一种改造的人源糖基转移酶、制备方法及应用
阅读说明：本技术 一种改造的人源糖基转移酶、制备方法及应用 (Modified human glycosyltransferase, preparation method and application ) 是由 苏延停 杨秀怡 邓梦雪 李准洁 祝贺 刘武 于 2021-09-14 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种改造的人源糖基转移酶、制备方法及应用。属于生物技术领域。通过去除人源C1GALT1的转移酶膜结合结构域,得到改造蛋白C1GalT1-1。糖结合实验显示,原核表达的C1GalT1-1突变体保持了结合O-GalNAc类型修饰,对其他糖基化修饰并不结合。单糖封闭实验显示,经过GalNAc单糖孵育后,C1GalT1的活性完全被抑制,因此本发明改造蛋白在识别和大规模鉴定O-GalNAc糖基化修饰具有更大的应用潜力。(The invention discloses a modified humanized glycosyltransferase, a preparation method and application thereof. Belongs to the field of biotechnology. The engineered protein C1GalT1-1 was obtained by removing the transferase membrane-binding domain of human C1GALT 1. Carbohydrate binding experiments showed that the prokaryotically expressed C1GalT1-1 mutant retained binding to O-GalNAc type modifications and did not bind to other glycosylation modifications. Monosaccharide blocking experiments show that after incubation of GalNAc monosaccharide, the activity of C1GalT1 is completely inhibited, so that the modified protein has greater application potential in recognition and large-scale identification of O-GalNAc glycosylation modification.)
技术领域
本发明属于生物科技技术领域，涉及一种改造的人源糖基转移酶、制备方法及应用。
背景技术
糖基转移酶是广泛存在于内质网和高尔基体内的一大类酶类，参与体内重要的活性物质如糖蛋白和糖脂中糖链的合成。其作用是把相应的活性供体(通常是二磷酸核苷NDP-糖)的单糖部分转移至糖、蛋白质、脂类和核酸等，完成后者的糖基化加工实现其生物学功能。目前已经发现了超过上百种糖基转移酶，合成了超过7000种复杂的糖结构，细胞内大部分蛋白都会被糖基化修饰，现在已经发现糖基化修饰参与各种生物过程，调控基本生理活动。
O-GalNAc(N-乙酰半乳糖胺)修饰是大多数O-连接糖基化修饰(除去O-GlcNAc(N-乙酰葡萄糖胺)修饰)的第一步修饰，主要发生在高尔基体内，有20多种糖基转移酶可以完成这一步，通过糖基转移酶ppGalNAc-Ts将底物UDP-GalNAc共价连接到蛋白的丝氨酸或苏氨酸上，首次发现于1969年。正常生理情况下，O-连接糖基化一般会继续延伸，通过半乳糖糖基转移酶C1GalT1在GalNAc单糖后面添加一个半乳糖。但是C1GalT1并不能单独完成加糖过程，必须其专门的分子伴侣Cosmc帮助下可以在O-GalNAc修饰后面转移一个半乳糖。O-GalNAc修饰之前一直被认为合成起始于高尔基体中，大部分分泌到细胞外，有部分存在于肿瘤细胞的表面，特别是一些mucin类型的糖蛋。但是最近有文章报道，在细胞核中同样发现了大量的O-GalNAc修饰的信号，并且在细胞核中成功鉴定到了ppGalNAc-T3糖基转移酶。
传统的观点认为O-GalNAc修饰主要发生分泌途径中，主要修饰的靶蛋白为分泌蛋白和膜蛋白。因此O-GalNAc修饰的功能研究目前主要集中膜蛋白和一些体液例如血清中的糖蛋白的功能，因为和肿瘤密切相关，O-GalNAc修饰也叫肿瘤相关抗原即Tn抗原。目前已经有几种Tn抗原阳性的糖蛋白例如黏蛋白CA15-3(MUC1)和CA125(MUC16)在临床上已经用于多种恶性肿瘤的诊断和预后跟踪，例如肺癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌和卵巢癌等，Tn抗原表达的上升一般预示着肿瘤恶性程度的增加和预后不良。在乳腺癌中，高表达的Tn抗原可以通过招募Galectin-3和MUC1使肿瘤细胞能够吸附在内皮细胞上，从而促进了肿瘤细胞的转移。然而Tn抗原在肿瘤发展中到底扮演着什么样的角色，目前仍然不是很清楚。
目前已经有很多工具用于去识别O-GalNAc修饰，其中凝集素仍然是广泛用于检测和结合O-GalNAc修饰的工具，例如凝集素VVL、TL2、MPL、DBA和Ricin等，这些凝集素大多来源于植物和真菌。这些报道识别O-GalNAc修饰的凝集素都是由二聚体或者四聚体通过非共价连接，特异性不专一，会结合其他的单糖例如galactose末端糖结构。综合而言，目前并没有一个对O-GalNAc修饰十分特异的凝集素，识别工具的缺乏也导致了对O-GalNAc修饰的研究十分困难。
除了凝集素外，有课题组发现糖加工的酶也有结合糖蛋白的能力，通过敲除酶的催化活性位点，让其保留对糖结合的能力，从而用于去识别糖基化修饰。例如有文章对来源于细菌的O-GlcNAc糖苷水解酶CpOGA进行改造，突变了其催化活性位点，结果显示改造后的CpOGA失去了切除O-GlcNAc修饰的活性，但是保留了结合O-GlcNAc修饰的糖结合活性，改造后的CpOGA已经在很多复杂样品对O-GlcNAc修饰都有很好的富集效果。鉴于CpOGA改造的成功，为了研发识别O-GalNAc修饰的识别工具，很有必要对O-GlcNAc修饰延伸的糖基转移酶C1GalT1进行改造，从而筛选出对O-GalNAc修饰的特异性结合的工具，推动O-GalNAc修饰的功能研究。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种改造的人源糖基转移酶。
可通过下列技术方案来实现：一种改造的人源糖基转移酶，其特征在于，通过去除人源C1GALT1的转移酶膜结合结构域,得到改造蛋白C1GalT1-1。
本发明抵第二个目的是提供改造的人源糖基转移酶的制备方法，可通过下列技术方案来实现：
一种改造的人源糖基转移酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将C1GalT1包含膜结合结构域的N端前29个氨基酸序列去掉，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，合成大肠杆菌密码子偏好的C1GalT1-1突变体基因；
2)构建C1GalT1-1突变体重组质粒：将C1GalT1-1突变体基因插入到载体pMal-c5x的Nde1和EcoR1限制酶切位点上；
3)构建含有C1GalT1-1突变体基因的重组表达菌株：将重组质粒转化到克隆菌DH5α中提取质粒，最后转化到表达菌BL21(DE3)中，形成BL21-C1alT1-1突变体基因；
4)糖基转移酶蛋白C1GalT1-1突变体的制备：将1L菌液4000rpm离心20min，去上清，用40mL 0.01M PBS将沉淀重悬混匀；超声破碎，功率为200W，破碎10s，停10s，共90次；破碎完毕后12000rpm离心20min收集上清蛋白样，过0.45μm滤膜除去不溶物；开始上样于预先已经用PBS平衡好的GalNAc-Sepharose 6B亲和层析柱，流速设置为1mL/min，上完样后，用PBS缓冲液洗涤柱子，洗去非特异性结合的杂蛋白，直到蛋白检测仪所测值不再变化，大约需要1h，最后用50mM GalNAc(用PBS配置)进行洗脱，收集洗脱峰，用ddH2O超滤，最后冻干，得到C1GalT1-1突变体蛋白。
本发明的第三个目的是提供一种改造的人源糖基转移酶的用途，即通过改造的人源糖基转移酶来鉴定以N-乙酰半乳糖胺为末端的糖结构。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的糖基转移酶蛋白C1GalT1-1突变体在ELISA试验结果表明，C1GalT1-1能够特异结合含有O-GalNAc修饰的mucin糖蛋白，对其他糖蛋白并不结合。因此C1GalT1-1突变体在识别O-GalNAc修饰方面具有很大的应用潜力。
附图说明
图1为改造C1GalT1的改造路线。
图2为C1GalT1-1突变体经过GalNAc偶联的层析柱纯化后的SDS-PAGE图。
图3为C1GalT1-1突变体对不同标准糖蛋白的结合结果。
图4为C1GalT1-1作为糖识别工具对细胞中的O-GalNAc修饰鉴定结果。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
本实验所涉及的分子生物学方法为常规方法，为本领域人员所熟知。本发明中未详细阐述的内容请参见《分子克隆实验指南》，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔等主编。
【实施例1】C1GalT1的基因改造
根据Uniprot数据库提供的C1GalT1的结构，为了增加可溶性表达，并且不影响C1GalT1的糖结合活性，所述改造的C1GalT1-1突变体是将C1GalT1包含膜结合结构域的N端前29个氨基酸序列去掉，技术策略如图一,所有改造的基因序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
【实施例2】C1GalT1-1突变体的克隆与表达
将C1GalT1-1突变体基因通过Nde1和EcoR1限制酶切位点插入到pMal-c5x上，将重组质粒转化到克隆菌DH5α中提取质粒，最后转化到表达菌BL21(DE3)中，挑取单克隆在1mLLB培养基中过夜扩大培养，然后以1:100比例将表达菌转入到10mL新鲜的LB培养基中培养7h，随后转入到1L LB培养基培养3h使表达菌生长到对数期即OD值达到0.6-1.0，最后经1mMIPTG 20℃诱导表达12h。
【实施例3】C1GalT1-1突变体的分离纯化
将1L菌液4000rpm离心20min，去上清，用40mL 0.01MPBS将沉淀重悬混匀。超声破碎，功率为200W，破碎10s，停10s，共90次。破碎完毕后12000rpm离心20min收集上清蛋白样，过0.45μm滤膜除去不溶物。开始上样于预先用PBS平衡好的GalNAc-Sepharose 6B亲和层析柱，流速设置为1mL/min，上完样后，用PBS缓冲液洗涤柱子，洗去非特异性结合的杂蛋白，直到蛋白检测仪所测值不再变化，大约需要1h，最后用50mM GalNAc(用PBS配置)进行洗脱，收集洗脱峰，用ddH2O超滤，最后冻干。结果得到大量改造的C1GalT1-1突变体蛋白。层析柱用ddH2O洗涤后用20％乙醇洗涤后保存。
【实施例4】C1GalT1-1突变体的ELISA检测
用包被液分别将Mucin，IgG，Transferin标准糖蛋白稀释至10ug/mL，每孔100μL，4℃包被过夜，吸出包被液，用1‰PBST(PBS缓冲液，1‰Tween 20)洗涤五次,用5％BSA室温封闭1.5h，开始孵育2μg/mL的Cgt1突变体蛋白溶液，随后室温孵育鼠MBP一抗(1：1000)1.5h，洗涤后室温孵育羊抗鼠二抗(1：5000)1h,1‰PBST洗涤五次，向每孔加入100μL TMB反应液避光显色，等蓝色信号出现时马上加入50μL 1mM盐酸终止反应，用酶标仪检测每孔在450nm的吸光值，结果如图3，C1GalT1-1突变体只结合含有O-GalNAc修饰的mucin蛋白，对其他糖基化例如GlcNAc末端和唾液酸末端N-连接糖基化修饰并不结合。
【实施例5】C1GalT1-1突变体对细胞中的O-GalNAc修饰鉴定结果
分别准备两组相同的HeLa和HepG2细胞全裂解液样品，同时制样，12％SDS-PAGE电泳，等marker的25kD条带接近板底部时，停止电源，开始转膜至PVDF膜上，随后用5％BSA封闭1h，一组室温孵育2μg/mL C1GalT1-1突变体蛋白溶液，另一组室温孵育提前混合旋转1h的2μg/mL C1GalT1-1突变体蛋白和50mM GalNAc的混合溶液1h，洗涤后均室温孵育鼠源GST一抗(1:2000)1h，随后用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗(1:5000)与之室温孵育1h，显影液反应后，暗室显影，结果如图4，结果显示C1GalT1-1可以结合细胞内的蛋白，同时GalNAc修饰可以成功封闭C1GalT1-1的结合，这些说明C1GalT1结合细胞裂解液中的蛋白依赖于其糖结合位点。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
序列表
<110> 湖北科技学院
<120> 一种改造的人源糖基转移酶、制备方法及应用
<141> 2021-09-13
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 1730
<212> PRT
<213> C1GALT1
<400> 2
Ser Ile Pro Ser Leu Pro Arg Thr Cys Gly Ala Leu Thr Met Ala Ser
1 5 10 15
Leu Ser Thr Leu Ala Pro Leu Thr Pro Leu Cys Gly Ser Ala Ile Gly
20 25 30
Pro Leu Leu Cys Ser Gly Leu Pro Ser Ile Leu Leu Gly Gly Leu Val
35 40 45
Ala Thr Gly Pro Ala Val Leu His Ala Ala Pro His Ala Ala His Ser
50 55 60
Ala Ala Ala Gly Gly Ala His Leu Gly Gly Gly Met Ala Pro Ala Ala
65 70 75 80
Ala Ser Ser Gly His Leu Ala Gly Ala Thr Ala Ile Ala Gly Ala Leu
85 90 95
Thr Gly Leu Val Ala Ile Leu Cys Thr Val Met Thr Gly Pro Gly Ala
100 105 110
Leu Gly Leu Leu Ala Leu His Val Leu Ala Thr Thr Ala Gly Ala Cys
115 120 125
Ala Leu Val Leu Pro Met Ser Ser Gly Gly Ala Leu Ala Pro Pro Ala
130 135 140
Val Gly Leu Leu Thr Leu Gly Gly Ala Ala Gly Leu Thr Thr Leu Thr
145 150 155 160
Ile Leu Ala Pro Gly Thr Val His Gly His Thr Leu Gly Ala Ala Ala
165 170 175
Thr Pro Leu Leu Ala Ala Ala Ala Thr Thr Val Ile Leu Ala Ala Leu
180 185 190
Ala Thr Leu Leu Ser Leu Thr Ala Pro Gly Gly Pro Ile Thr Pro Gly
195 200 205
Ala Ala Pro Leu Pro Thr Val Leu Gly Gly Thr Met Ser Gly Gly Ala
210 215 220
Gly Thr Val Leu Ser Leu Gly Ala Leu Leu Ala Pro Val Ala Ala Pro
225 230 235 240
Leu Thr Ala Leu Cys Thr His Ser Ser Ser Ile Gly Ala Leu Ala Leu
245 250 255
Gly Ala Cys Met Gly Ile Met Ala Val Gly Ala Gly Ala Ser Ala Ala
260 265 270
Thr Ile Gly Leu Gly Thr Pro His Pro Pro Val Pro Gly His His Leu
275 280 285
Ile Leu Gly Thr Leu Pro Ala Thr Pro Thr Thr Thr Ala Thr Ala Thr
290 295 300
Thr Pro Pro Val Gly Gly Pro Gly Cys Cys Ser Ala Leu Ala Val Ser
305 310 315 320
Pro His Thr Val Ala Ser Thr Thr Met Thr Gly Leu Gly Thr Leu Val
325 330 335
Thr His Leu Ala Pro Thr Gly Thr Leu Thr Ala Thr Gly Pro Thr Leu
340 345 350
Pro Gly Ala Ile Leu Leu Gly Ile Ser Gly Ala Ala Leu Ala Gly Ala
355 360 365
Thr Leu Val Leu Leu Gly Ala Pro Pro Arg Thr Cys Gly Ala Leu Thr
370 375 380
Ile Leu Leu Gly Gly Leu Val Ala Thr Gly Pro Ala Val Leu His Ala
385 390 395 400
Ala Pro His Ala Ala His Ser Ala Ala Ala Gly Gly Ala His Leu Gly
405 410 415
Gly Gly Met Ala Pro Ala Ala Ala Ser Ser Gly His Leu Ala Gly Ala
420 425 430
Thr Ala Ile Ala Gly Ala Leu Thr Gly Leu Val Ala Ile Leu Cys Thr
435 440 445
Val Met Thr Gly Pro Gly Ala Leu Gly Leu Leu Ala Leu His Val Leu
450 455 460
Ala Thr Thr Ala Gly Ala Cys Ala Leu Val Leu Pro Met Ser Ser Gly
465 470 475 480
Gly Ala Leu Ala Pro Pro Ala Val Gly Leu Leu Thr Leu Gly Gly Ala
485 490 495
Ala Gly Leu Thr Thr Leu Thr Ile Leu Ala Pro Gly Thr Val His Gly
500 505 510
His Thr Leu Gly Ala Ala Ala Thr Pro Leu Leu Ala Ala Ala Ala Thr
515 520 525
Thr Val Ile Leu Ala Ala Leu Ala Thr Leu Leu Ser Leu Thr Ala Pro
530 535 540
Gly Gly Pro Ile Thr Pro Gly Ala Ala Pro Leu Pro Thr Val Leu Gly
545 550 555 560
Gly Thr Met Ser Gly Gly Ala Gly Thr Val Leu Ser Leu Gly Ala Leu
565 570 575
Leu Ala Pro Val Ala Ala Pro Leu Thr Ala Leu Cys Thr His Ser Ser
580 585 590
Ser Ile Gly Ala Leu Ala Leu Gly Ala Cys Met Gly Ile Met Ala Val
595 600 605
Gly Ala Gly Ala Ser Ala Ala Thr Ile Gly Leu Gly Thr Pro His Pro
610 615 620
Pro Val Pro Gly His His Leu Ile Leu Gly Thr Leu Pro Ala Thr Pro
625 630 635 640
Thr Thr Thr Ala Thr Ala Thr Thr Pro Pro Val Gly Gly Pro Gly Cys
645 650 655
Cys Ser Ala Leu Ala Val Ser Pro His Thr Val Ala Ser Thr Thr Met
660 665 670
Thr Gly Leu Gly Thr Leu Val Thr His Leu Ala Pro Thr Gly Thr Leu
675 680 685
Thr Ala Thr Gly Pro Thr Leu Pro Gly Ala Ile Leu Leu Gly Ile Ser
690 695 700
Gly Ala Ala Leu Ala Gly Ala Thr Leu Val Leu Leu Gly Ala Pro Asp
705 710 715 720
Asn Ala Cys Gly Ala Leu Thr Ile Cys Thr Gly Cys Thr Gly Gly Gly
725 730 735
Thr Gly Ala Ala Ala Ala Ala Gly Thr Thr Gly Ala Thr Ala Cys Thr
740 745 750
Cys Ala Gly Cys Cys Thr Ala Ala Thr Gly Thr Thr Cys Thr Gly Cys
755 760 765
Ala Thr Ala Ala Thr Gly Ala Thr Cys Cys Thr Cys Ala Thr Gly Cys
770 775 780
Cys Cys Gly Thr Cys Ala Thr Thr Cys Ala Gly Ala Thr Gly Ala Thr
785 790 795 800
Ala Ala Cys Gly Gly Thr Cys Ala Gly Ala Ala Cys Cys Ala Thr Cys
805 810 815
Thr Gly Gly Ala Ala Gly Gly Thr Cys Ala Gly Ala Thr Gly Ala Ala
820 825 830
Thr Thr Thr Thr Ala Ala Thr Gly Cys Cys Gly Ala Thr Thr Cys Thr
835 840 845
Thr Cys Thr Cys Ala Gly Cys Ala Thr Ala Ala Ala Gly Ala Thr Gly
850 855 860
Ala Ala Ala Ala Cys Ala Cys Cys Gly Ala Thr Ala Thr Cys Gly Cys
865 870 875 880
Ala Gly Ala Ala Ala Ala Cys Cys Thr Gly Thr Ala Thr Cys Ala Gly
885 890 895
Ala Ala Ala Gly Thr Thr Cys Gly Thr Ala Thr Thr Cys Thr Gly Thr
900 905 910
Gly Thr Thr Gly Gly Gly Thr Gly Ala Thr Gly Ala Cys Ala Gly Gly
915 920 925
Cys Cys Cys Gly Cys Ala Gly Ala Ala Thr Cys Thr Gly Gly Ala Ala
930 935 940
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Cys Ala Ala Ala Ala Cys Ala Thr Gly
945 950 955 960
Thr Thr Ala Ala Ala Gly Cys Ala Ala Cys Cys Thr Gly Gly Gly Cys
965 970 975
Ala Cys Ala Gly Cys Gly Thr Thr Gly Thr Ala Ala Thr Ala Ala Ala
980 985 990
Gly Thr Thr Cys Thr Gly Thr Thr Thr Ala Thr Gly Ala Gly Cys Ala
995 1000 1005
Gly Cys Gly Ala Ala Gly Ala Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ala Gly Ala
1010 1015 1020
Thr Thr Thr Thr Cys Cys Gly Gly Cys Ala Gly Thr Thr Gly Gly Thr
1025 1030 1035 1040
Cys Thr Gly Ala Ala Ala Ala Cys Cys Ala Ala Ala Gly Ala Ala Gly
1045 1050 1055
Gly Thr Cys Gly Thr Gly Ala Thr Cys Ala Gly Cys Thr Gly Thr Ala
1060 1065 1070
Thr Thr Gly Gly Ala Ala Ala Ala Cys Cys Ala Thr Thr Ala Ala Ala
1075 1080 1085
Gly Cys Ala Thr Thr Thr Cys Ala Gly Thr Ala Thr Gly Thr Thr Cys
1090 1095 1100
Ala Thr Gly Ala Ala Cys Ala Thr Thr Ala Thr Cys Thr Gly Gly Ala
1105 1110 1115 1120
Ala Gly Ala Thr Gly Cys Ala Gly Ala Thr Thr Gly Gly Thr Thr Thr
1125 1130 1135
Cys Thr Gly Ala Ala Ala Gly Cys Ala Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly
1140 1145 1150
Ala Thr Ala Cys Cys Thr Ala Thr Gly Thr Thr Ala Thr Thr Cys Thr
1155 1160 1165
Gly Gly Ala Thr Ala Ala Thr Cys Thr Gly Cys Gly Thr Thr Gly Gly
1170 1175 1180
Cys Thr Gly Cys Thr Gly Ala Gly Cys Ala Ala Ala Thr Ala Thr Gly
1185 1190 1195 1200
Ala Thr Cys Cys Gly Gly Ala Ala Gly Ala Ala Cys Cys Gly Ala Thr
1205 1210 1215
Thr Thr Ala Thr Thr Thr Thr Gly Gly Thr Cys Gly Thr Cys Gly Thr
1220 1225 1230
Thr Thr Thr Ala Ala Ala Cys Cys Gly Thr Ala Thr Gly Thr Thr Ala
1235 1240 1245
Ala Ala Cys Ala Gly Gly Gly Thr Thr Ala Thr Ala Thr Gly Ala Gly
1250 1255 1260
Cys Gly Gly Thr Gly Gly Thr Gly Cys Ala Gly Gly Thr Thr Ala Thr
1265 1270 1275 1280
Gly Thr Thr Cys Thr Gly Ala Gly Cys Ala Ala Ala Gly Ala Ala Gly
1285 1290 1295
Cys Ala Cys Thr Gly Ala Ala Ala Cys Gly Thr Thr Thr Thr Gly Thr
1300 1305 1310
Thr Gly Ala Thr Gly Cys Ala Thr Thr Thr Ala Ala Ala Ala Cys Cys
1315 1320 1325
Gly Ala Thr Ala Ala Ala Thr Gly Thr Ala Cys Cys Cys Ala Thr Ala
1330 1335 1340
Gly Cys Ala Gly Cys Ala Gly Cys Ala Thr Thr Gly Ala Ala Gly Ala
1345 1350 1355 1360
Thr Cys Thr Gly Gly Cys Ala Cys Thr Gly Gly Gly Thr Cys Gly Thr
1365 1370 1375
Thr Gly Thr Ala Thr Gly Gly Ala Ala Ala Thr Thr Ala Thr Gly Ala
1380 1385 1390
Ala Thr Gly Thr Thr Gly Ala Ala Gly Cys Ala Gly Gly Thr Gly Ala
1395 1400 1405
Thr Ala Gly Cys Cys Gly Thr Gly Ala Thr Ala Cys Cys Ala Thr Thr
1410 1415 1420
Gly Gly Thr Ala Ala Ala Gly Ala Ala Ala Cys Cys Thr Thr Thr Cys
1425 1430 1435 1440
Ala Thr Cys Cys Gly Thr Thr Thr Gly Thr Thr Cys Cys Gly Gly Ala
1445 1450 1455
Ala Cys Ala Thr Cys Ala Thr Cys Thr Gly Ala Thr Thr Ala Ala Ala
1460 1465 1470
Gly Gly Thr Thr Ala Thr Cys Thr Gly Cys Cys Gly Cys Gly Thr Ala
1475 1480 1485
Cys Cys Thr Thr Thr Thr Gly Gly Thr Ala Thr Thr Gly Gly Ala Ala
1490 1495 1500
Thr Thr Ala Thr Ala Ala Thr Thr Ala Thr Thr Ala Thr Cys Cys Gly
1505 1510 1515 1520
Cys Cys Gly Gly Thr Thr Gly Ala Ala Gly Gly Thr Cys Cys Gly Gly
1525 1530 1535
Gly Thr Thr Gly Thr Thr Gly Thr Ala Gly Cys Gly Ala Thr Cys Thr
1540 1545 1550
Gly Gly Cys Ala Gly Thr Thr Ala Gly Cys Thr Thr Thr Cys Ala Thr
1555 1560 1565
Thr Ala Thr Gly Thr Thr Gly Ala Thr Ala Gly Cys Ala Cys Cys Ala
1570 1575 1580
Cys Cys Ala Thr Gly Thr Ala Thr Gly Ala Ala Cys Thr Gly Gly Ala
1585 1590 1595 1600
Ala Thr Ala Thr Cys Thr Gly Gly Thr Thr Thr Ala Thr Cys Ala Thr
1605 1610 1615
Cys Thr Gly Cys Gly Thr Cys Cys Gly Thr Ala Thr Gly Gly Thr Thr
1620 1625 1630
Ala Thr Cys Thr Gly Thr Ala Thr Cys Gly Thr Thr Ala Thr Cys Ala
1635 1640 1645
Gly Cys Cys Gly Ala Cys Cys Cys Thr Gly Cys Cys Gly Gly Ala Ala
1650 1655 1660
Cys Gly Thr Ala Thr Thr Cys Thr Gly Ala Ala Ala Gly Ala Ala Ala
1665 1670 1675 1680
Thr Thr Ala Gly Cys Cys Ala Gly Gly Cys Ala Ala Ala Thr Ala Ala
1685 1690 1695
Ala Ala Ala Thr Gly Ala Ala Gly Ala Thr Ala Cys Cys Ala Ala Ala
1700 1705 1710
Gly Thr Thr Ala Ala Ala Cys Thr Gly Gly Gly Thr Ala Ala Thr Cys
1715 1720 1725
Cys Gly
1730