一种研究M2型MΦs介导NPC放疗抵抗作用的方法
阅读说明：本技术 一种研究M2型MΦs介导NPC放疗抵抗作用的方法 (Method for researching M2 type M phi s mediated NPC radiotherapy resistance effect ) 是由 卢利森 袁冬军 彭炎秘 于 2021-08-02 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种研究M2型MΦs介导NPC放疗抵抗作用的方法,包括如下步骤：增强NPC放疗敏感性；内源co-IP及GSTpulldown验证两者的相互作用；构建USP7和Birc6不同突变体；RNA-Seq筛选USP7靶向Birc6促进MΦs表型转化过程中的分子通路；检测MΦs条件培养基中细胞因子的变化和该培养基对NPC放疗敏感性的影响；检测Myc-Birc6对NPC放疗敏感性的影响。本发明属于鼻咽癌治疗领域,具体是提供了一种为NPC治疗提供新的分子靶点的研究M2型MΦs介导NPC放疗抵抗作用的方法。(The invention discloses a method for researching M2 type M phi s mediated NPC radiotherapy resistance, which comprises the following steps: enhancing the NPC radiotherapy sensitivity; the interaction of the endogenous co-IP and the GSTPULLDown is verified; constructing different mutants of USP7 and Birc 6; RNA-Seq screening USP7 targeting Birc6 promotes molecular pathway in the process of M phi s phenotype transformation; detecting the change of the cell factor in the M phi s conditioned medium and the influence of the culture medium on the NPC radiotherapy sensitivity; the effect of Myc-Birc6 on NPC radiotherapy sensitivity was examined. The invention belongs to the field of nasopharyngeal carcinoma treatment, and particularly provides a method for researching the radiotherapy resistance of M2 type M phi s mediated NPC, which provides a new molecular target for NPC treatment.)
技术领域
本发明属于鼻咽癌治疗领域，具体是指一种研究M2型MΦs介导NPC放疗抵抗作用的方法。
背景技术
鼻咽癌(NPC)是原发于鼻咽腔的恶性肿瘤，其主要根治性治疗手段为放射治疗，放疗抵抗是NPC治疗失败的主要原因之一。既往肿瘤放疗增敏研究主要聚焦于如何提高肿瘤细胞自身放疗敏感性，而忽略了肿瘤免疫微环境(TIME)对放疗效果的重要影响。肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)作为TIME中浸润最多的免疫细胞亚群，以促肿瘤的M2型巨噬细胞(MΦs)为主，可通过多种途径影响肿瘤放疗敏感性，但其是否参与NPC的放疗抵抗目前鲜有研究。本项目从促进TAMs向抗肿瘤的M1型MΦs转化，改善抑制性TIME角度出发，为NPC放疗增敏提供新的方向。
因此，研究M2型MΦs介导NPC放疗抵抗作用对于寻找NPC放疗增敏的新靶点，具有重要的理论价值与临床意义。
发明内容
为解决上述现有难题，本发明提供了一种理论研究模型，通过初步实验结果进行预测，并正对性的提出科学假设，阐明NPC放疗抵抗的新机制，为NPC治疗提供新的分子靶点的研究M2型MΦs介导NPC放疗抵抗作用的方法。
本发明公开了一种研究M2型MΦs介导NPC放疗抵抗作用的方法的，包括如下步骤：
1)体外证明靶向抑制USP7(siRNA和P5091)可促进M2向M1型MΦs转化，从而增强NPC放疗敏感性
①在人原代MΦs和THP-1来源的MΦs中，用siRNA干扰USP7表达，qRT-PCR和Western Blot检测其敲低效果后，流式检测MΦs亚型变化；
②加入不同浓度的USP7抑制剂P5091对人原代MΦs和THP-1来源的MΦs进行处理，检测细胞活性后，选择对细胞活性无影响的浓度对MΦs进行处理，流式检测MΦs亚型变化；
③分别制备抑制USP7功能(P5091)或干扰USP7表达(siRNA)的人原代MΦs条件培养基：i)细胞因子抗体芯片分析其分泌细胞因子的变化；ii)将其与NPC细胞系(CNE2，HK1)孵育48h候后铺板，24h后以0、2、4、6、8Gy X射线进行照射，克隆形成实验计算细胞种植率及存活分数，评价抑制MΦs USP7功能(P5091)或干扰USP7表达(siRNA)对NPC放疗敏感性的影响。
2)co-IP结合LC-MS/MS筛选与USP7相互作用的蛋白Birc6，内源co-IP及GSTpulldown验证两者的相互作用
①提取人原代MΦs和THP-1来源的MΦs蛋白质，加入anti-USP7一抗及Protein A/G Agarose于4℃摇床孵育过夜。洗涤3次后，加入上样缓冲液行SDS-PAGE凝胶电泳,银染分析差异条带后，从胶上切下目标带，洗脱并收集胶中的蛋白质进行LC-MS/MS分析；
②提取人原代MΦs和THP-1来源的MΦs总蛋白，加入anti-USP7一抗及ProteinA/GAgarose于4℃摇床孵育过夜。洗涤3次后，加入上样缓冲液，Western Blot检测USP7与Birc6的相互作用。
③构建带有GST标签的原核表达USP7质粒并进行细菌转化，加入IPTG诱导后收集菌体，经超声破碎后收集上清，通过谷胱甘肽琼脂糖及还原型谷胱甘肽溶液(10mM)以得到GST-USP7融合蛋白。构建可真核表达的Myc-Birc6质粒，转染表达于HEK293T细胞并提取蛋白。亲和固化GST-USP7融合蛋白于谷胱甘肽亲和树脂上，Myc-Birc6蛋白溶液过柱后洗脱结合物，Western Blot检测USP7与Birc6在体外能否直接相互作用。
3)构建USP7和Birc6不同突变体以明确二者相互作用的结构域和结合位点，并靶向抑制USP7检测Birc6蛋白半衰期和泛素化水平的改变
①USP7蛋白由3309个碱基编码的1102个氨基酸构成，其主要结构域有7个：TRAF(62～205)、Catalytic domain(208～560)、Ubl1(562～665)、Ubl2(684～771)、Ubl3(793～881)、Ubl4(892～974)、Ubl5(985～1102)，分别构建其对应的缺失突变体SFB-USP7-ΔTRAF/ΔCD/ΔUbl1/ΔUbl2/ΔUbl3/ΔUbl4/ΔUbl5质粒，转染于HEK293T细胞中表达，co-IP实验检测各突变体是否与Birc6蛋白存在相互作用；
②Birc6蛋白由14487个碱基编码的4829个氨基酸构成，分别构建Myc标签Birc6突变体1-272、1-677、1-1360、1-1648、1-2400、1-3191、1-4099质粒，转染于HEK293T细胞中表达，co-IP实验检测各突变体是否与USP7蛋白存在相互作用；
③在确定USP7与Birc6结合结构域的基础上，根据USP7识别底物的保守基序，构建Birc6与USP7结合位点突变的Myc-Birc6-MT质粒，转染于HEK293T细胞中表达，co-IP实验检测各突变体是否与USP7蛋白存在相互作用，进一步明确二者相互作用的位点。
④在人原代MΦs和THP-1来源的MΦs中干扰USP7表达(siRNA)或抑制USP7功能(P5091)后，检测Birc6 mRNA和蛋白水平的变化；在人原代MΦs和THP-1来源的MΦs中加入DMSO或蛋白酶体抑制剂MG132(20μM)处理4h后提取蛋白，检测Birc6蛋白水平的变化；在人原代MΦs和THP-1来源的MΦs中干扰USP7表达(siRNA)或抑制USP7功能(P5091)后，加入Cycloheximide(CHX)(20μg/ml)，经不同时间处理后提取蛋白，Western Blot检测不同时间点Birc6蛋白含量。
⑤分别转染2μg SFB-USP7、Myc-Birc6-WT/MT和HA-ubiquitin质粒于HEK293T细胞中，6h后换液。在质粒转染24h后，加入MG132处理4h后提取蛋白，各取500μg～1mg样品用Mycbeads进行co-IP实验，Western Blot检测HA以观察Birc6蛋白泛素化水平。
4)RNA-Seq筛选USP7靶向Birc6促进MΦs表型转化过程中的分子通路，并对其进行验证提取DMSO或P5091处理的THP-1来源的MΦs RNA行RNA-seq检测，将数据进行KEGGpathway和GO等分析；分别用P5091和Birc6的siRNA对人原代MΦs进行处理并提取蛋白，Western Blot检测JNK/ERK/p38 MAPK通路中，USP7靶向Birc6促进MΦs表型转化的确切分子途径。
5)采用rescue技术，在抑制USP7功能的MΦs中过表达Myc-Birc6，检测MΦs条件培养基中细胞因子的变化和该培养基对NPC放疗敏感性的影响
①分别制备DMSO+vector组、P5091+vector组、DMSO+Myc-Birc6组、P5091+Myc-Birc6组的THP-1来源的MΦs条件培养基，进行细胞因子抗体芯片分析和统计学差异分析；
②分别制备DMSO+vector组、P5091+vector组、DMSO+Myc-Birc6组、P5091+Myc-Birc6组的THP-1来源的MΦs条件培养基，对NPC细胞系(CNE2，HK1)培养48h后铺板，行CCK-8实验观察细胞增殖活性；克隆形成实验检测细胞集落形成能力；单染PI流式检测细胞周期分布；双染PI-Annexin V流式检测细胞凋亡；IF和Western Blot检测γ-H2AX焦点数及其蛋白含量；分别以0、2、4、6、8Gy X射线照射后计算细胞存活分数来评价其放疗敏感性变化情况。
6)采用rescue技术，在抑制USP7功能的MΦs中加入JNK/ERK/p38抑制剂，检测其条件培养基对NPC放疗敏感性的影响
采用上述方案本发明取得有益效果如下：本发明一种研究M2型MΦs介导NPC放疗抵抗作用的方法从分子水平阐明USP7稳定Birc6负向调控JNK/ERK/p38 MAPK信号通路的分子机制；探讨了USP7在TAMs表型转化及NPC放疗敏感性中的作用；探讨USP7预测NPC患者放疗敏感性的临床价值。阐明NPC放疗抵抗的新机制，为NPC治疗提供新的分子靶点，具有重要的理论价值与临床意义。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1，1)体外证明靶向抑制USP7(siRNA和P5091)可促进M2向M1型MΦs转化，从而增强NPC放疗敏感性
①在人原代MΦs和THP-1来源的MΦs中，用siRNA干扰USP7表达，qRT-PCR和Western Blot检测其敲低效果后，流式检测MΦs亚型变化；
②加入不同浓度的USP7抑制剂P5091对人原代MΦs和THP-1来源的MΦs进行处理，检测细胞活性后，选择对细胞活性无影响的浓度对MΦs进行处理，流式检测MΦs亚型变化；
③分别制备抑制USP7功能(P5091)或干扰USP7表达(siRNA)的人原代MΦs条件培养基：i)细胞因子抗体芯片分析其分泌细胞因子的变化；ii)将其与NPC细胞系(CNE2，HK1)孵育48h候后铺板，24h后以0、2、4、6、8Gy X射线进行照射，克隆形成实验计算细胞种植率及存活分数，评价抑制MΦs USP7功能(P5091)或干扰USP7表达(siRNA)对NPC放疗敏感性的影响。
2)co-IP结合LC-MS/MS筛选与USP7相互作用的蛋白Birc6，内源co-IP及GSTpulldown验证两者的相互作用
①提取人原代MΦs和THP-1来源的MΦs蛋白质，加入anti-USP7一抗及Protein A/G Agarose于4℃摇床孵育过夜。洗涤3次后，加入上样缓冲液行SDS-PAGE凝胶电泳,银染分析差异条带后，从胶上切下目标带，洗脱并收集胶中的蛋白质进行LC-MS/MS分析；
②提取人原代MΦs和THP-1来源的MΦs总蛋白，加入anti-USP7一抗及ProteinA/GAgarose于4℃摇床孵育过夜。洗涤3次后，加入上样缓冲液，Western Blot检测USP7与Birc6的相互作用。
③构建带有GST标签的原核表达USP7质粒并进行细菌转化，加入IPTG诱导后收集菌体，经超声破碎后收集上清，通过谷胱甘肽琼脂糖及还原型谷胱甘肽溶液(10mM)以得到GST-USP7融合蛋白。构建可真核表达的Myc-Birc6质粒，转染表达于HEK293T细胞并提取蛋白。亲和固化GST-USP7融合蛋白于谷胱甘肽亲和树脂上，Myc-Birc6蛋白溶液过柱后洗脱结合物，Western Blot检测USP7与Birc6在体外能否直接相互作用。
3)构建USP7和Birc6不同突变体以明确二者相互作用的结构域和结合位点，并靶向抑制USP7检测Birc6蛋白半衰期和泛素化水平的改变
①USP7蛋白由3309个碱基编码的1102个氨基酸构成，其主要结构域有7个：TRAF(62～205)、Catalytic domain(208～560)、Ubl1(562～665)、Ubl2(684～771)、Ubl3(793～881)、Ubl4(892～974)、Ubl5(985～1102)，分别构建其对应的缺失突变体SFB-USP7-ΔTRAF/ΔCD/ΔUbl1/ΔUbl2/ΔUbl3/ΔUbl4/ΔUbl5质粒，转染于HEK293T细胞中表达，co-IP实验检测各突变体是否与Birc6蛋白存在相互作用；
②Birc6蛋白由14487个碱基编码的4829个氨基酸构成，分别构建Myc标签Birc6突变体1-272、1-677、1-1360、1-1648、1-2400、1-3191、1-4099质粒，转染于HEK293T细胞中表达，co-IP实验检测各突变体是否与USP7蛋白存在相互作用；
③在确定USP7与Birc6结合结构域的基础上，根据USP7识别底物的保守基序，构建Birc6与USP7结合位点突变的Myc-Birc6-MT质粒，转染于HEK293T细胞中表达，co-IP实验检测各突变体是否与USP7蛋白存在相互作用，进一步明确二者相互作用的位点。
④在人原代MΦs和THP-1来源的MΦs中干扰USP7表达(siRNA)或抑制USP7功能(P5091)后，检测Birc6 mRNA和蛋白水平的变化；在人原代MΦs和THP-1来源的MΦs中加入DMSO或蛋白酶体抑制剂MG132(20μM)处理4h后提取蛋白，检测Birc6蛋白水平的变化；在人原代MΦs和THP-1来源的MΦs中干扰USP7表达(siRNA)或抑制USP7功能(P5091)后，加入Cycloheximide(CHX)(20μg/ml)，经不同时间处理后提取蛋白，Western Blot检测不同时间点Birc6蛋白含量。
⑤分别转染2μg SFB-USP7、Myc-Birc6-WT/MT和HA-ubiquitin质粒于HEK293T细胞中，6h后换液。在质粒转染24h后，加入MG132处理4h后提取蛋白，各取500μg～1mg样品用Mycbeads进行co-IP实验，Western Blot检测HA以观察Birc6蛋白泛素化水平。
4)RNA-Seq筛选USP7靶向Birc6促进MΦs表型转化过程中的分子通路，并对其进行验证提取DMSO或P5091处理的THP-1来源的MΦs RNA行RNA-seq检测，将数据进行KEGGpathway和GO等分析；分别用P5091和Birc6的siRNA对人原代MΦs进行处理并提取蛋白，Western Blot检测JNK/ERK/p38 MAPK通路中，USP7靶向Birc6促进MΦs表型转化的确切分子途径。
5)采用rescue技术，在抑制USP7功能的MΦs中过表达Myc-Birc6，检测MΦs条件培养基中细胞因子的变化和该培养基对NPC放疗敏感性的影响
①分别制备DMSO+vector组、P5091+vector组、DMSO+Myc-Birc6组、P5091+Myc-Birc6组的THP-1来源的MΦs条件培养基，进行细胞因子抗体芯片分析和统计学差异分析；
②分别制备DMSO+vector组、P5091+vector组、DMSO+Myc-Birc6组、P5091+Myc-Birc6组的THP-1来源的MΦs条件培养基，对NPC细胞系(CNE2，HK1)培养48h后铺板，行CCK-8实验观察细胞增殖活性；克隆形成实验检测细胞集落形成能力；单染PI流式检测细胞周期分布；双染PI-Annexin V流式检测细胞凋亡；IF和Western Blot检测γ-H2AX焦点数及其蛋白含量；分别以0、2、4、6、8Gy X射线照射后计算细胞存活分数来评价其放疗敏感性变化情况。
6)采用rescue技术，在抑制USP7功能的MΦs中加入JNK/ERK/p38抑制剂，检测其条件培养基对NPC放疗敏感性的影响
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
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