含铂化合物及其组合物和应用
阅读说明：本技术 含铂化合物及其组合物和应用 (Platinum-containing compounds, compositions and uses thereof ) 是由 刘然义 袁雪霞 岳欣 段有发 于 2021-09-03 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种治疗癌症尤其是肺癌的药物组合物,所述药物组合物包括含铂化合物。本发明经过长期大量的研究发现,本发明的含铂化合物,尤其是Tri-ligand无论是在体内、外均能对肺癌细胞产生显著的生长抑制作用,其效果明显优于临床用于治疗肺癌的一线治疗方案建议药物(顺铂)甚至是最新研究用于改善顺铂耐药性的DDP+DSF联合用药方案,同时Tri-ligand所展现的在体内的安全性也要优于DDP+DSF联合用药方案。对于此,本发明为肺癌,尤其是非小细胞肺癌提供了一种新的治疗策略,能够有效扩大肺癌的用药谱,改善肺癌一线治疗药物顺铂效果差、易出现耐药性等现状。本发明对于改善肺癌的预后有重要作用,具有十分重要的临床意义和社会意义。(The present invention provides a pharmaceutical composition for the treatment of cancer, particularly lung cancer, comprising a platinum-containing compound. According to a large number of long-term researches, the platinum-containing compound, particularly Tri-ligand, can generate a remarkable growth inhibition effect on lung cancer cells both in vivo and in vitro, the effect of the platinum-containing compound is obviously superior to that of a first-line treatment scheme suggested drug (cisplatin) for clinically treating lung cancer and even a newly researched DDP + DSF combined drug scheme for improving the drug resistance of the cisplatin, and the safety in vivo exhibited by the Tri-ligand is also superior to that of the DDP + DSF combined drug scheme. In contrast, the invention provides a new treatment strategy for lung cancer, particularly non-small cell lung cancer, can effectively expand the drug spectrum of lung cancer, and improve the current situations that the first-line treatment drug for lung cancer, namely cisplatin, has poor effect and is easy to have drug resistance. The invention has important function for improving the prognosis of lung cancer, and has very important clinical significance and social significance.)
技术领域
本发明属于肿瘤治疗技术领域，具体涉及含铂化合物及其组合物和应用。
背景技术
肺癌为呼吸系统常见的恶性肿瘤，是目前世界上最常见、发明率最高的肿瘤之一。近50年来许多国家都报道肺癌的发病率和死亡率均明显增高，男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位，女性发病率占第二位，死亡率占第二位，而肺癌的病因至今尚不完全明确。
临床上针对肺癌主要有化疗、放疗、手术治疗等方法。其中化疗在肺癌的治疗过程中最为常见。90%以上的肺癌都需要接受化疗治疗。化疗对小细胞肺癌的疗效无论早期或晚期均较肯定，甚至有约1%的早期小细胞肺癌通过化疗治愈。化疗也是治疗非小细胞肺癌的主要手段，化疗治疗非小细胞肺癌的肿瘤缓解率为40%-50%，然而化疗一般不能治愈非小细胞肺癌，只能延长患者生存和改善生活质量。
顺铂（cisplatin，DDP），即顺式-二氯二氨合铂，是一种含铂的抗肿瘤药物，棕黄色粉末，属于细胞周期非特异性药物，也是一种损伤DNA的化疗药物，应主要应用于肺癌、头颈癌、卵巢癌及睾丸癌的标准治疗。然而，单独使用顺铂的治疗效果往往欠佳，且患者的预后较差；同时长期大量服用顺铂会出现肝毒性及肾毒性，并会产生严重的耐药性，从而导致治疗效果逐渐降低，大大限制了其临床应用，因此在临床上通常将顺铂与其他药物联用，以提高治疗效果，并缓解甚至消除其耐药性。
双硫仑（disulfiram，DSF）是一种解酒药物，服用该药后即使饮用少量的酒，身体也会产生严重的不适，从而达到戒酒的目的。最新的研究发现，在顺铂的基础上进一步加入双硫仑联合使用，能否有效降低顺铂存在的耐药性的问题，且对肿瘤的治疗效果得到了明显的提高。
然而，多种药物联合使用，尽管可以提高治疗效果，克服顺铂耐药性的问题，但很显然会提升患者产生多种不良反应的风险，并增加患者的治疗成本，同时其抗肿瘤的效果仍然有很大的提升空间。
发明内容
针对上述存在问题和不足，本发明提供了一种含铂化合物及其组合物和应用，以解决现有技术中长期使用顺铂治疗肺癌所存在的效果差、易产生耐药性、存在多种不良反应隐患的问题。
本发明是通过如下技术方案得以实现的：
本发明第一方面提供了一种预防和/或治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包括含铂化合物，所述含铂化合物分子式为（C5H10NS2）nPt，其中n≥1。
作为优选地，所述癌症选自肺癌。
作为优选地，所述肺癌选自小细胞肺癌、非小细胞肺癌中的一种或多种。
作为优选地，所述含铂化合物具有如下式I所示的结构通式：
式I。
作为优选地，所述含铂化合物选自如下式II或式III化合物中的一种或多种，
式II: ；
式III：。
进一步地，所述药物组合物中还包含至少一种抗肿瘤药物。
作为优选地，所述抗肿瘤药物选自紫杉醇、顺铂、卡铂、双硫仑、环磷酰胺、异环磷酰胺、蛋白酶体抑制剂、RTK抑制剂中的一种或多种。
作为优选地，所述RTK抑制剂选自尼洛替尼（Nilotinib）、吉非替尼（Gefitinib）、厄洛替尼（Erlotinib）、拉帕替尼（Lapatinib）、阿法替尼（Afatinib）、达可替尼（Dacomitinib）、凡德他尼（Vandetanib）、来那替尼（Neratinib）、奥希替尼（Osimertinib）、阿帕替尼（Apatinib）、阿西替尼（Axitinib）中的一种或多种。
本发明第二方面提供了含铂化合物在制备治疗癌症药物中的应用，所述含铂化合物分子式为（C5H10NS2）nPt，其中n≥1。
作为优选地，所述癌症选自肺癌。
作为优选地，所述肺癌选自小细胞肺癌、非小细胞肺癌中的一种或多种。
作为优选地，所述含铂化合物具有如下式I所示的结构通式：
式I。
作为优选地，所述含铂化合物选自如下式II或式III化合物中的一种或多种，
式II: ；
式III：。
本发明与现有的技术相比，具有如下有益效果：
（1）本发明通过大量的实验筛选并验证了含铂化合物尤其是Tri-ligand能有效的抑制肺癌在体内、体外的增殖、生长过程，其可作为肺癌尤其是非小细胞肺癌的一种新的治疗方案。
（2）本发明给肺癌的新药研发和临床治疗提供了一种新的方案，其能够有效扩大肺癌治疗中的用药谱，改善肺癌治疗中一线化疗药物例如顺铂所存在的治疗效果差、易出现耐药、预后差等现状。在此研究基础上，可开发更多更有效的“综合治疗”方案，改善预后，为肺癌的精准治疗进展提供有力的实验数据支撑，具有十分重要的临床意义和社会意义。
附图说明
图1为不同化合物作用下的肺癌细胞生存曲线图。
图2为不同化合物对不同肺癌细胞克隆形成能力的影响示意图。
图3为Tri-ligand与DDP/DSF联合用药对H460细胞克隆形成能力的影响示意图。
图4为不同化合物对肺癌细胞成球能力的影响示意图。
图5为不同化合物对肺癌细胞成球过程中克隆数和径向分析结果示意图。
图6为小鼠体内肿瘤体积的变化结果示意图。
图7为小鼠体重变化结果示意图。
图8为小鼠肿瘤组织图片。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
在无特殊说明的情况下，本发明上下文中所列出的包括H1975、A549、H3、PC9、H1299、LLC、H358、H460、H2228等细胞系均按照现有技术进行培养，所有细胞系均通过中国典型培养物保藏中心（武汉）短串联重复分析鉴定，并使用PCR检测试剂盒（上海BiothriveSci）验证是否存在支原体污染，同时在液氮中冷冻保存并用于后续实验。本发明所使用的试剂中，均通过市售获得。
生物学重复中选择具有代表性的结果呈现在上下文附图中，数据按照图示中规定的以mean±SD和mean±SEM展示。所有体外实验至少重复三次，动物实验重复两次。数据采用GraphPad Prism 8.0或SPSS 22.0软件进行分析。采用t检验或方差分析比较两组或两组以上的平均值差异，p＜0.05被认为是一个显著的差异。
实施例1 细胞体外杀伤实验
（1）分别取对数生长期的H1975、H23、PC9、H1299、H460及H2228细胞按一定密度（3000-5000/孔）接种于96孔板中；
（2）24小时后弃旧培养基，将细胞分别用含有不同浓度药物的培养基进行处理；其中所采用的药物分别为上述式II化合物（Bi-lagand）、式III化合物（Tri-ligand）、顺铂（DDP）、双硫仑（DSF）以及DDP和DSF的混合物（二者摩尔浓度比为1:1），药物浓度梯度分别为100μM、20μM、4μM、0.8μM、0.16μM、0.032μM、0.0064μM、0.00128μM和0μM，并设置空白组不接种细胞；
（3）培养48小时后每孔加入5mg/mL MTT溶液20μL，置于37℃孵箱中避光孵育4小时，小心弃去培养基，尽量不要吸到孔底的甲瓒，加入DMSO将甲瓒溶解，置于摇床低速震荡10分钟，用酶标仪检测490nm波长处的OD值。
以0μM药物组为对照组，细胞存活率=（加药组OD值-空白组OD值）/（对照组OD值-空白组OD值）×100%，比较各种药物处理后细胞的存活情况，并计算每种药物在5种细胞中的IC50。
结果如下表1所示，结果显示，本发明的含铂化合物能对肺癌细胞产生明显的杀伤作用，尤其是III化合物（Tri-ligand），其无论是相对于DDP还是DSF都具有更为显著的杀伤能力，甚至强于DDP与DSF的联合使用。
由此可见，本发明的含铂化合物确实能对肺癌细胞产生非常显著的杀伤作用，其杀伤效果明显优于一线抗肿瘤药物顺铂，甚至优于顺铂与双硫仑的联合使用。
表1 不同化合物对于肺癌细胞杀伤作用评价（IC50,μM）
Bi-ligand
Tri-ligand
DDP
DSF
DDP+DSF
H1299
3.147
0.6253
9.136
16.84
1.125
H1975
8.346
0.5101
20.91
16.17
2.501
PC9
23.68
0.8951
2.696
-
1.322
H23
-
1.3375
10.3
19.4
2.118
H2228
-
2.99
20.53
44.99
7.098
H460
-
0.6363
7.319
89.49
4.118
实施例2 联合用药实验
（1）取对数生长期的A549、H2228细胞按一定密度（3000-5000/孔）接种于96孔板中；
（2）24小时后弃旧培养基，将细胞分别用含有不同浓度药物的培养基进行处理；其中所采用的药物分别为式III化合物（Tri-ligand）、顺铂（DDP）以及Tri-ligand和DDP的混合物（二者摩尔浓度比为1:1），药物浓度梯度分别为100μM、20μM、4μM、0.8μM、0.16μM、0.032μM、0.0064μM、0.00128μM和0μM，并设置空白组不接种细胞；
（3）培养48小时后每孔加入5mg/mL MTT溶液20μL，置于37℃孵箱中避光孵育4小时，小心弃去培养基，尽量不要吸到孔底的甲瓒，加入DMSO将甲瓒溶解，置于摇床低速震荡10分钟，用酶标仪检测490nm波长处的OD值。
以0μM药物组为对照组，细胞存活率=（加药组OD值-空白组OD值）/（对照组OD值-空白组OD值）×100%，比较各种药物处理后细胞的存活情况，并计算每种药物在5种细胞中的IC50。
结果如下图1所示，结果显示，本发明的含铂化合物Tri-ligand对于肺癌细胞的体外杀伤活性确实明显优于DDP，而当将Tri-ligand化合物与DDP联用时，其杀伤作用能够得到进一步地提升，尤其可以明确二者联用能够产生更为显著的肺癌细胞杀伤效果。
实施例3 含铂化合物对不同NSCLC克隆形成能力的影响
（1）在六孔板中每孔铺入约 500 到 2000 个细胞（H460及HCC827），根据实验目的的不同选择不同密度；
（2）24 小时待细胞贴壁后予以适当处理（药物或加入药物 12 小时后予辐照处理），继续培养 10 至 14 天，待单个细胞克隆生长至大于 50 个细胞为单位的克隆时停止培养；
（3）去除培养基上清，用 1×的 PBS 溶液，清洗 1 次，用 0.5%的结晶紫甲醇溶液染色，观察各组形成的克隆数量，进行拍照和统计并计算克隆形成率：克隆形成率=（平板克隆数目/铺板细胞总数）×100%。
结果如下图2所示。结果显示，本发明的含铂化合物能对肺癌细胞产生明显的杀伤作用，尤其是III化合物（Tri-ligand），其能够对非小细胞肺癌的克隆形成产生显著浓度依赖性的抑制作用，该抑制活性明显优于DDP及DSF；且相较于DDP与DSF的联合用药，Tri-ligand具有相似甚至更优的克隆形成抑制能力，而其所使用的药物浓度则远低于DDP和DSF的浓度。
进一步地，利用H460细胞进行进一步实验发现，在Tri-ligand基础上联合使用DDP或DSF，相对于单独用药来说，对H460细胞的克隆形成的抑制活性均有进一步的提升（参见图3）。
实施例4 含铂化合物对NSCLC成球能力的影响
选择H1299、H1975及H2228细胞进行成球实验，具体实验步骤如下：
（1）将细胞充分消化后，过45μm细胞滤网，将消化不完全的而粘连的非单个细胞去除；
（2）将过滤的细胞悬液稀释10倍后，取10μL均匀的细胞悬液于细胞计数板，使用全自动细胞计数仪进行细胞计数；
（3）按照每孔细胞数1000至2000个细胞，根据测得的细胞密度计算所需细胞悬液量；
（4）用不完全培养基稀释 B27、VEGF、EGF 等细胞因子至1×，配置成球实验细胞培养基并在超低吸附微孔板中铺板；
（5）于3至4天观察，每4至5天补充新的培养基；
（6）先成球后处理组在第3至4天观察到出现40μm细胞球时加入含有指定浓度药物的成球实验细胞培养基（处理组）及不含药物的培养基（对照组），培育至第10-14天。
所需试剂为：不完全培养基，B27 50×，VEGF/EGF 1000×（Human VEGF，HumanEGF）、超低吸附微孔板（corning），实验全程应使用配置的成球实验培养基培养细胞球。
结果如下图4-5所示。从图中可以看出，在使用本发明的含铂化合物尤其是Tri-ligand后，无论是肺癌细胞的克隆数还是径长相对于其他组别均得到了明显降低，其在体外对肺癌细胞成球能力的抑制作用远远超过单独使用DDP和DSF的作用，甚至明显优于DDP和DSF二者的联合使用，以上差异具有统计学意义。
实施例5 体内抗肿瘤实验
为进一步确认含铂化合物在肺癌中的效果，选择了Tri-ligand作为示例以验证其在体内的抗肿瘤效果。
选择4-6周龄左右雄性裸鼠进行A549细胞皮下移植瘤生长抑制实验，具体实验方法如下：
（1）体外培养A549细胞，搜集对数生长期细胞消化、离心，用PBS重悬；
（2）将4×106细胞分别接种至35只裸鼠右侧肩胛部皮下；
（3）待成瘤后，选取25只肿瘤大小一致的裸鼠随机分为5组，每组5只，采用瘤内注射给药。
具体给药方案如下（每周）：组1给予DMSO，组2给予DDP（15mg/kg，溶剂为DMSO），组3给予DSF（30mg/kg，溶剂为DMSO），组4给予DDP+DSF（DDP 15mg/kg，DSF 30mg/kg，溶剂为DMSO），组5给予Tri-ligand（15mg/kg，溶剂为DMSO）。每天给药一次，定期测量小鼠肿瘤长径(a)与短径(b)以及小鼠的体重。
肿瘤体积计算公式为:V=1/2×a×b2。
关于小鼠体内肿瘤体积的变化结果如图6所示。结果显示，组2和组3小鼠肿瘤体积相对于组1并没有显著性差异，意味着使用改剂量的DDP或DSF并不能有效抑制肿瘤的生长；但将DDP和DSF联合使用时，能够有效抑制肿瘤的生长，其相对于组1的差异具有统计学意义（p＜0.05）；而使用Tri-ligand进行治疗的组4对于肿瘤的生长抑制作用更为显著（p＜0.01），其甚至优于DDP和DSF联合使用的组3。
关于实验期间小鼠体重变化趋势结果如图7所示。结果显示，组2、组3和组5小鼠体重相对于组1并没有显著性变化，而使用DDP和DSF处理的组4小鼠的体重则出现了明显下降，该差异相对于组1具有统计学意义（p＜0.001）。由此可见，使用Tri-ligand的安全性明显优于DDP和DSF的联合用药。
进一步地，在给药结束后对小鼠体内肿瘤进行分离，各组小鼠肿瘤体积图片如图8所示，其与上述小鼠体内肿瘤变化趋势结果相一致。
由上述结果可以明确，本发明的含铂化合物，尤其是Tri-ligand无论是在体内、外均能对肺癌细胞产生显著的生长抑制作用，其效果明显优于临床用于治疗肺癌的一线治疗方案建议药物（顺铂）甚至是最新研究用于改善顺铂耐药性的DDP+DSF联合用药方案，同时Tri-ligand所展现的在体内的安全性也要优于DDP+DSF联合用药方案。由此明确了含铂化合物，尤其是Tri-ligand在治疗肺癌方面的功能效果。对于此，本发明为肺癌，尤其是非小细胞肺癌提供了一种新的治疗策略，能够有效扩大肺癌的用药谱，改善肺癌一线治疗药物顺铂效果差、易出现耐药性等现状。本发明对于改善肺癌的预后有重要作用，具有十分重要的临床意义和社会意义。
以上具体实施方式部分对本发明所涉及的分析方法进行了具体的介绍。应当注意的是，上述介绍仅是为了帮助本领域技术人员更好地理解本发明的方法及思路，而不是对相关内容的限制。在不脱离本发明原理的情况下，本领域技术人员还可以对本发明进行适当的调整或修改，上述调整和修改也应当属于本发明的保护范围。
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