一种新型cDNA文库的制备
阅读说明：本技术 一种新型cDNA文库的制备 (Preparation of novel cDNA library ) 是由 朱也 曾繁丽 柳曹枝 于 2021-07-14 设计创作，主要内容包括：本发明涉及cDNA文库技术领域,且公开了一种新型cDNA文库的制备,将组织碎片和变性裂解液装入容量瓶中密封,再将其放入冰水中浸泡8min后取出,之后将容量瓶放入离心机中高速匀浆,离心速率为20-40秒/次,之后取出容量管,加入乙酸钠和氯仿混合后密封,再将其放入冰水中浸泡8min后取出,之后再放入离心机中离心20-40min,之后静置沉淀通过移液管转移容量管上层液体,在容量瓶中加入核酸酶抑制剂充分溶解RNA沉淀；添加两轮消减杂交及两步PCR,使Tester中代表差异表达基因的cDNA片段得到大量扩增,同时抑制了非特异性cDNA片段的扩增,使各种消减文库的特异性得到极大地提高单链Tester cDNA的均等化过程,使高、低丰度的差异表达基因都能有效分离。(The invention relates to the technical field of cDNA libraries, and discloses a preparation method of a novel cDNA library, which comprises the steps of filling tissue fragments and denatured lysate into a volumetric flask, sealing, soaking the volumetric flask in ice water for 8min, taking out, putting the volumetric flask into a centrifuge, homogenizing at a high speed, wherein the centrifugation speed is 20-40 seconds/time, taking out a volumetric flask, adding sodium acetate and chloroform, mixing, sealing, soaking the volumetric flask in ice water for 8min, taking out, putting the volumetric flask into the centrifuge, centrifuging for 20-40min, standing and precipitating, transferring upper-layer liquid of the volumetric flask through a pipette, and adding a nuclease inhibitor into the volumetric flask to fully dissolve RNA precipitate; two rounds of subtractive hybridization and two-step PCR are added to amplify a great amount of cDNA fragments representing differentially expressed genes in the Tester, and simultaneously inhibit the amplification of non-specific cDNA fragments, so that the specificity of various subtractive libraries is greatly improved in the equalization process of single-chain Tester cDNA, and the differentially expressed genes with high and low abundance can be effectively separated.)
技术领域
本发明涉及cDNA文库技术领域，具体为一种新型cDNA文库的制备。
背景技术
cDNA文库是指某生物某一发育时期所转录的mRNA全部经反转录形成的 cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合，具有组织或细胞特异性。 cDNA文库便于克隆和大量扩增，可以从中筛选到所需目的基因，但是传统的制备方法一般利用羟基磷灰石柱层析的方法分离杂交单体，这种技术存在着操作复杂，周期长，核酸损失量大等缺点。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种新型cDNA文库的制备，具备化了实验程序，减少了杂交体的损失量等优点，解决了操作复杂，周期长，核酸损失量大的问题。
(二)技术方案
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种新型cDNA文库的制备，所用试剂由以下重量份数组成：
DEPC水1000ml；
10％肌氨酸钠100ml；
变性裂解液250ml；
2M醋酸钠50ml；
3M醋酸钠100ml；
0.5M EDTA100ml；
10X MOPS 1L；
4x RNA Loading buffer1000ml；
变性电泳胶50ml；
变性电泳缓冲液250ml。
根据上述的一种新型cDNA文库的制备，提出一种新型cDNA文库的制备方法，包括以下步骤：
S1：准备离心管、移液管、量筒、容量瓶、药匙和试剂瓶，将研钵、移液管、量筒、容量瓶、药匙和试剂瓶用锡纸包裹后放入烤箱焙烤5h，之后将其放入0.1％焦碳酸二乙酯水浸泡过夜；
S2：将组织碎片和变性裂解液装入容量瓶中密封，再将其放入冰水中浸泡8min后取出，之后将容量瓶放入离心机中高速匀浆，离心速率为20-40秒 /次，之后取出容量管，加入乙酸钠和氯仿混合后密封，再将其放入冰水中浸泡8min后取出，之后再放入离心机中离心20-40min，之后静置沉淀通过移液管转移容量管上层液体，重复上述步骤直至容量瓶中没有乙醇气味，在容量瓶中加入核酸酶抑制剂充分溶解RNA沉淀，最后放入－80°的冰箱中保存；
S3：通过移液管从S2中容量瓶中取出RNA放入离心管中，之后添加无霉无菌水，之后加入适当体积的OBB Buffer和Oligotex Suspension混合密封，取出离心管放入70°的水中加热3min，之后在离心管中加入经过生物素标记的寡脱氧胸苷酸引物和以链霉亲和素包被的磁性球珠，之后通过磁分离器从低盐缓冲液分离出磁性球珠，再加入洗脱缓冲液，重复磁性分离步骤，得到 mRNA溶液；
S4：在S3中的mRNA溶液中加入反转录酶离心后获得第一cRNA链，取2ul 第一cRNA链加入DNA聚合酶、脱氧核糖核苷酸三磷酸、双蒸水、异柠檬酸脱氢酶和大肠杆菌DNA连接酶混合后在20°的环境中反应2.5h，得到第二cRNA 链，在第二链反应体系中，顺序加入10mMdNTP、T4 DNA Polymerase和BSA，灭活后加入等体积氯仿振荡离心，连接反应完成后，将反应体系70℃放置15 分钟灭活T4 DNA Ligase，然后加入Xho 10×Buffer、BSA和双蒸水，反应1.5小时后65℃灭活酶10分钟获得合成的双链cRNA；
S5：通过质粒和噬菌体载体制作克隆RNA的载体，载体去磷酸化后依次加入ddH2O、T4 ligase 10x buffer、PBK(E/X)vector、cDNA、T4 DNA ligase 和Total在14℃的环境中，连接载体和双链cRNA；
S6：取适量PCR薄壁管，置于冰上，按以下体系依次加入：10xbuffer、 Mgcl2、DNTP、T3引物、T7引物、Taq酶、双蒸水和total之后离心沉淀底，置于PCR仪上待PCR反应进入4℃后，取下PCR薄壁管，取7ulPCR产物加入3ul溴芬兰跑电泳，同时上1Kb DNA ladder半小时后照相，观察胶图进行cRNA 文库的检测。
(三)有益效果
与现有技术相比，本发明提供了一种新型cDNA文库的制备，具备以下有益效果：
1、该一种新型cDNA文库的制备，通过添加两轮消减杂交及两步PCR，使 Tester中代表差异表达基因的cDNA片段得到大量扩增，同时抑制了非特异性 cDNA片段的扩增，使各种消减文库的特异性得到极大地提高单链 Tester cDNA的均等化过程，使高、低丰度的差异表达基因都能有效分离。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下面通过实施例对本发明做进一步的描述：
实施例一：
一种新型cDNA文库的制备，所用试剂由以下重量份数组成：DEPC水、10％肌氨酸钠、变性裂解液、2M醋酸钠、3M醋酸钠、0.5M EDTA、10X MOPS、4x RNA Loading buffer1、变性电泳胶、变性电泳缓冲液。
根据上述的一种新型cDNA文库的制备，先提出一种新型cDNA文库的制备方法，包括以下步骤：
S1：准备以下重量份数的试剂：DEPC水1000ml、10％肌氨酸钠100ml、变性裂解液250ml、2M醋酸钠50ml、3M醋酸钠100ml、0.5M EDTA100ml、10X MOPS 1L、4x RNA Loadingbuffer1000ml、变性电泳胶50ml、变性电泳缓冲液 250ml；
S2：准备离心管、移液管、量筒、容量瓶、药匙和试剂瓶，将研钵、移液管、量筒、容量瓶、药匙和试剂瓶用锡纸包裹后放入烤箱焙烤5h，之后将其放入0.1％焦碳酸二乙酯水浸泡过夜；
S3：将组织碎片和变性裂解液装入容量瓶中密封，再将其放入冰水中浸泡8min后取出，之后将容量瓶放入离心机中高速匀浆，离心速率为20-40秒 /次，之后取出容量管，加入乙酸钠和氯仿混合后密封，再将其放入冰水中浸泡8min后取出，之后再放入离心机中离心20-40min，之后静置沉淀通过移液管转移容量管上层液体，重复上述步骤直至容量瓶中没有乙醇气味，在容量瓶中加入核酸酶抑制剂充分溶解RNA沉淀，最后放入－80°的冰箱中保存；
S4：通过移液管从S2中容量瓶中取出RNA放入离心管中，之后添加无霉无菌水，之后加入适当体积的OBB Buffer和Oligotex Suspension混合密封，取出离心管放入70°的水中加热3min，之后在离心管中加入经过生物素标记的寡脱氧胸苷酸引物和以链霉亲和素包被的磁性球珠，之后通过磁分离器从低盐缓冲液分离出磁性球珠，再加入洗脱缓冲液，重复磁性分离步骤，得到 mRNA溶液；
S5：在S3中的mRNA溶液中加入反转录酶离心后获得第一cRNA链，取2ul 第一cRNA链加入DNA聚合酶、脱氧核糖核苷酸三磷酸、双蒸水、异柠檬酸脱氢酶和大肠杆菌DNA连接酶混合后在20°的环境中反应2.5h，得到第二cRNA 链，在第二链反应体系中，顺序加入10mMdNTP、T4 DNA Polymerase和BSA，灭活后加入等体积氯仿振荡离心，连接反应完成后，将反应体系70℃放置15 分钟灭活T4 DNA Ligase，然后加入Xho 10×Buffer、BSA和双蒸水，反应 1.5小时后65℃灭活酶10分钟获得合成的双链cRNA；
S6：通过质粒和噬菌体载体制作克隆RNA的载体，载体去磷酸化后依次加入ddH2O、T4 ligase 10x buffer、PBK(E/X)vector、cDNA、T4 DNA ligase 和Total在14℃的环境中，连接载体和双链cRNA；
S7：取适量PCR薄壁管，置于冰上，按以下体系依次加入：10xbuffer、 Mgcl2、DNTP、T3引物、T7引物、Taq酶、双蒸水和total之后离心沉淀底，置于PCR仪上待PCR反应进入4℃后，取下PCR薄壁管，取7ulPCR产物加入 3ul溴芬兰跑电泳，同时上1Kb DNA ladder半小时后照相，观察胶图进行cRNA 文库的检测。
实施例二：
一种新型cDNA文库的制备，所用试剂由以下重量份数组成：DEPC水、10％肌氨酸钠、变性裂解液、2M醋酸钠、3M醋酸钠、0.5M EDTA、10X MOPS、4x RNA Loading buffer1、变性电泳胶、变性电泳缓冲液。
根据上述的一种新型cDNA文库的制备，先提出一种新型cDNA文库的制备方法，包括以下步骤：
S1：准备以下重量份数的试剂：DEPC水500ml、10％肌氨酸钠50ml、变性裂解液125ml、2M醋酸钠25ml、3M醋酸钠50ml、0.5M EDTA20ml、10X MOPS 0.5L、4x RNA Loadingbuffer500ml、变性电泳胶25ml、变性电泳缓冲液 125ml；
S2：准备离心管、移液管、量筒、容量瓶、药匙和试剂瓶，将研钵、移液管、量筒、容量瓶、药匙和试剂瓶用锡纸包裹后放入烤箱焙烤5h，之后将其放入0.1％焦碳酸二乙酯水浸泡过夜；
S3：将组织碎片和变性裂解液装入容量瓶中密封，再将其放入冰水中浸泡8min后取出，之后将容量瓶放入离心机中高速匀浆，离心速率为20-40秒 /次，之后取出容量管，加入乙酸钠和氯仿混合后密封，再将其放入冰水中浸泡8min后取出，之后再放入离心机中离心20-40min，之后静置沉淀通过移液管转移容量管上层液体，重复上述步骤直至容量瓶中没有乙醇气味，在容量瓶中加入核酸酶抑制剂充分溶解RNA沉淀，最后放入－80°的冰箱中保存；
S4：通过移液管从S2中容量瓶中取出RNA放入离心管中，之后添加无霉无菌水，之后加入适当体积的OBB Buffer和Oligotex Suspension混合密封，取出离心管放入70°的水中加热3min，之后在离心管中加入经过生物素标记的寡脱氧胸苷酸引物和以链霉亲和素包被的磁性球珠，之后通过磁分离器从低盐缓冲液分离出磁性球珠，再加入洗脱缓冲液，重复磁性分离步骤，得到 mRNA溶液；
S5：在S3中的mRNA溶液中加入反转录酶离心后获得第一cRNA链，取2ul 第一cRNA链加入DNA聚合酶、脱氧核糖核苷酸三磷酸、双蒸水、异柠檬酸脱氢酶和大肠杆菌DNA连接酶混合后在20°的环境中反应2.5h，得到第二cRNA 链，在第二链反应体系中，顺序加入10mMdNTP、T4 DNA Polymerase和BSA，灭活后加入等体积氯仿振荡离心，连接反应完成后，将反应体系70℃放置15 分钟灭活T4 DNA Ligase，然后加入Xho 10×Buffer、BSA和双蒸水，反应 1.5小时后65℃灭活酶10分钟获得合成的双链cRNA；
S6：通过质粒和噬菌体载体制作克隆RNA的载体，载体去磷酸化后依次加入ddH2O、T4 ligase 10x buffer、PBK(E/X)vector、cDNA、T4 DNA ligase 和Total在14℃的环境中，连接载体和双链cRNA；
S7：取适量PCR薄壁管，置于冰上，按以下体系依次加入：10xbuffer、 Mgcl2、DNTP、T3引物、T7引物、Taq酶、双蒸水和total之后离心沉淀底，置于PCR仪上待PCR反应进入4℃后，取下PCR薄壁管，取7ulPCR产物加入3ul溴芬兰跑电泳，同时上1Kb DNA ladder半小时后照相，观察胶图进行cRNA 文库的检测。
实施例三：
一种新型cDNA文库的制备，所用试剂由以下重量份数组成：DEPC水、10％肌氨酸钠、变性裂解液、2M醋酸钠、3M醋酸钠、0.5M EDTA、10X MOPS、4x RNA Loading buffer1、变性电泳胶、变性电泳缓冲液。
根据上述的一种新型cDNA文库的制备，先提出一种新型cDNA文库的制备方法，包括以下步骤：
S1：准备以下重量份数的试剂：DEPC水750ml、10％肌氨酸钠75ml、变性裂解液225ml、2M醋酸钠37.5ml、3M醋酸钠75ml、0.5M EDTA75ml、10X MOPS 0.75L、4x RNA Loadingbuffer750ml、变性电泳胶37.5ml、变性电泳缓冲液175ml；
S2：准备离心管、移液管、量筒、容量瓶、药匙和试剂瓶，将研钵、移液管、量筒、容量瓶、药匙和试剂瓶用锡纸包裹后放入烤箱焙烤5h，之后将其放入0.1％焦碳酸二乙酯水浸泡过夜；
S3：将组织碎片和变性裂解液装入容量瓶中密封，再将其放入冰水中浸泡8min后取出，之后将容量瓶放入离心机中高速匀浆，离心速率为20-40秒 /次，之后取出容量管，加入乙酸钠和氯仿混合后密封，再将其放入冰水中浸泡8min后取出，之后再放入离心机中离心20-40min，之后静置沉淀通过移液管转移容量管上层液体，重复上述步骤直至容量瓶中没有乙醇气味，在容量瓶中加入核酸酶抑制剂充分溶解RNA沉淀，最后放入－80°的冰箱中保存；
S4：通过移液管从S2中容量瓶中取出RNA放入离心管中，之后添加无霉无菌水，之后加入适当体积的OBB Buffer和Oligotex Suspension混合密封，取出离心管放入70°的水中加热3min，之后在离心管中加入经过生物素标记的寡脱氧胸苷酸引物和以链霉亲和素包被的磁性球珠，之后通过磁分离器从低盐缓冲液分离出磁性球珠，再加入洗脱缓冲液，重复磁性分离步骤，得到 mRNA溶液；
S5：在S3中的mRNA溶液中加入反转录酶离心后获得第一cRNA链，取2ul 第一cRNA链加入DNA聚合酶、脱氧核糖核苷酸三磷酸、双蒸水、异柠檬酸脱氢酶和大肠杆菌DNA连接酶混合后在20°的环境中反应2.5h，得到第二cRNA 链，在第二链反应体系中，顺序加入10mMdNTP、T4 DNA Polymerase和BSA，灭活后加入等体积氯仿振荡离心，连接反应完成后，将反应体系70℃放置15 分钟灭活T4 DNA Ligase，然后加入Xho 10×Buffer、BSA和双蒸水，反应 1.5小时后65℃灭活酶10分钟获得合成的双链cRNA；
S6：通过质粒和噬菌体载体制作克隆RNA的载体，载体去磷酸化后依次加入ddH2O、T4 ligase 10x buffer、PBK(E/X)vector、cDNA、T4 DNA ligase 和Total在14℃的环境中，连接载体和双链cRNA；
S7：取适量PCR薄壁管，置于冰上，按以下体系依次加入：10xbuffer、 Mgcl2、DNTP、T3引物、T7引物、Taq酶、双蒸水和total之后离心沉淀底，置于PCR仪上待PCR反应进入4℃后，取下PCR薄壁管，取7ulPCR产物加入 3ul溴芬兰跑电泳，同时上1Kb DNA ladder半小时后照相，观察胶图进行cRNA 文库的检测。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
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