较差；(2)利用天然多糖与具有免疫原性的载体蛋白偶合形成多糖蛋白结合疫苗，并辅以免疫佐剂使用，虽然此方法可以保证疫苗的有效性，但在现有制备技术下，多糖蛋白结合疫苗的结构复杂且不明确，质量与效果难以控制。
脂阿拉伯甘露聚糖(Lipoarabinomannan,LAM)及其结构片段脂甘露聚糖(Lipomannan,LM)是结核杆菌表面大量表达的特异性糖脂分子，对于结核杆菌自身的生长和细菌活力是必不可少的，作为重要的毒力因子，他们在细菌入侵人体过程中发挥至关重要的作用(Annu.Rev.Biochem.1995,64,29-63.)。据文献报道，该类糖脂可以通过与Toll样受体2作用以刺激多种促炎细胞因子的释放，并提高人Th1细胞分化(Int.Immunol.2008,20,849-860.)。此外，其结构中的甘露糖链能够结合树突状细胞上的特异性细胞间粘附分子(DC-SIGN)，以感染DC细胞，同时此类甘露糖结构可以识别巨噬细胞上的甘露糖受体，介导巨噬细胞的吞噬作用，阻断吞噬小体发育成吞噬溶酶体(J.Biol.Chem.2003,278,5513-5516.)。综上所述，LAM和LM分子及其结构片段是研发新型抗结核病糖疫苗的理想靶标抗原。
发明内容
针对上述研究背景，发明人认为天然LAM聚糖结构复杂，模拟其天然结构得到的寡糖半抗原往往结构依然复杂，合成的精确程度不高，后续开发成为疫苗往往由于质量控制难度较大无法实际应用于临床。LM作为LAM的重要组成部分，其中包含LAM抗原特性的重要位点，筛选其中的关键结构得到一种基于LM的甘露寡糖片段作为寡糖半抗原能够显著降低寡糖片段工业合成难度。基于该技术目的，本发明设计并得到了一种甘露寡糖片段，经研究发现，该甘露寡糖片段半抗原与免疫原性载体偶联合成糖缀合物疫苗，其中抗原结构明确，重现性好，可以克服由天然多糖导致的疫苗制备和质量控制困难等问题。并且该糖缀合物疫苗能够刺激机体产生T细胞依赖性抗体，免疫活性良好，是一种易于生产和控制并且具有良好免疫效果的寡糖缀合物。
基于上述技术效果，本发明提供以下技术方案：
本发明第一方面，提供一种肌醇甘露寡糖缀合物，所述肌醇甘露糖缀合物包含如下式(Ⅰ)所示结构：
本发明经过研究和筛选工作，得到了一种如上结构的甘露寡糖片段，其结构中包含α-(1→2)和α-(1→6)链接的甘露寡糖以及LM还原端双甘露糖化肌醇模块。由于该寡糖半抗原与具有免疫原性的载体(蛋白或糖脂)共价偶联以制备结构新颖的全合成/半合成糖缀合物疫苗具有良好的免疫效果。发明人认为该甘露寡糖片段中包含了天然LM聚糖结构中的关键抗原结构，对于结核杆菌具有良好的模拟效果。此类寡糖分子与载体相连接制备的寡糖缀合物疫苗，尚未见文献报道，本发明中寡糖缀合物的提出对于基于LAM或LM设计相关糖疫苗的思路做出了重要的技术推进。
并且，依据甘露聚糖片段进行寡糖半抗原结构设计，相比现有技术中对于LAM结构的模拟，降低了工业中对于寡糖半抗原合成的难度。依据本发明验证，上述甘露寡糖缀合物抗原结构明确，反应效率高，合成反应的重现性好，能够很好的克服现有技术中糖疫苗制备质量控制难度大的技术缺陷。
第二方面，本发明还提供第一方面所述肌醇甘露寡糖缀合物的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：将寡糖活化获得寡糖的单酰活化酯，再与免疫载体偶联得到所述肌醇甘露寡糖缀合物。
本发明第三方面，提供第一方面所述肌醇甘露寡糖缀合物在制备抗结核疫苗领域的应用。
本发明研究证实，所述肌醇甘露寡糖缀合物作为抗结核疫苗，注射量低，而引发机体产生的抗体总滴度具有显著的提高，并且抗体类型以IgG1和IgG2b为主，属于T细胞参与的免疫响应，能够使宿主细胞产生长久的免疫记忆。基于该技术效果可以推知，采用所述肌醇甘露寡糖缀合物作为结核疫苗具有长久有效的免疫作用，对小孩和成人都可以具有良好的预防效果，克服传统结核疫苗的不足。
本发明第四方面，提供一种抗结核疫苗，所述抗结核疫苗中包括第一方面所述肌醇甘露寡糖缀合物。
本发明第五方面，提供一种结核病的预防方法，所述预防方法包括向需要预防结核的个体中注射第一方面所述肌醇甘露寡糖缀合物。
以上一个或多个技术方案的有益效果是：
本发明提出了一种预防结核病的新型肌醇甘露寡糖缀合物及其制备方法，相对于天然细菌多糖，本发明所述的LM寡糖经化学合成制备，其结构明确并且组分单一，提高了糖缀合物疫苗的质量可控性；同时LM寡糖中含有甘露糖链以及LM还原端的2,6-双甘露糖化肌醇结构，基于此类寡糖制备的糖缀合物疫苗，结构新颖，尚未见文献报道；此外，本发明所述的糖缀合物疫苗在动物实验中表现出较好的免疫活性，有望对成人和婴幼儿均产生较好的免疫保护作用，以改善卡介苗保护效果不佳的现状，具有广阔的应用前景。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为实施例1中LM-KLH糖蛋白缀合物的免疫原性抗体滴度图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，针对现有技术中存在的不足，为了解决如上的技术问题，本发明提出了一种基于结核杆菌表面脂甘露聚糖分子结构设计的糖蛋白缀合物，作为抗结核糖疫苗具有良好的免疫原性。
本发明第一方面，提供一种肌醇甘露寡糖缀合物，所述肌醇甘露糖缀合物包括如下式(Ⅰ)所示结构：
所述m、n或r为整数。
优选的，所述m为1-8中的任意一个整数。
优选的，所述n为2-15中的任意一个整数。
优选的，所述r为3-25中的任意一个整数。
优选的，所述免疫载体为具有免疫抗原性的蛋白或糖脂，进一步具体的，所述免疫载体选自人血清白蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白(KLH)、白喉毒素、白喉毒素无毒突变体、破伤风毒素/类毒素、霍乱毒素/类毒素、百日咳毒素/类毒素、乙肝表面抗原、乙肝核心抗原、肺炎球菌表面蛋白A、肺炎球菌粘附素蛋白、肺炎球菌溶血素或单磷酰类酯A中的一种。
在上述优选技术方案的具体实施方式中，所述免疫载体可依据连接难度、载糖率等因素进行选择。
第二方面，本发明还提供第一方面所述肌醇甘露寡糖缀合物的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：将寡糖活化获得寡糖的单酰活化酯，再与免疫载体偶联得到所述肌醇甘露寡糖缀合物。
优选的，所述寡糖与免疫载体通过交联剂进行连接，所述交联剂为包含双酯基结构的化合物。
进一步优选的，所述交联剂为双琥珀酰亚胺戊二酸酯(DSG)或3,4-二乙氧基-3-环丁烯-1,2-二酮。
当交联剂采用DSG时，所述制备方法的一些具体实施方式中，所述制备方法流程如下式所示：
优选的，所述制备方法具体步骤如下：
将所述寡糖与交联剂置于偶联溶剂中反应得到寡糖的单酰活化酯，去除溶剂分离得到寡糖的单酰活化酯，将寡糖的单酰活化酯与免疫载体溶于缓冲盐溶液中进行偶联反应。
进一步优选的，所述偶联溶剂为二甲基甲酰胺(DMF)和PBS缓冲溶液。
在一些具体的实施方式中，所述PBS缓冲溶液pH＝7.8～8.2，浓度为0.08～0.12M。
在一些具体的实施方式中，所述二甲基甲酰胺(DMF)和PBS缓冲溶液中，DMF:PBS体积比为4:0.8～1.2。
进一步优选的，所述寡糖与交联剂置于偶联溶剂中反应时间为4～8个小时，反应温度为室温条件。
进一步优选的，所述去除溶剂分离得到寡糖的单酰活化酯的具体操作如下：通过蒸馏的方式去除溶剂，向反应体系中加入乙酸乙酯析出白色固体，过滤并洗涤该白色固体即为寡糖的单酰活化酯。
进一步优选的，所述缓冲盐溶液为PBS缓冲溶液。
进一步优选的，所述偶联反应时间为4～6天。
进一步优选的，所述偶联反应温度为室温条件。
进一步优选的，所述偶联反应还包括通过分子筛、透析等纯化步骤。
本发明第三方面，提供第一方面所述肌醇甘露寡糖缀合物在制备抗结核疫苗领域的应用。
优选的，所述抗结核疫苗包括具有预防或治疗作用的抗结核药物。
进一步优选的，所述具有治疗作用的抗结核药物中，所述肌醇甘露寡糖缀合物作为一种增强机体免疫能力的活性物质，可依据本领域常规研究思路，与抗菌、抗炎等药物联合使用。
在上述抗结核药物的具体实施方式中，所述抗菌药物为抗结核杆菌药物包括但不限于异烟肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、链霉素等。
在上述抗结核疫苗的具体实施方式中，所述肌醇甘露寡糖缀合物的含量占药物活性成分总量的1～99％，或50～99％、1～50％、30～70％。
本发明第四方面，提供一种抗结核疫苗，所述抗结核疫苗中包括第一方面所述肌醇甘露寡糖缀合物。
优选的，所述抗结核疫苗为一种注射剂，进一步优选的，为皮下注射剂、肌肉注射剂或静脉注射剂。
在上述注射剂的具体实施方案中，所述抗结核疫苗中还包括注射佐剂或其他药学上所必需的辅料。
优选的，所述抗结核疫苗为一种联合疫苗，是一种肌醇甘露寡糖缀合物与其他抗结核疫苗或抗其他类型病原体疫苗的联合制剂。
优选的，所述抗结核疫苗应用目标为人体或动物；所述人体包括成人及幼儿；由于结核疾病是一种人畜共患的疾病，本发明提供的抗结核疫苗还可应用于家畜养殖业的结核疾病防治。
本发明第五方面，提供一种结核病的预防方法，所述预防方法包括向需要预防结核的个体中注射第一方面所述肌醇甘露寡糖缀合物。
优选的，所述预防方法包括向待预防个体中注射第四方面所述抗结核疫苗。
为了充分说明本发明的制备思路，下面结合具体实施例对本方案的过程进行描述，实施例仅供举例说明，不应被解释或理解为对本发明保护限制，此外，本发明所有试验材料如无特殊说明均为市售购买产品。
实施例1 LM-KLH的合成及免疫原活性
本实施例中，提供一种LM伪十糖的糖蛋白缀合物制备方法及免疫抗原活性，所述LM伪十糖结构如下式1所示，由糖类化学定制合成公司合成。
一、寡糖半抗原的活化
将LM伪十糖1(8.0毫克)和双琥珀酰亚胺戊二酸酯(DSG，22.7毫克)溶解于DMF和PBS磷酸盐缓冲液(pH＝8.0，浓度0.1M)的混合溶液中(1毫升,DMF:PBS＝4:1)，反应液室温搅拌6小时，高真空度减压蒸馏除去溶剂，加入乙酸乙酯析出白色固体，过滤，乙酸乙酯搅洗该固体去除残留的双琥珀酰亚胺戊二酸酯，过滤，真空干燥，得到活化的LM伪十糖2(7.5毫克)，收率84％，反应如下式所示：
二、糖蛋白缀合物的合成
按照35:1的摩尔比取活化LM伪十糖2(6毫克)和载体蛋白(KLH)，溶解于PBS磷酸盐缓冲液(pH＝8.0，浓度0.1M，0.5毫升)，室温搅拌5天，通过分子筛柱(Biogel A 0.5，PBS缓冲液为洗脱剂)除去未反应的小分子杂质，收集所得样品用透析法(蒸馏水为透析液)纯化去除无机盐，水溶液冻干，得到白色粉末状糖蛋白LM-KLH，反应如下式所示：
三、LM-KLH糖蛋白缀合物中载糖量测定
以硫酸-苯酚法(参考方法：医药导报，2008,12,1511)测定得LM-KLH载糖量为8.5％。
四、LM-KLH糖蛋白缀合物的免疫活性抗体滴度测定
LM-KLH糖蛋白缀合物的免疫活性测试在小鼠(Balb/c，雌性，每组6只)体内进行，免疫方式为对实验小鼠进行皮下注射，每只小鼠每次注射含3微克寡糖的糖蛋白缀合物，同时辅以Titermax Gold佐剂，分别在第1、15、22和29天进行注射免疫，分别在免疫前第0天和最后一次免疫后的第30天取血制备抗体血清，以LM-BSA糖蛋白作为固定抗原，以酶联免疫吸附试验(ELISA)检测特异性抗体滴度，结果见图1。
小鼠经LM-KLH糖蛋白免疫后，血液中的抗体总滴度显著增高，并且IgG1和IgG2b抗体滴度在总抗中占比较高，说明LM-KLH糖蛋白诱导小鼠产生的免疫响应主要是IgG型，即T细胞参与的免疫响应，该响应能够使宿主细胞产生长久免疫记忆，进而起到抗结核杆菌感染的作用。上述动物免疫实验表明LM-KLH缀合物是一种非常有应用前景的预防结核病的糖蛋白疫苗。
实施例2 LM-BSA糖蛋白缀合物的合成
一、LM-BSA糖蛋白缀合物的合成
以实施例1中所述活化的LM伪十糖2制备LM-BSA糖蛋白缀合物。按照35:1的摩尔比取活化LM伪十糖2(6毫克)和载体蛋白(BSA)，溶解于PBS磷酸盐缓冲液(pH＝8.0，浓度0.1M，0.5毫升)，室温搅拌5天，通过分子筛柱(Biogel A 0.5，PBS缓冲液为洗脱剂)除去未反应的小分子杂质，收集所得样品用透析法(蒸馏水为透析液)纯化去除无机盐，水溶液冻干，得到白色粉末状糖蛋白LM-BSA，反应如下式所示：
二、LM-KLH糖蛋白缀合物中载糖量测定
以硫酸-苯酚法(参考方法：医药导报，2008,12,1511)测定得LM-BSA载糖量为8.2％。
实施例3 LM-CRM197缀合物的制备
以实施例1中所述活化的LM伪十糖2制备LM-BSA糖蛋白缀合物。按照35:1的摩尔比取活化LM伪十糖2(6毫克)和载体蛋白(CRM197)，溶解于PBS磷酸盐缓冲液(pH＝8.0，浓度0.1M，0.5毫升)，室温搅拌5天，通过分子筛柱(Biogel A 0.5，PBS缓冲液为洗脱剂)除去未反应的小分子杂质，收集所得样品用透析法(蒸馏水为透析液)纯化去除无机盐，水溶液冻干，得到白色粉末状糖蛋白LM-CRM197，反应如下式所示：
实施例4
本实施例中，提供一种LM十二糖制备的LM-KLH糖蛋白缀合物制备过程，采用DSG作为交联剂，制备条件与实施例1相同，所述制备流程如下式所示：
实施例5
本实施例中，提供一种LM十四糖制备的LM-KLH糖蛋白缀合物制备过程，采用DSG作为交联剂，制备条件与实施例1相同，所述制备流程如下式所示：
实施例6
本实施例中，提供一种抗结核疫苗，所述抗结核疫苗包括实施例1中所述糖蛋白LM-KLH、注射溶媒及注射佐剂；所述注射佐剂为Titermax Gold佐剂。
在本实施例的一些常规替代方案中，所述注射佐剂还包括弗氏完全佐剂(FCA)或弗氏不完全佐剂(FIA)。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。