米铂脂质体在抗耐药性肿瘤的应用
阅读说明：本技术 米铂脂质体在抗耐药性肿瘤的应用 (Application of miboplatin liposome in drug-resistant tumor resistance ) 是由 赵午莉 邵荣光 夏桂民 王梦燕 王晓葳 邱雨涵 于 2021-06-17 设计创作，主要内容包括：本发明属于药物领域,涉及米铂脂质体在抗耐药性中的应用。本发明发现米铂脂质体能够逆转,肿瘤细胞对肿瘤药物的天然和获得性耐药。进一步发现其对肿瘤复发根源的肿瘤干细胞具有显著杀伤作用,抑制转移和肿瘤复发,对肿瘤的彻底治疗提供了一个很好的方向,造益于更多肿瘤患者,具有重要的临床应用价值。(The invention belongs to the field of medicines, and relates to application of a miboplatin liposome in drug resistance. The invention discovers that the miboplatin liposome can reverse, and the tumor cells have natural and acquired drug resistance to tumor drugs. Further, the tumor stem cells which are the root of the tumor recurrence have obvious killing effect, the metastasis and the tumor recurrence are inhibited, a good direction is provided for the thorough treatment of the tumor, more tumor patients are benefited, and the clinical application value is important.)
技术领域
本发明属于药物领域，涉及米铂脂质体在抗耐药性中的应用。
背景技术
药物治疗在抗肿瘤治疗中具有重要作用，但肿瘤病人往往在用药一段后，出现了对肿瘤药物的耐药(包括天然和获得性)，使得很多病人对肿瘤药物不敏感，限制了肿瘤的治疗。
肿瘤干细胞是一类存在于肿瘤组织中，具有高度成瘤性及多向分化的细胞群，是肿瘤耐药、复发和转移的主要原因。对一般的肿瘤药物不敏感，往往在常规抗肿瘤药物治疗后存活下来，在一定条件下可重新回到增殖周期，导致肿瘤复发。针对肿瘤干细胞的治疗与常规化疗药物的联合是肿瘤的彻底治愈的，提高病人预后的关键。目前尚未有明确的抗肿瘤干细胞的药物被报道。
铂类药物一直在抗肿瘤中具有重要作用，但毒性限制了其应用。奥沙利铂作为性能逐渐改进的第三代铂类药物，在大肠癌和胰腺癌中一直具有重要的作用。在2019年版美国国家综合癌症指南中，其被列为“FOLFIRINOX”联合用药中胰腺癌的一线用药。奥沙利铂参与配伍使用的“FOLFOX”治疗方案也作为大肠癌治疗的一线治疗方案，成为晚期大肠癌化疗的金标准，在临床使用中展现显著的治疗效果。其体内分布的非特异，导致了不同组织的毒性，比较明显的是是神经毒性和骨髓抑制毒性。
米铂是以奥沙利铂为基础的升级药物，经代谢后形成的抗肿瘤活性中间体与奥沙利铂的抗肿瘤活性成分相同，其抗肿瘤谱广，抗肿瘤活性强，不良反应低。但水溶性差，无法全身给药，只能用价格昂贵，不易得到的罂粟籽油溶解后肝动脉给药。给药方式的局限，溶剂获得困难，限制了米铂对其他肿瘤的治疗以及给药途径。目前未见米铂可通过全身给药来抗胰腺癌和大肠癌抗肿瘤活性的报道。
在肿瘤治疗中，联合用药是非常重要的治疗方法。而联合用药往往基于不同抗肿瘤机制，进行协同阻断肿瘤细胞中的不同促增殖通路来增效发挥作用的，抗肿瘤效果明显，尤其对于晚期的三线肿瘤治疗。因此具有新颖独特的抗肿瘤机制的，尤其是本身抗肿瘤活性强且低毒的新型铂类药物，对于扩大铂类药物和其他药联合用药物联合用药的范围，对抗肿瘤治疗具有重要作用。铂类药物的作用机制是靶向DNA来发挥抗肿瘤作用。
米铂脂质体的制备已获授权中国专利(专利号：ZL 2015 1 0070080.2；专利名称：米铂脂质体和制法)。米铂脂质体由米铂、磷脂、胆固醇和水制备而成。
米铂(Miriplatin)为脂溶性铂类金属络合物，是由日本住友制药株式会社研发并开发上市的新型铂(II)类抗肿瘤药物，代号为SM-11355，商品名：临床上以其一水合物的形式提供，用于治疗肝癌。米铂的化学名称为：顺-[(1R,2R)- 1,2-环己二胺-N,N’]双十四酰氧基合铂，英文化学名为(SP-4-2)-[(1R,2R)-1, 2-Cyclohexanediamine-kappaN,kappaN'])bis(myristato-kappa O)platinum(I I)，其一水合物的化学式为：C34H68N2O4Pt·H2O，分子量：782.01，CAS登记号：141977-79-9。
本发明发现米铂脂质体能够逆转，肿瘤细胞对肿瘤药物的天然和获得性耐药。进一步发现其对肿瘤复发根源的肿瘤干细胞具有显著杀伤作用，抑制转移和肿瘤复发，对肿瘤的彻底治疗提供了一个很好的方向，造益于更多肿瘤患者，具有重要的临床应用价值。
米铂脂质体是以米铂为基础制备的新型纳米药物，载药量大，完全溶于水，可静脉全身给药，扩大了肿瘤种类治疗范围。其抗肿瘤活性显著强于米铂原料药和奥铂，且具有被动靶向作用，使药物获得了减毒增效的特性，有望成为肿瘤治疗的新型纳米铂类药物，使更多患者受益，具有重要的临床应用价值。
本发明发现米铂脂质体新颖独特的不同于其他抗癌药物的作用机制，可扩大与其他与米铂脂质体作用机制不同药物的联合应用。尤其是晚期可选择药物不多的肿瘤患者，对于挽救病人的生命具有良好的价值。
发明内容
本发明解决现有肿瘤药物在服用一段时间后，出现的耐药性，使得很多病人对肿瘤药物不敏感，限制了肿瘤的治疗的问题。
本发明的目的在于提供米铂脂质体在制备抗耐药性肿瘤药物中的应用。
其中，肿瘤包括：肺癌、乳腺癌、前列腺癌、皮肤癌、鼻癌、口腔癌、胰腺癌、大肠癌。优选的，肿瘤为胰腺癌、大肠癌。
其中，人大肠癌细胞系：人直肠癌细胞HCT8和HT29；
其中，人胰腺癌细胞：AsPC-1、BxPC-3、MIA-PaCa-2、PANC-1、SW1990、SU.86.86。
其中，人耐奥沙利大肠癌细胞株HCT8L；人耐顺铂肿瘤细胞株PATU8988/DDP。
其中，米铂脂质体逆转大肠癌细胞HCT8对奥沙利铂的耐药性(获得性耐药)；米铂脂质体逆转胰腺癌细胞MIA-PaCa-2和PANC-1对吉西他滨的天然耐药；米铂脂质体逆转耐奥沙利大肠癌细胞HCT8L；和耐顺铂肿瘤细胞PATU8988/DDP的耐药性。
其中，米铂脂质体对大肠癌HCT8细胞培养成的3D-肿瘤干细胞球具有杀伤作用。
其中，米铂脂质体抑制大肠癌肿瘤细胞软琼脂克隆形成能力。
其中，米铂脂质体提高间皮蛋白标志物ZO1，E-cadherin的表达，同时下调上皮蛋白标志蛋白N-cadherin，Snail，Slug的表达量，表明米铂脂质体抑制EMT 转化，即抑制了肿瘤细胞转移。
其中，米铂脂质体主要通过小窝蛋白介导的内吞途径进入癌细胞，同时巨胞饮途径对米铂脂质体的入胞有辅助作用。
其中，米铂脂质体引起肿瘤细胞大量内质网和线粒体空泡化，并观察到空泡化的线粒体被包含在自噬泡内，提示线粒体发生了自噬。
其中，米铂脂质体进入肿瘤细胞线粒体，引起线粒体DNA复制障碍引发的自噬和内质网损伤的抗肿瘤机制，来发挥抗肿瘤作用。
本发明的另一个目的在于提供米铂脂质体在不同肿瘤中的抗癌活性。
米铂脂质体对逆转了胰腺癌对其一线用药吉西他滨的天然耐药性。
以市售胰腺癌一线用药吉西他滨为阳性对照药，采用6株胰腺癌细胞(24 小时6株胰腺癌细胞的IC50均大于75μM，48小时3株细胞IC50大于75μM) 和MTT法评价了24小时和48小时米铂脂质体外逆转胰腺癌对吉西他滨天然耐药性。
米铂脂质体逆转了大肠癌对其一线用药奥沙利铂的获得耐药性。
对获得性耐奥沙利铂对2株大肠癌细胞，采用SRB法评价了米铂脂质体逆转大肠癌获得性耐药对作用。即首先采用奥沙利铂持续处理大肠癌HCT8肿瘤细胞和 HT29肿瘤细胞，奥沙利铂处理48小时后去掉含药物上清换为正常培养基，使得仍然存活的肿瘤细胞继续增殖72小时，即获得奥沙利铂耐药细胞。用米铂脂质体和奥沙利铂处理孔板中的奥沙利铂耐药细胞48小时，光镜下观察细胞状态，并采用SRB法对细胞进行固定并染色。
米铂脂质体逆转了已建立耐肿瘤药物细胞株的耐药性(获得性耐药)。
采用建立的人源性大肠癌耐奥沙利铂肿瘤细胞株HCT8L,PATU8988/DDP,采用 MTT法评价了米铂脂质体逆转肿瘤细胞株获得性耐药作用。分别用奥沙利铂和米铂脂质体处理人源性大肠癌肿瘤耐奥沙利铂细胞株HCT8L,顺铂和米铂脂质体处理药物处理人源性胰腺癌耐顺铂细胞株PATU8988/DDP，48小时后光镜下观察细胞状态，并采用MTT法检测细胞活性。
米铂脂质体对裸鼠异种移植瘤的抗肿瘤活性。
在裸鼠BALB/c Nude小鼠皮下接种人胰腺癌APSC-1细胞，待瘤体积达到100 立方厘米，尾静脉给药米铂脂质体，一线胰腺癌药物吉西他滨以及奥沙利铂，检测瘤增殖曲线和小鼠生存时间，监测体重变化。
米铂脂质体原发性大肠癌小鼠的抗肿瘤活性。
本发明的另一个目的在于提供米铂脂质体强效抗肿瘤干细胞(耐药细胞)。
本试验采用反映肿瘤干细胞特性的实验，观察米铂脂质体处理后肿瘤干细胞是否被抑制。
成球能力是否降低：在成球培养基中培养3D-肿瘤干细胞球，用米铂脂质体处理肿瘤干细胞球，观察药物对肿瘤干细胞球的杀伤作用。
成瘤能力是否降低：米铂脂质体处理肿瘤细胞，观察药物处理后的肿瘤细胞在软琼脂中形成克隆能力，检测米铂脂质体是否能够抑制肿瘤干细胞通过自身克隆形成肿瘤组织。
反映干细胞特性的，上皮-间质转化(EMT)是否降低：上皮间充质转化(EMT) 是指上皮来源肿瘤细胞向间充质转化，获得间充质细胞对特点，进而向远处转移的重要生物学行为，与肿瘤转移和侵袭密切相关，也是肿瘤干细胞的重要特征之一。采用Western blot检测EMT相关分子标志蛋白表达水平的变化，以反映是否 EMT被降低。
本发明的另一个目的在于提供米铂脂质体抗肿瘤机制。
米铂脂质体入胞途径研究
细胞对纳米粒的内吞主要通过胞饮实现，可细分为4条内吞途径：网格蛋白介导、小窝蛋白介导、巨胞饮、不依赖网格蛋白与小窝蛋白的途径。受纳米粒自身性质、细胞类型影响，纳米粒最终通过不同途径进入细胞。
选用不同途径的内吞抑制剂作用于细胞，以细胞对荧光脂质体的摄取、铂元素在细胞中的累积量为指标，考察不同处理对米铂脂质体入胞的影响，从而确定米铂脂质体的入胞途径。
米铂脂质体在细胞中胞内转运过程的研究
根据常规脂质体入胞途径和走向，我们首先观察了其在内涵体、溶酶体内的走向。通过标记癌细胞内涵体和溶酶体，观察其与米铂脂质体的共定位，判断米铂脂质体在癌细胞内的转运过程，为解释米铂脂质体作用机制提供实验依据。
米铂脂质体对通过靶向线粒体DNA引起线粒体自噬。
检测线粒体自噬蛋白标志物BNIP3、BNIP3L/Nix表达是否增加。
利用激光共扫描技术检测自噬蛋白标志物LC3B是否和线粒体共定位，以反映线粒体是否发生了自噬。
qRT-PCR法检测线粒体DNA(mtDNA)拷贝数变化情况。
米铂脂质体对胰腺癌细胞内质网的损伤探究
米铂脂质体处理胰腺癌细胞后，利用Western Blot法检测细胞内质网应激反应相关蛋白标志物BiP，eIF2α及其磷酸化形式的变化情况，为解释米铂脂质体损伤内质网的机制提供实验依据。
其中，本发明的药物包含可接受的辅料和其他起配伍协同作用的有效成分。
其中，本发明的药物制备成任何药用剂型，包括：胶囊剂、片剂、粉剂、酒剂、混悬剂、乳剂、糖浆、气雾剂，或注射剂等。
本发明相对于现有抗肿瘤药物，还具有以下有益效果：
本发明研究了米铂脂质体的逆转肿瘤耐药的活性。采用天然耐吉西他滨(胰腺癌一线药物)的胰腺癌细胞株，以及2株获得性耐奥沙利铂的大肠癌细胞株和其他已经建立的耐药细胞株检测了米铂脂质体活性，结果表明米铂脂质体能够克服胰腺癌24小时和48小时对其一线用药吉西他滨的天然耐药性，同时也克服耐药肿瘤细胞株对获得性耐药。此发现有益于临床上很多对肿瘤一线药物有天然和获得性耐药的患者，尤其是对于中晚期多次治疗的病人，会产生有益的治疗效果。同时脂质体制剂药物毒特低的特点，使得米铂脂质体未来可能成为临床上克服耐药新型铂类脂质体药物。
本发明发现了铂类药物治疗肿瘤的新机制。尽管米铂脂质体仍属于铂类药物，但其抗肿瘤机制不同于传统铂类药物的靶向DNA机制，是新的机制。其机制为，经内涵体和溶酶体运输和处理，靶向线粒体DNA和内质网，降低线粒体DNA复制，导致各种线粒体关键功能蛋白合成降低，触发线粒体自噬。
而基于不同抗肿瘤机制的联合用药，是肿瘤药物联合治疗的依据。机制不同药物的联合应用，可从不同通路协同阻断肿瘤细胞的增殖，抗癌效果明显，经常被用于肿瘤治疗尤其在晚期肿瘤治疗中。因此发现具有新颖独特机制的药物，尤其是抗肿瘤活性强毒性弱的药物，对于扩大铂类药物和其他药联合用药物联合用药的范围，对于联合用药进行抗肿瘤具有重要的作用。
附图说明
图1、米铂脂质体可克服肿瘤细胞对奥沙利铂耐药
图1A奥沙利铂获得性耐药细胞培养流程图
图1B米铂脂质体可克服肿瘤细胞对奥沙利铂耐药-SRB定量
图1C米铂脂质体可克服肿瘤细胞对奥沙利铂耐药-镜下观察
图2、米铂脂质体可克服肿瘤耐药细胞株HCT8L,PATU8988/DDP的获得性耐药
图2A米铂脂质体可克服肿瘤耐药细胞株HCT8L,PATU8988/DDP的获得性耐药 -MTT定量
图2B米铂脂质体可克服肿瘤耐药细胞株HCT8L,PATU8988/DDP的获得性耐药-镜下观察
图3、米铂脂质体可杀伤3D-肿瘤干细胞球
图3A米铂脂质体可杀伤3D-肿瘤干细胞球-12小时
图3B米铂脂质体可杀伤3D-肿瘤干细胞球-24小时
图4、米铂脂质体抑制肿瘤细胞软琼脂克隆形成能力
图5、米铂脂质体抑制肿瘤细胞上皮间充质转化(EMT)
图6、入胞抑制剂对荧光强度的影响
图7、入胞抑制剂对细胞铂含量影响
图8、米铂脂质体入胞后进入内涵体和溶酶体，标尺20μm
图9、AsPC-1细胞透射电镜图
图10、米铂脂质体处理后细胞线粒体与LC3B共定位情况
图10A、AsPC-1细胞用米铂脂质体处理后细胞线粒体与LC3B共定位情况
图10B、MIA-PaCa-2细胞米铂脂质体处理后细胞线粒体与LC3B共定位情况
图11、米铂脂质体处理后细胞内LC3B、BNIP3、BNIP3L的表达量升高
图12、米铂脂质体处理后细胞线粒体内LC3B的表达量升高
具体实施方式
通过以下具体实施例对本发明作进一步的说明，但不作为本发明的限制。
本发明所有大肠癌细胞系：人大肠腺癌细胞HCT8和HT29均购自国家实验细胞资源共享平台。人胰腺癌细胞：AsPC-1、BxPC-3、MIA-PaCa-2、PANC-1、SW1990、 SU.86.86购于国家实验细胞资源共享等平台和ATCC细胞库(Rockville,MD,USA)。
试验实施例1：米铂脂质体逆转来胰腺癌天然耐药性
本发明采用MTT(四甲基偶氮唑蓝盐)法检测米铂脂质体(以下简写为LMPt) 体外抗耐药细胞活性。采用6株胰腺癌细胞培养在含有10％胎牛血清的完全培养基，在37℃，5％CO2的细胞恒温培养箱中培养，取对数生长期的细胞消化，计数，接种于96孔板中，培养24小时后待细胞完全贴壁，分别用米铂脂质体米铂和奥沙利铂给药处理，并设置给药浓度梯度。24小时和48小时后分别检测增殖， SigmaPlot计算IC50。并设置吉西他滨，奥沙利铂以及其他药物作为对照。
米铂脂质体，胰腺癌一线用药吉西他滨和奥沙利铂对胰腺癌细胞的IC50结果如表1所示，结果表明这6株胰腺癌肿瘤细胞24小时都对奥沙利铂和吉西他滨耐药，米铂脂质体在24小时和48小时对胰腺癌肿瘤细胞均具有强对杀伤活性，其活性远高于对照奥沙利铂和吉西他滨，米铂脂质体具有强对逆转天然耐吉西他滨的耐药性。
表1米铂脂质体对胰腺癌细胞体外抗肿瘤活性IC50统计
试验实施例2：米铂脂质体逆转大肠癌对奥沙利铂的耐药性(获得性耐药)
大肠癌一线用药是奥沙利铂，对奥沙利铂对耐药严重阻碍了大肠癌的治疗。基于此，我们建立耐奥沙利铂的耐药细胞，以检测米铂脂质体是否能获得性逆转耐药。用奥沙利铂处理大肠癌细胞HCT8和HT29 48小时，撤去含药上清，使耐药存活的细胞继续增殖72小时，以获得耐奥沙利铂的细胞。
此后加入米铂脂质体，同时设置奥沙利铂和空白对照组。48小时后镜下观察细胞状态，并采用SRB法对细胞进行固定并染色。实验结果发现，与对照组相比， 80％奥沙利铂耐药肿瘤细胞可以被米铂脂质体杀死，证明米铂脂质体可以克服肿瘤细胞对奥沙利铂耐药现象(见图1)。
试验实施例3：米铂脂质体逆转已建立耐药肿瘤细胞株的耐药(获得性耐药)
肿瘤细胞对普通化疗药物产生耐药是临床上肿瘤治疗面临的严峻挑战，本试验中我们检测米铂脂质体是否对耐药肿瘤细胞株具有杀伤活性，逆转其获得性耐药。试验中用到的HCT8L为构建的人源性大肠癌耐奥沙利铂肿瘤细胞株， PATU8988/DDP为人源性胰腺癌耐顺铂肿瘤细胞株。
米铂脂质体和奥沙利铂分别处理HCT8L肿瘤细胞株，并设置未处理对照。药物处理48小时后镜下观察细胞状态，并采用MTT法检测细胞的增殖活性。 PATU8988/DDP肿瘤细胞株分别用米铂脂质体和顺铂处理，并设置未处理对照。试验方法同HTCTL。试验结果发现，HCT8L和PATU8988/DDP分别对奥沙利铂和顺铂耐药，米铂脂质体对其杀伤效果显著，可逆转其获得性耐药(见图2)。
肿瘤干细胞的存在是肿瘤细胞对普通化疗药物产生耐药，无法在治疗中被彻底杀死的主要原因，因此靶向这些细胞并将其杀灭是肿瘤治疗的关键。
我们采用以下反映肿瘤干性的实验，检测了米铂脂质对肿瘤干细胞的杀伤活性。
试验实施例4：米铂脂质体对肿瘤干细胞有强对杀伤活性
4.1米铂脂质体可杀伤3D-肿瘤干细胞球
取对数生长期的大肠癌HCT8细胞进行3D-肿瘤干细胞球培养。待细胞成球后分别加入米铂脂质体和奥沙利铂处理肿瘤干细胞球，药物处理12小时和24 小时后分别观察肿瘤干细胞球状态并进行计数。实验结果发现，与未给药组相比，米铂脂质体处理组肿瘤干细胞球几乎被完全杀死，而奥沙利铂组仍然有50％左右存活(见图3)。实验证明，米铂脂质体对大肠癌HCT8细胞培养成的3D-肿瘤干细胞球具有杀伤作用。
4.2米铂脂质体抑制肿瘤细胞软琼脂克隆形成能力
肿瘤细胞在软琼脂中形成克隆的能力通常被用来反应肿瘤细胞的干性特征。我们将HCT8细胞分别用米铂脂质体和奥沙利铂处理，处理后的肿瘤细胞进行软琼脂克隆形成实验，实验结果显示，以未处理组作为对照，米铂脂质体处理组 HCT8细胞在软琼脂中克隆形成率仅为10％-20％，而奥沙利铂处理组HCT8细胞克隆形成率则在70％左右(见图4)。实验证明，米铂脂质体抑制大肠癌肿瘤细胞软琼脂克隆形成能力。
4.3米铂脂质体抑制肿瘤细胞上皮间充质转化(EMT)
上皮间充质转化(EMT)是指上皮来源肿瘤细胞向间充质细胞转化，成为具备间充质细胞特点，进而获得向远处转移的重要生物学行为，与肿瘤转移和侵袭密切相关，也是肿瘤干细胞的重要特征之一。为了验证米铂脂质体是否可以抑制此肿瘤干细胞特性，我们用米铂脂质体处理HCT8细胞和HT29细胞，对EMT相关蛋白表达水平进行检测。
实验结果表明，米铂脂质体可以提高间皮蛋白标志物ZO1，E-cadherin的表达，同时下调上皮蛋白标志蛋白N-cadherin，Snail，Slug的表达量，表明米铂脂质体抑制EMT转化，即抑制了肿瘤细胞转移(见图5)
实验实施例5：米铂脂质体入胞途径研究
纳米药物主要通过细胞内吞途径进入细胞，具体来说，细胞内吞途径主要分为：网格蛋白介导的内吞途径、小窝蛋白介导的内吞途径、巨胞饮途径以及不依赖网格蛋白与小窝蛋白的途径。为了监测米铂脂质体入胞途径，我们采用首先制备荧光米铂脂质。米铂脂质体采用与中国专利ZL 2015 1 0070080.2，米铂脂质体和制法中描述的相同方法，向制备米铂脂质体的的脂材中加入荧光物质以制备荧光标记的米铂脂质体(以下简称LMPt-DiI)。
将人胰腺癌细胞AsPC-1、BxPC-3、MIA-PaCa-2和大肠癌细胞培养至对数期，接种于6孔板，20×104个/孔，细胞贴壁后，用抑制剂处理2h后，再加用针对纳米颗粒入胞途径的抑制剂处理细胞，采用荧光显微镜和铂含量测定判断米铂脂质体进入肿瘤细胞的途径。结果(图6-7)表明，米铂脂质体主要通过小窝蛋白介导的内吞途径进入癌细胞，同时巨胞饮途径对米铂脂质体的入胞有辅助作用。
实验实施例6：米铂脂质体在肿瘤细胞内的转运
纳米药物被细胞内吞后，细胞质包裹纳米颗粒形成小窝，随后继续凹陷，最终与质膜脱离进入细胞质，形成内涵体。早期内涵体成熟成为晚期内涵体，最后与溶酶体融合。被内吞的纳米药物会在低pH环境(内涵体/溶酶体)和溶酶体酶系作用下被降解，有利于包被药物的释放。
为了进一步观测米铂脂质体的转运，我们采用荧光标记了米铂脂质体和细胞内涵体/溶酶体系统，检测了米铂脂质体在细胞内的转运。
将胰腺癌细胞以及大肠癌细胞接种于玻璃底96孔板中，待细胞贴壁，用含荧光试剂的培养基替换对应孔中的培养基，继续在37℃、5％CO2条件下孵育细胞24h，保证肿瘤细胞中细胞器被荧光标记。之后向每个孔中加入LMPt-DiI，分别于30min、1，6h弃去培养基，用PBS清洗细胞，洗去粘附在细胞表面的荧光脂质体，向孔中加入新鲜培养基，利用荧光显微镜，观察LMPt-DiI与细胞器的共定位情况。
LMPt-DiI与早期内涵体、晚期内涵体、溶酶体的共定位情况如图8所示。结果表明，胰腺癌细胞和大肠癌细胞得到结果类似，即LMPt-DiI与细胞共孵育1h 观察到LMPt-DiI与早期内涵体、晚期内涵体共定位；共孵育6h观察到LMPt-DiI 与溶酶体共定。上述结果说明米铂脂质体进入细胞后先进入内涵体再运输至溶酶体。
实验实施例7：米铂脂质体杀伤肿瘤的机制
7.1透射电镜观察米铂脂质对肿瘤细胞的损伤情况
为了进一步确实米铂在入胞后对细胞的损伤，我们采用电镜进一步观察了细胞器的损失情况。
体外培养AsPC-1至对数期并接种于6孔板中，接种密度为20×104个/孔，每孔2mL培养基，之后继续在细胞培养箱中培养24h。用培养基稀释米铂脂质体至30μM，待细胞贴壁，用含米铂脂质体的培养基替换对应孔中的培养基，同时设置不加米铂脂质体的孔作为阴性对照。继续孵育24h后弃去培养基，用PBS 清洗细胞，洗去粘附在细胞表面的米铂脂质体，用0.25％胰酶硝化细胞并收集于Ep管，离心(800×g,5min)得细胞沉淀。细胞预固定于2.5％戊二醛中，之后在1％四氧化锇和1.5％亚铁氰化钾中固定1h。利用浓度递增的乙醇溶液(50％， 60％，70％，80％，90％和100％)将细胞脱水，在室温下用含70％乙醇的2％乙酸铀酰将细胞染色，之后将细胞包埋在环氧树脂中。使用超薄切片机将包埋的样品切成60nm厚的切片,固定于铜网上。使用JEM-1400Plus透射电子显微镜系统(JEOL，日本)观察切片(120kV电压)。
结果表明，米铂脂质体可以引起大量的内质网和线粒体空泡化，并观察到空泡化的线粒体被包含这自噬泡内，提示线粒体发生了自噬(图9)。
7.2米铂脂质体靶向的细胞器
米铂脂质体在入胞经包涵体和含有大量降解酶的溶酶体处理后，进入下一步的靶细胞器，发挥其抗肿瘤活性。而电镜图提示，米铂纸脂质体可能损伤了内质网和线粒体发挥了作用，因此我们提取了细胞的细胞器检测了铂的含量，以判别铂的走向。取经米铂纸脂质体处理后的细胞，分别提取细胞核，内质网，线粒体以及其他细胞器检测铂含量，结果表明，铂主要集中这内质网和线粒体内，是米铂脂质体的主要靶向细胞器。
7.3米铂脂质体引起线粒体自噬
根据米铂脂质体在线粒体内聚集，以及电镜结果，提示线粒体被靶向发生了自噬，因此我们进一步对线粒体检测，以确定线粒体发生自噬
为维持细胞的正常活动状态，受损伤或不需要的线粒体需被及时清除掉。细胞主要通过自噬机制选择性地清除受损伤的线粒体，这一过程被称为线粒体自噬。线粒体自噬发生时，线粒体自噬受体首先被激活，通过与自噬关键蛋白LC3结合，募集LC3到损伤的线粒体上，使损伤的线粒体被自噬体包裹。包裹线粒体的自噬小体与溶酶体融合，损伤的线粒体被释放至溶酶体腔中最终被降解。通过检测线粒体自噬标志物、验证线粒体与自噬信号的共定位，可以证明线粒体自噬的发生。
7.3.1线粒体与引发自噬标志物LC3B
利用免疫荧光法判断米脂质体处理的细胞内线粒体与自噬标志物LC3B的共定位情况。结果表明，胞质内的LC3B信号与线粒体共定位，说明LC3B被募集到线粒体中，线粒体自噬发生(图10)。
7.3.2线粒体自噬标志物检测
米铂脂质体处理细胞后，取细胞全裂解液进行western blot检测，以未给药组作为阴性对照，结果发现细胞内自噬关键蛋白LC3B、线粒体自噬受体BNIP3、线粒体自噬受体BNIP3L/Nix的表达量升高(图11)，提示线粒体自噬的发生。之后提取线粒体，米铂脂质体处理组为实验组，未给药组作为阴性对照组，利用 western blot法检测线粒体中的LC3B，结果表明，随着给药浓度增高，线粒体中富集的LC3B增多(图12)，说明细胞自噬产生的LC3B被富集到线粒体中。
上述结果均证明，米铂脂质体诱导了线粒体自噬的发生。
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