具体实施方式

文库片段是较大或较长DNA片段的尺寸相似(例如，<1000bp)的脱氧核糖核酸(DNA)片。如果可鉴定长DNA片段源自共同来源隔室，则可在测序数据中将文库片段组合在一起。可能期望不同长度DNA片段的隔室化，以便实现合成长读段的每个隔室内的亚单倍体基因组含量。当可基于长DNA片段源自隔室的鉴定将多个短片段组合在一起时，启用合成长读段(或连锁短读段)。隔室化已例如使用孔、珠、小滴或其他物理隔室以物理方式实现。

所有这些隔室化方法共同的原理是：使用条形码序列或索引序列来鉴定长DNA片段源自的隔室。附接到较短片段中的每个较短片段的条形码序列对特定的长DNA片段可以是唯一的，因此可有助于在文库制备期间标记不同的隔室。它是条形码序列，该条形码序列用于基于短读段全部源自相同隔室的假设将短读段组合在一起以形成合成的长读段。

本文所公开的示例性方法实现了不同文库片段的隔室化，而不必掺入独特的条形码序列。该方法利用邻近性保留文库片段和成像来形成一系列基于时间的簇生成图像。每个基于时间的簇生成图像可用于识别生成特定组模板链的样品(隔室)。此外，可使用基于时间的簇生成图像对每个序列读段进行组合。该组合允许读段连锁，从而实现长DNA片段的重构。

定义

除非另外指明，否则本文所用的术语应理解为具有其在相关领域中的普通含义。下面列出本文所用的若干术语及其含义。

如本文所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括单数和复数两者，除非上下文另有明确指示。如本文所用，术语“包含”与“包括”、“含有”或“特征在于”同义，并且是包括性的或开放式的，并且不排除另外的未列举的要素或方法步骤。

本说明书通篇提及的“一个示例”、“另一个示例”、“示例”等意指结合该示例描述的特定要素(例如，特征、结构、组成、构型和/或特性)包括在本文所述的至少一个示例中，并且可或可不存在于其他示例中。此外，应当理解，用于任何示例的所述元素可以任何合适的方式组合在各种示例中，除非上下文另有明确说明。

在本公开(包括权利要求)通篇中使用的术语“基本上”和“约”用于描述和说明有小波动，诸如由于处理中的变化引起的。例如，这些术语可以指小于或等于规定值的±5％，诸如小于或等于规定值的±2％，诸如小于或等于规定值的±1％，诸如小于或等于规定值的±0.5％，诸如小于或等于规定值的±0.2％，诸如小于或等于规定值的±0.1％，诸如小于或等于规定值的±0.05％。

接头：可以例如通过连接或标记与核酸分子融合的线性寡核苷酸序列。合适的接头长度可在约10个核苷酸至约100个核苷酸或约12个核苷酸至约60个核苷酸或约15个核苷酸至约50个核苷酸的范围内。接头可包括核苷酸和/或核酸的任何组合。在一些示例中，接头可以包括与引物(例如，包括通用核苷酸序列(诸如P5或P7序列)的引物)的至少一部分互补的序列。例如，在片段的一个末端处的接头包括与第一流通池引物的至少一部分互补的序列，并且在片段的另一个末端处的接头包括与第二流通池引物的至少一部分相同的序列。互补接头可与第一流通池引物杂交，并且该相同接头是用于其互补拷贝的模板，该互补拷贝可在簇生成期间与第二流通池引物杂交。在一些示例中，接头可以包括测序引物序列或测序结合位点。可将不同接头的组合掺入核酸分子(诸如DNA片段)中。

捕获位点：流通池表面的已经被物理改性和/或用允许定位复合物的化学性质改性的一部分。在一个示例中，捕获位点可包括化学捕获剂(即，能够附接、保留或结合靶分子(例如，复合物)的材料、分子或部分)。一个示例性化学捕获剂包括能够结合靶分子(或结合附接到靶分子的连接部分)的受体-配体结合对的成员(例如，抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、生物素、凝集素、碳水化合物、核酸结合蛋白、表位、抗体等)的成员。化学捕获剂的再一个示例是能够与复合物形成静电相互作用、氢键或共价键(例如，硫醇-二硫化物交换、点击化学、Diels-Alder等)的化学试剂。

复合物：载体，诸如固体支持物，以及附接到载体的即用测序核酸片段。载体还可包括结合对的一个成员，其另一个成员是捕获位点的一部分。

片段：遗传物质的一部分或片(例如，DNA、RNA等)。邻近性保留文库片段是较长核酸样品的已被片段化的较小片，其中较小片段以某种方式(例如，通过珠、用转座体等)保持在一起。

核酸分子或样品：任何长度的核苷酸的聚合物形式，并且可包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、它们的类似物或它们的混合物。该术语可指单链或双链多核苷酸。

“模板”核酸分子(或链)可指待分析的序列。

核酸样品中的核苷酸可包括天然存在的核酸及其功能类似物。功能类似物的示例能够以序列特异性方式与核酸杂交或能够用作复制特定核苷酸序列的模板。天然存在的核苷酸通常具有含有磷酸二酯键的主链。类似结构可以具有替代的主链键，包括本领域已知的多种主链键中的任一种。天然存在的核苷酸通常具有脱氧核糖(例如，存在于DNA中)或核糖(例如，存在于RNA中)。类似结构可以具有替代的糖部分，包括本领域已知的多种糖部分中的任一种。核苷酸可以包括天然或非天然碱基。天然DNA可以包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和/或鸟嘌呤中的一种或多种，并且天然RNA可以包括腺嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶和/或鸟嘌呤中的一种或多种。可使用任何非天然碱基，诸如锁核酸(LNA)和桥核酸(BNA)。

引物：可与靶序列杂交的核酸分子，诸如附接到邻近性保留文库片段的接头。例如，扩增引物可以用作模板扩增和簇生成的起始点。又如，合成的核酸(模板)链可包括引物(例如，测序引物)可以与之杂交的位点，以便引发与合成的核酸(模板)链互补的新链的合成。任何引物可以包括核苷酸或其类似物的任何组合。在一些示例中，引物是单链寡核苷酸或多核苷酸。引物长度可以是任何数目的碱基长度并且可包括多种天然和/或非天然核苷酸。在一个示例中，测序引物为短链，范围为10至60个碱基，或20至40个碱基。

即用测序核酸片段：遗传物质在3'和5'末端具有接头的一部分(例如，邻近性保留文库片段)。在即用测序核酸片段中，每个接头包括已知的通用序列(例如，其与流通池上的引物的至少一部分互补)和测序引物序列。即用测序核酸片段可经由插入与固体支持物(例如，珠)的表面结合的转座子而结合，或者通过结合对或其他可裂解连接基直接固定。

固体支持物：由刚性或半刚性材料制成的小主体，其形状的特征在于例如球形、椭圆形、微球形或其他公认的颗粒形状，无论是具有规则还是不规则的尺寸。固体支持物可以具有与其附接的测序文库。可用于固体支持物的示例性材料包括但不限于玻璃；塑料，诸如丙烯酸、聚苯乙烯或苯乙烯与另一种材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯或聚四氟乙烯(得自The Chemours Co的)；多糖或交联多糖，诸如琼脂糖或琼脂糖凝胶；尼龙；硝化纤维；树脂；二氧化硅或基于二氧化硅的材料，包括硅和改性硅；碳纤维、金属；无机玻璃；光纤束，或多种其他聚合物。示例性固体支持物包括可控孔玻璃珠、顺磁珠、氧化钍溶胶、珠(交联珠形式的琼脂糖，可购自Cytivia)、纳米晶体和本领域已知的其他固体支持物，如例如在来自Bangs Laboratories,Fishers Ind.的Microsphere Detection Guide中所述。

转座体：在整合酶(例如统合酶或转座酶)与可转移链、非可转移链或可转移链和非可转移链两者之间形成的复合物。

邻近性保留文库片段

在本文所公开的示例中，被引入流通池中的文库片段是邻近性保留文库片段。邻近性保留文库片段是较长核酸样品的已被片段化的较小片，其中较小片以某种方式物理地保持在一起。在本文所公开的一些示例中，可在文库制备中使用固体支持物来保留邻近性。在本文所公开的其他示例中，可通过下列方式来保留邻近性：在初始文库制备期间通过结合的转座体形成彼此附接的片段，将所附接的片段引入流通池中，然后在流通池上完成文库制备。

图1描绘了用于形成复合物10的方法的示例，该复合物包括即用测序核酸片段12，该即用测序核酸片段包括来自较大核酸样品的片段14，其邻近性在固体支持物16上得以保留。

在用以形成图1所示的复合物10的一种示例性方法中，接头序列18通过结合对的一个成员20结合到固体支持物16。在一个示例中，该接头序列18可包括第一测序引物序列(例如读段1测序引物序列)和第一序列(P5')，该第一序列与流通池(如图5A和图5B所示)上的扩增引物中的一个扩增引物(例如P5)的至少一部分互补。接头序列18结合到结合对(例如生物素)的一个成员20，使得其可结合到固体支持物16的表面，该固体支持物包括结合对的另一个成员(例如，抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白等)。

如图1所示，转座体复合物24”也可结合到固体支持物16。在将转座体复合物24”上样在固体支持物16上之前，可将部分Y-接头25'与转座酶32(虽然未示出，但其可包括两个Tn5分子)混合以形成转座体复合物24”的示例。部分Y-接头25'可包括彼此杂交的两个镶嵌末端序列M₁、M₂。镶嵌末端序列中的一个镶嵌末端序列M₁具有能够在标记期间附接到片段化DNA链的游离末端，因此类似于图2A至图2C中的转移链26。镶嵌末端序列中的另一个镶嵌末端序列M₂可附接到第二测序引物序列(例如，读段2测序引物序列)和第二序列(P7)，该第二序列具有与流通池上的扩增引物中的另一扩增引物(P7)的至少一部分相同的序列，使得其拷贝(例如，P7')与扩增引物(P7)互补。在该示例中，镶嵌末端序列中的另一个镶嵌末端序列M₂、第二测序引物序列和第二序列构成接头序列22。接头序列22在标记期间不附接到片段化DNA链上，因此类似于图2A至图2C中的非转移链28。

将转座体复合物24”上样在固体支持物16上可涉及将转座体复合物24”与固体支持物16混合，并将该混合物暴露于用于将部分Y-接头25'的镶嵌末端M₁连接到接头序列18的3'末端的合适条件。如图1所示，各个转座体复合物24”可附接到固体支持物16上的接头序列中的每个接头序列18。

在用以形成复合物10的该示例性方法中，然后可执行标记过程。可将包括较长核酸样品30(例如DNA)的流体(例如标记缓冲液)添加到具有与其结合的接头序列18和转座体复合物24”的固体支持物16。当样品接触转座体复合物24”时，较长核酸样品被标记。在该标记示例期间，样品30被片段化为片段14、14'，并且片段14、14'中的每个片段在其5'末端处用部分Y-接头25'的镶嵌末端M₁的游离末端加标签。

如图1所示，较长核酸样品30的标记导致转座体复合物24”之间的多个桥接分子。桥接分子包裹在固体支持物16周围。转座体复合物24”和接头序列18作为桥接分子保持核酸样品30的邻近性，因此桥接分子是邻近性保留文库片段14、14'。

然后可经由十二烷基硫酸钠(SDS)处理或加热或蛋白酶K消化来去除转座酶。转座酶的去除留下附接到固体支持物16的邻近性保留文库片段14、14'。

为了完成即用测序片段，进行进一步的延伸和连接(在图1中用星号表示)以确保片段14和14'附接到序列22。所得的复合物10在图1中示出。

每个邻近性保留文库片段14、14'是相应的即用测序核酸片段12、12'的一部分，该相应的即用测序核酸片段中的每一个即用测序核酸片段还包括在任一末端处附接的相应的接头序列18和22。接头序列18是最初与固体支持物16结合的那些，并且包括第一测序引物序列以及与流通池引物中的一个流通池引物互补的第一序列。接头序列18附接到结合对的一个成员20。接头序列22来自部分Y-接头25'，并且包括与另一个流通池引物相同的第二序列以及第二测序引物序列。因为每个即用测序核酸片段14、14'包括用于桥扩增和测序的合适接头，所以不进行PCR扩增。因此这些片段12、12'是即用测序的。此外，因为邻近性保留文库片段14、14'来自相同的较长核酸样品30，所以邻近性保留文库片段14、14'可适用于本文所公开的连锁长读段应用。

用于形成另一个示例性复合物10'(图2C)的另一种示例性方法描绘于图2A至图2C中。

在该示例性方法中，接头序列18'通过结合对的一个成员20结合到固体支持物16。在一个示例中，该接头序列18'可包括可杂交序列H、第一测序引物序列(例如读段1测序引物序列)和第一序列(例如P5)，该第一序列与流通池上的扩增引物中的一个扩增引物(例如P5)的至少一部分相同，使得其拷贝(例如，P5')与扩增引物(P5)互补。接头序列18'结合到结合对(例如生物素)的一个成员20，使得其可结合到固体支持物16的表面，该固体支持物包括结合对的另一个成员(例如，抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白等)。

如图2A所示，转座体复合物24也可结合到固体支持物16。在将转座体复合物24上样在固体支持物16上之前，可将L-接头21与转座酶32(例如包括两个Tn5分子)混合以形成转座体复合物24的示例。L-接头21可包括彼此杂交的两个镶嵌末端序列M₁、M₂。镶嵌末端序列中的一个镶嵌末端序列M₁是转移链26，该转移链在标记过程之后发生的连接过程期间被添加到每个片段14、14'的一个末端。镶嵌末端序列中的另一个镶嵌末端序列M₂是在连接和标记过程之后移除的非转移链28的一部分。该镶嵌末端序列M₂附接到互补的可杂交序列HC，该互补的可杂交序列与附接至固体支持物16的接头序列18'的可杂交序列H互补。互补的可杂交序列HC使得L-接头21能够与接头序列18'杂交。因此，互补的可杂交序列HC使得转座体复合物24能够上样到固体支持物上。

将转座体复合物24上样在固体支持物16上可涉及将转座体复合物24与固体支持物16混合，并将该混合物暴露于适合L-接头21的互补可杂交序列HC与接头序列18'的可杂交序列H杂交的条件。如图2A所示，各个转座体复合物24可附接到固体支持物16上的接头序列中的每个接头序列18'。

在用以形成复合物10'的该示例性方法中，然后执行标记过程。可将包括较长核酸样品(例如DNA)30的流体(例如标记缓冲液)添加到具有上样在其上的转座体复合物24的固体支持物16。当样品30接触固体支持物结合的转座体复合物24时，较长核酸样品30被标记。在该标记示例期间，样品30被片段化为片段14、14'，并且片段14、14'中的每个片段在其5'末端处用L-接头21的镶嵌末端序列M₁加标签。

如图2A所示，较长核酸样品30的标记导致相邻转座体复合物24，因此相邻接头序列18'之间的多个桥接分子。桥接分子包裹在固体支持物16周围。转座体复合物24和接头序列18'作为桥接分子保持核酸样品30的邻近性，因此桥接分子是邻近性保留文库片段14、14'。

然后可经由十二烷基硫酸钠(SDS)处理或加热或蛋白酶K消化来去除转座酶32。

然后可执行连接以将游离的镶嵌末端序列M₁结合到相应的接头序列18'。在图2A中，星号表示在何处执行连接。在一个示例中，可通过下列方式来引发连接：引入含有合适的连接酶的缓冲液并将其加热到大约合适的温度持续合适的时间以引发酶活性。合适的连接酶的示例包括大肠杆菌(E.Coli)DNA连接酶、T7连接酶等。在一个示例中，含有大肠杆菌DNA连接酶的缓冲液还可包括烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)。在该示例中，加热到约16℃持续约15分钟会引发酶活性。所得的结构在图2B中示出。

然后可移除L-接头21的非转移链28。在该示例中，使用任何合适的5'-3'核酸外切酶23(诸如T7核酸外切酶)移除非转移链中的每条非转移链28。在一个示例中，可通过引入含有5'-3'核酸外切酶23的缓冲液并等待预先确定的时间来引发非转移链移除。5'-3'核酸外切酶23能够在室温(例如，约22℃至约25℃)下消化非转移链28，因此不使用额外加热。然后可洗掉消化的非转移链28。

使用核酸外切酶移除非转移链28可能比使用热变性更可取。5'-3'核酸外切酶23有效地消化非转移链28，从而产生更纯化的模板(与使用热变性时相比)以用于随后附接的接头序列(参见图2C中的附图标号22)的杂交。这可提高文库产量。另外，经由5'-3'核酸外切酶23移除非转移链28可提高富含腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)的区域上的文库覆盖度，其损失已在非转移链28热变性之后观察到(参见图11)。此外，经由核酸外切酶的消化不增加总体文库制备过程的时间。

现在参见图2C，用以形成复合物10'的该方法示例涉及引入部分Y-接头25。部分Y-接头25包括与镶嵌末端序列M₁互补的镶嵌末端序列M₃和接头序列22。接头序列22可包括第二测序引物序列(例如读段2测序引物序列)和第二序列(P7')，该第二序列与流通池上的扩增引物中的另一个扩增引物(P7)互补。如图2C所示，部分Y-接头25的镶嵌末端序列M₃与转移链26的镶嵌末端序列M₁杂交(现在连接到接头序列18')，因此将部分Y-接头25连接到固体支持物16。

在本文所公开的示例中，接头序列18、18'和/或22还可包括测序样品索引或条形码序列。这些序列可用作本文所公开的隔室化方法的备份或替代。

为了生成即用测序片段，执行进一步的延伸和连接以确保片段14和14'附接到镶嵌末端序列M₃，从而附接到序列22。

所得的复合物10'在图2C中示出。

用于形成复合物10'(在图2C中示出)的另一种示例性方法部分地描绘于图3中。在该示例性方法中，转移链26的连接和非转移链28的消化作为单一的单釜方案的一部分执行。

在该示例性方法中，接头序列18'通过结合对的一个成员20结合到固体支持物16。可使用如参考图2A所述的接头序列18'，该接头序列包括可杂交序列H、第一测序引物序列(例如读段1测序引物序列)和第一序列(P5)，该第一序列与流通池上的扩增引物中的一个扩增引物(例如P5)的至少一部分相同，使得其拷贝(例如，P5')与扩增引物(P5)互补。同样在该示例性方法中，将转座体复合物24上样在固体支持物16上，如参考图2A所述的。简而言之，转座体复合物24的L-接头21的互补可杂交序列HC与接头序列18'的可杂交序列H杂交。

在用以形成复合物10'的该示例性方法中(图2C)，如参考图2A所述的那样执行标记。

然后可一起执行转移链26的连接和非转移链28的消化。这在图3中示意性地示出。为了使连接酶和核酸外切酶协同作用，被引入所标记的固体支持物中的试剂配方包括缓冲液、连接酶、5'-3'核酸外切酶23(例如T7核酸外切酶)以及相应酶所需的任何其他组分(例如辅因子，诸如NAD⁺)。在一个示例中，可通过以下方式引发连接和消化：引入试剂配方并加热到约25℃保持约15分钟以引发酶活性。

将连接酶和核酸外切酶掺入相同试剂配方中可缩短方案时间(例如，与图2A至图2C所示的示例性方法相比缩短约10分钟)，并且还减少洗涤步骤的数量。

然后该方法示例继续引入部分Y-接头25，如参考图2C所述。为了生成即用测序片段和最终复合物10'，执行进一步的延伸和连接以确保片段14和14'附接到镶嵌末端序列M₃，从而附接到序列22。

参考图1、图2A-图2C和图3所述的用于制备复合物10、10'的方法提供了一些示例，但应当理解，只要即用测序核酸片段12、12'附接到固体支持物16，就可使用其他方法。

在本文所公开的其他示例中，可通过从流通池执行文库制备的一部分和在流通池上执行文库制备的一部分来保留邻近性信息。

在该示例中，可使用标记在流通池外部引发文库制备，如图4中示意性地示出。

在所示的示例中，包括较长核酸样品30(例如双链DNA)的流体(例如标记缓冲液)可与转座体复合物24'混合。在图4所示的示例中，每种转座体复合物24'均是二聚体，包括转移链26'、非转移链28'和两种转座酶(它们在图4中统称为“32”)。在其他示例中，可使用不同的转座体复合物，例如这些转座体复合物中的一种转座体复合物包括转座酶32和转移链26'，并且这些转座体复合物中的另一种转座体复合物包括转座酶32和非转移链28'。

在该示例中，转移链26'是在标记过程期间添加到每个片段14、14'的一个末端中的接头。在一个示例中，每条转移链26是包括第一测序引物序列(例如读段1测序引物序列)和第一序列(P5')的接头，该第一序列与流通池上的扩增引物中的一个扩增引物(例如P5)的至少一部分互补。

在该示例中，非转移链28'是这样的接头：其在标记期间未掺入到片段14、14'中，而是随后可连接到每个片段14、14'的另一个末端。如图4所示，非转移链28'可在标记期间经由至少部分的碱基配对附接到转移链26'。在该示例中，非转移链28'为包括第二测序引物序列(例如读段2测序引物序列)和第二序列(P7)的接头，该第二序列与流通池上的扩增引物中的一个扩增引物(例如P7)的至少一部分相同，使得其拷贝(例如P7')与扩增引物(P7)互补。

如图4所示，在流体内，转座体24'将较长的核酸样品30片段化成片段14、14'，并将转移链26'连接到每个片段14、14'的5'末端。在一个示例中，通过单侧转座将转移链26'掺入到较长核酸样品30的每个片段14、14'的5'-末端。非转移链28'可经由碱基配对附接到转移链26'。

该示例性标记方法保持较长核酸样品30的邻近性，这是因为所生成的片段14、14'(以及直接或间接与其附接的任何转移链26'和非转移链28')通过转座酶32保持彼此附接。所附接的邻近性保留文库片段14、14'在本文中被称为附接片段34。

如本文所提及的，可将附接片段34引入流通池中，在流通池中可执行另外的处理以完成文库制备。这在图8中示意性地示出，并将参考本文所公开的方法进一步描述。

流通池

本文所公开的方法可利用流通池36，该流通池的示例描绘于图5A中。流通池36包括至少部分地限定通道或流动通道40的基底38。

基底38可为单层/单一材料。合适的单层基底的示例包括：环氧硅氧烷、玻璃、改性的或官能化的玻璃、塑料(包括丙烯酸、聚苯乙烯以及苯乙烯和其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、聚四氟乙烯(诸如得自Chemours的)、环烯烃/环烯烃聚合物(COP)(诸如得自Zeon的)、聚酰亚胺等)、尼龙(聚酰胺)、陶瓷/陶瓷氧化物、二氧化硅、熔融的二氧化硅或基于二氧化硅的材料、硅酸铝、硅和改性的硅(例如，硼掺杂的p+硅)、氮化硅(Si₃N₄)、氧化硅(SiO₂)、五氧化二钽(Ta₂O₅)或其他氧化钽(TaO_x)、氧化铪(HaO₂)、碳、金属、无机玻璃等。基底38也可为多层结构。多层结构的一些示例包括玻璃或硅，在表面处具有氧化钽或另一种陶瓷氧化物的涂层。多层结构的其他示例包括其上具有图案化树脂的基础支持物(例如，玻璃或硅)。多层基底的其他示例可包括绝缘体上硅(SOI)基底。

在一个示例中，基底38可具有在约2mm至约300mm范围内的直径，或者为最大尺寸高达约10英尺(约3米)的矩形片材或面板。在一个示例中，基底38为直径在约200mm至约300mm范围内的晶片。在另一个示例中，基底38是宽度在约0.1mm至约10mm范围内的管芯。虽然已经提供了示例性尺寸，但应当理解，可使用具有任何合适尺寸的基底38。又如，可使用作为矩形支持物的面板，该面板具有比300mm圆形晶片更大的表面积。

在图5A所示的示例中，流通池36包括流动通道40。虽然示出了若干流动通道40，但应当理解，流通池36中可包括任何数量的通道40(例如，单个通道40、四个通道40等)。每个流动通道40是限定在两个粘结部件之间(例如，基底36和盖之间或者两个基底36之间)的区域，该流动通道可具有引入其中并从其移除的流体(例如，本文所述的那些)。每个流动通道40可与每个其他流动通道40分离，使得引入任何特定流动通道40中的流体不流到任何相邻的流动通道40中。引入流动通道40中的流体的一些示例可引入反应组分(例如，邻近性保留文库片段14、14'(例如，位于固体支持物16上或彼此附接)、聚合酶、测序引物、核苷酸等)、洗涤溶液、解封闭剂等。

可使用部分地取决于基底38的材料的任何合适的技术将流动通道40限定在基底38中。在一个示例中，将流动通道40蚀刻到玻璃基底38中。在另一个示例中，可使用光刻、纳米压印光刻等将流动通道40图案化到多层基底38的树脂中。在又一个示例中，可将单独的材料(未示出)施加到基底38上，使得单独的材料限定流动通道40的壁，并且基底38限定流动通道40的底部。

在一个示例中，流动通道40具有直线构型。流动通道40的长度和宽度可分别小于基底38的长度和宽度，使得基底表面的围绕流动通道40的部分可用于附接到盖(未示出)或另一基底38。在一些情况下，每个流动通道40的宽度可以为至少约1mm、至少约2.5mm、至少约5mm、至少约7mm、至少约10mm或更大。在一些情况下，每个通道/流动通道40的长度可以为至少约10mm、至少约25mm、至少约50mm、至少约100mm或更大。每个流动通道40的宽度和/或长度可以大于、小于上文指定的值或介于它们之间。在另一个示例中，流动通道40是正方形(例如，10mm×10mm)。

当使用微接触、气溶胶或喷墨印刷来沉积限定流动通道壁的单独材料时，每个流动通道40的深度可以小至单层厚。当使用单独的材料(未示出)将盖粘结到基底38或将两个基底38粘结在一起时，深度可以更大。对于其他示例，每个流动通道40的深度可以为约1μm、约10μm、约50μm、约100μm或更大。在一个示例中，深度可在约10μm至约100μm的范围内。在另一个示例中，深度可在约10μm至约30μm的范围内。在又一个示例中，深度为约5μm或更小。应当理解，每个流动通道40的深度大于、小于上文指定的值或介于它们之间。

流通池36的流动通道40内的架构的不同示例在图5B和图5C中示出。

在图5B所示的示例中，流通池36包括单层基底38A和至少部分地限定在单层基底38A中的流动通道40。

聚合物水凝胶42存在于流动通道40中。聚合物水凝胶42的示例包括丙烯酰胺共聚物，诸如聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)—PAZAM。PAZAM和丙烯酰胺共聚物的一些其他形式由以下结构(I)表示：

其中：

R^A选自叠氮基、任选地取代的氨基、任选地取代的烯基、任选地取代的炔烃、卤素、任选地取代的腙、任选地取代的肼、羧基、羟基、任选地取代的四唑、任选地取代的四嗪、腈氧化物、硝酮、硫酸盐和硫醇；

R^B为H或任选地取代的烷基；

R^C、R^D和R^E各自独立地选自H和任选地取代的烷基；

-(CH₂)_p-中的每一者可任选地被取代；

p为在1至50范围内的整数；

n为在1至50,000范围内的整数；以及

m为在1至100,000范围内的整数。

本领域的普通技术人员将认识到，结构(I)中反复出现的“n”和“m”特征的布置是代表性的，并且单体亚单元可以任何顺序存在于聚合物结构中(例如，无规、嵌段、图案化或它们的组合)。

丙烯酰胺共聚物的其他形式和PAZAM的分子量可在约5kDa至约1500kDa或者约10kDa至约1000kDa的范围内，或者在一个具体示例中可为约312kDa。

在一些示例中，丙烯酰胺共聚物的其他形式和PAZAM为直链聚合物。在一些其他示例中，丙烯酰胺共聚物的其他形式和PAZAM为轻度交联的聚合物。

在其他示例中，聚合物水凝胶42可为结构(I)的变型。在一个示例中，丙烯酰胺单元可用N,N-二甲基丙烯酰胺替换。在该示例中，结构(I)中的丙烯酰胺单元可用替换，其中R^D、R^E和R^F各自为H或C1-C6烷基，并且R^G和R^H各自为C1-C6烷基(而不是H，如丙烯酰胺的情况)。在该示例中，q可为1至100,000范围内的整数。在另一个示例中，除了丙烯酰胺单元之外，还可使用N,N-二甲基丙烯酰胺。在该示例中，除了反复出现的“n”和“m”特征之外，结构(I)还可包括其中R^D、R^E和R^F各自为H或C1-C6烷基，并且R^G和R^H各自为C1-C6烷基。在该示例中，q可为1至100,000范围内的整数。

作为初始聚合物水凝胶的另一个示例，结构(I)中反复出现的“n”特征可用包括具有结构(II)的杂环叠氮基基团的单体替换：

其中R¹为H或C1-C6烷基；R₂为H或C1-C6烷基；L为包括直链的连接基，其具有2至20个选自碳、氧和氮的原子以及链中的碳和任何氮原子上的10个任选取代基；E为直链，其包括1至4个选自由碳、氧和氮组成的组的原子以及链中的碳和任何氮原子上的任选取代基；A为具有附接到N上的H或C1-C4烷基的N取代的酰胺；并且Z为含氮杂环。Z的示例包括作为单个环状结构或稠合结构存在的5至10个环成员。

又如，聚合物水凝胶42可包括结构(III)和(IV)中的每一者的反复出现的单元：

其中R^1a、R^2a、R^1b和R^2b中的每一者独立地选自氢、任选地取代的烷基或任选地取代的苯基；R^3a和R^3b中的每一者独立地选自氢、任选地取代的烷基、任选地取代的苯基或任选地取代的C7-C14芳烷基；并且每个L¹和L²独立地选自任选地取代的亚烷基连接基或任选地取代的杂亚烷基连接基。

应当理解，其他分子可用于形成聚合物水凝胶42，只要它们被官能化以将寡核苷酸引物44、46与其接枝即可。合适的聚合物层的其他示例包括具有胶态结构的那些，诸如琼脂糖；或具有聚合物网状结构的那些，诸如明胶；或具有交联聚合物结构的那些，诸如聚丙烯酰胺聚合物和共聚物、不含硅烷的丙烯酰胺(SFA)或SFA的叠氮化版本。合适的聚丙烯酰胺聚合物的示例可由丙烯酰胺和丙烯酸或含有乙烯基基团的丙烯酸合成，或由形成[2+2]光环加成反应的单体合成。合适的聚合物水凝胶42的另外其他示例包括丙烯酰胺和丙烯酸酯的混合共聚物。含有丙烯酸类单体(例如，丙烯酰胺、丙烯酸酯等)的多种聚合物架构可用于本文所公开的示例中，诸如支链聚合物，包括星型聚合物、星形或星型嵌段聚合物、树枝状体等。例如，单体(例如，丙烯酰胺、含有催化剂的丙烯酰胺等)可以无规或嵌段方式掺入到星形聚合物的支链(臂)中。

为了将聚合物水凝胶42引入流动通道40中，可生成聚合物水凝胶42的混合物，然后将该混合物施加到基底38A(具有至少部分地限定于其中的流动通道40)上。在一个示例中，聚合物水凝胶42可存在于混合物(例如，与水的混合物或与乙醇和水的混合物)中。然后可使用旋涂、浸渍或浸涂、喷涂、正压或负压下的材料流或另一种合适的技术将混合物施加到基底表面(包括在流动通道40中)。这些类型的技术将聚合物水凝胶42毯覆式地沉积在基底38A上(例如，沉积在流动通道40中和沉积在围绕流动通道40的间隙区域48上)。可使用其他选择性沉积技术(例如，涉及掩模、受控印刷技术等)来将聚合物水凝胶42特定地沉积在流动通道40中而不是沉积在间隙区域48上。

在一些示例中，可活化基底表面(包括暴露在流动通道40中的部分)，然后可向其施加混合物(包括聚合物水凝胶42)。在一个示例中，可使用气相沉积、旋涂或其他沉积方法将硅烷或硅烷衍生物(例如，降冰片烯硅烷)沉积在基底表面上。在另一个示例中，可将基底表面暴露于等离子体灰化，以产生可以附着到聚合物水凝胶42的表面活化剂(例如，-OH基团)。

取决于聚合物水凝胶42，所施加的混合物可暴露于固化过程。在一个示例中，固化可在室温(例如，约25℃)至约95℃范围内的温度下进行约1毫秒至约几天范围内的时间。

在一些实施例中，然后可进行抛光，以便从流动通道40的周界处的空隙区域48移除聚合物水凝胶42，同时使在表面上的聚合物水凝胶42在流动通道40中至少基本上完整。

流通池36还包括扩增引物44、46。

可执行接枝过程，以将扩增引物44、46接枝到流动通道40中的聚合物水凝胶42。在一个示例中，扩增引物44、46可以通过引物44、46的5'末端处或其附近的单点共价附接固定到聚合物水凝胶42。该附接使i)引物44、46的接头特异性部分自由退火到其同源核酸片段(例如附接到片段14、14'的P5'部分)，以及ii)3'羟基基团自由用于引物延伸。任何合适的共价附接均可用于此目的。可使用的封端引物的示例包括炔烃封端的引物，该引物可附接到聚合物水凝胶42的叠氮化物部分。合适的引物44、46的具体示例包括在Illumina Inc.销售的商业流通池的表面上使用P5和P7引物，以在HISEQ^TM、HISEQX^TM、MISEQ^TM、MISEQDX^TM、MINISEQ^TM、NEXTSEQ^TM、NEXTSEQDX^TM、NOVASEQ^TM、GENOME ANALYZER^TM、ISEQ^TM和其他仪器平台上进行测序。

在一个示例中，接枝可涉及流动通过沉积(例如，使用暂时性结合或永久性结合的盖)、泡涂、喷涂、搅打分配或通过将引物44、46附接到流动通道42中的聚合物水凝胶42的另一种合适方法。这些示例性技术中的每一种技术可利用引物溶液或混合物，该引物溶液或混合物可包括引物44、46；水；缓冲液；和催化剂。采用接枝方法中的任一种方法，引物44、46与流动通道40中的聚合物水凝胶42的反应性基团反应，并且对周围基底38A不具有亲和力。因此，引物44、46选择性地接枝到流动通道40中的聚合物水凝胶42。

在图5C所示的示例中，流通池38包括多层基底38B，该多层基底包括支持物52和定位在支持物52上的图案化材料50。图案化材料50限定由间隙区域48分开的凹入部54。凹入部54定位于流动通道中的每一个流动通道40内。

在图5C所示的示例中，图案化材料50定位在支持物52上。应当理解，可选择性地沉积或者可沉积并图案化以形成凹入部54和间隙区域48的任何材料可用作图案化材料50。

例如，可经由气相沉积、气溶胶印刷或喷墨印刷将无机氧化物选择性地施加到支持物52。合适的无机氧化物的示例包括氧化钽(例如Ta₂O₅)、氧化铝(例如Al₂O₃)、氧化硅(例如SiO₂)、氧化铪(例如HfO₂)等。

又如，可将树脂施加到支持物52，然后图案化。合适的沉积技术包括化学气相沉积、浸涂、泡涂、旋涂、喷涂、搅打分配、超声喷涂、刮涂刀涂覆、气溶胶印刷、丝网印刷、微接触印刷等。合适的图案化技术包括光刻法、纳米压印光刻(NIL)、压印技术、压花技术、模制技术、微蚀刻技术、印刷技术等。合适的树脂的一些示例包括基于多面体低聚倍半硅氧烷树脂(POSS)的树脂、非POSS环氧树脂、聚(乙二醇)树脂、聚醚树脂(例如，开环环氧化物)、丙烯酸树脂、丙烯酸酯树脂、甲基丙烯酸酯树脂、无定形含氟聚合物树脂(例如，得自Bellex的)以及它们的组合。

如本文所用，术语“多面体低聚倍半硅氧烷”(POSS)是指作为二氧化硅(SiO₂)和有机硅(R₂SiO)之间的杂交中间体(例如RSiO_1.5)的化学组合物。POSS的示例可以是Kehagias等人在Microelectronic Engineering 86(2009)第776-778页中所述的POSS，该文献以引用方式全文并入。在一个示例中，组合物为具有化学式[RSiO_3/2]_n的有机硅化合物，其中R基团可以是相同或不同的。POSS的示例性R基团包括环氧基、叠氮化物/叠氮基、硫醇、聚(乙二醇)、降冰片烯、四嗪、丙烯酸酯和/或甲基丙烯酸酯，或另外例如烷基、芳基、烷氧基和/或卤代烷基基团。本文所公开的树脂组合物可包括一个或多个不同的笼或芯结构作为单体单元。多面体结构可为T₈结构，诸如：并且由下式表示：该单体单元通常具有八个官能团臂R₁至R₈。

单体单元可具有带有10个硅原子和10个R基团的笼结构，被称为T₁₀，诸如：或者单体单元可具有带有12个硅原子和12个R基团的笼结构，被称为T₁₂，诸如：基于POSS的材料可另选地包括T₆、T₁₄或T₁₆笼结构。平均笼含量可在合成期间加以调节，并且/或者通过纯化方法控制，并且单体单元的笼尺寸分布可用于本文所公开的示例中。

如图5C所示，图案化材料50包括限定于其中的凹入部54和将相邻凹入部54隔开的空隙区域48。可设想凹入部54的许多不同布局，包括规则的、重复的和非规则的图案。在一个示例中，凹入部54设置在六边形网格中，以便紧密堆积和改善密度。其他布局可包括例如直线(矩形)布局、三角形布局等。在一些示例中，布局或图案可以为呈行和列形式的凹入部54的x-y格式。在一些其他示例中，布局或图案可以为凹入部54和/或间隙区域48的重复布置。在另外的其他示例中，布局或图案可以是凹入部54和/或间隙区域48的随机布置。图案可包括点、垫、条、漩涡、线、三角形、矩形、圆形、弧形、格纹、格子、对角线、箭头、正方形和/或交叉影线。

凹入部54的布局或图案可相对于限定区域中的凹入部54的密度(凹入部54的数量)来表征。例如，凹入部54可以大约2百万个/mm²的密度存在。可将密度调整为不同的密度，包括例如约100个/mm²、约1,000个/mm²、约0.1百万个/mm²、约1百万个/mm²、约2百万个/mm²、约5百万个/mm²、约1千万个/mm²、约5千万个/mm²或更大或更小的密度。还应当理解，图案化材料50中的凹入部54的密度可以介于选自上述范围的下限值中的一个值与上限值中的一个值之间。例如，高密度阵列可被表征为具有间隔小于约100nm的凹入部54，中密度阵列可被表征为具有间隔约400nm至约1μm的凹入部54，并且低密度阵列可被表征为具有间隔大于约1μm的凹入部54。虽然已提供示例性密度，但应当理解，可使用任何合适的密度。凹入部54的密度可部分地取决于凹入部54的深度。在一些情况下，期望凹入部54之间的间距甚至大于本文所列的示例。

凹入部54的布局或图案也可根据或另选地根据从凹入部54的中心到相邻凹入部54的中心的平均节距或间距(中心到中心间距)或从一个凹入部54的边缘到相邻凹入部54的边缘的平均节距或间距(边缘到边缘间距)。图案可以是规则的，使得围绕平均节距的变异系数较小，或者图案可以是非规则的，在这种情况下变异系数可以相对较大。在任一种情况下，平均节距可为例如约50nm、约0.1μm、约0.5μm、约1μm、约5μm、约10μm、约100μm或更大或更小。凹入部54的特定图案的平均节距可以介于选自上述范围的下限值中的一个值与上限值中的一个值之间。在一个示例中，凹入部54具有约1.5μm的节距(中心到中心间距)。虽然已经提供了示例性平均节距值，但应当理解，可使用其他平均节距值。

每个凹入部54的尺寸可通过其体积、开口面积、深度和/或直径来表征。

每个凹入部54可具有能够限制流体的任何体积。可以选择最小或最大体积，例如以适应流通池38下游使用所期望的通量(例如复用度)、分辨率、核苷酸或分析物反应性。例如，体积可为至少约1×10^-3μm³、至少约1×10^-2μm³、至少约0.1μm³、至少约1μm³、至少约10μm³、至少约100μm³或更大。另选地或除此之外，体积可为至多约1×10⁴μm³、至多约1×10³μm³、至多约100μm³、至多约10μm³、至多约1μm³、至多约0.1μm³或更小。

每个凹入部开口所占据的面积可基于与上文针对体积所述的标准类似的标准来选择。例如，每个凹入部开口的面积可为至少约1×10^-3μm²、至少约1×10^-2μm²、至少约0.1μm²、至少约1μm²、至少约10μm²、至少约100μm²或更大。另选地或除此之外，面积可为至多约1×10³μm²、至多约100μm²、至多约10μm²、至多约1μm²、至多约0.1μm²、至多约1×10^-2μm²或更小。每个凹入部开口所占据的面积可以大于、小于上文指定的值或介于它们之间。

每个凹入部54的深度可大到足以容纳一部分聚合物水凝胶42。在一个示例中，深度可以为至少约0.1μm、至少约0.5μm、至少约1μm、至少约10μm、至少约100μm或更大。另选地或除此之外，深度可以为至多约1×10³μm、至多约100μm、至多约10μm或更小。在一些示例中，深度为约0.4μm。每个凹入部54的深度可以大于、小于上文指定的值或介于它们之间。

在一些情况下，每个凹入部54的直径或长度和宽度可以为至少约50nm、至少约0.1μm、至少约0.5μm、至少约1μm、至少约10μm、至少约100μm或更大。另选地或除此之外，直径或长度和宽度可以为至多约1×10³μm、至多约100μm、至多约10μm、至多约1μm、至多约0.5μm、至多约0.1μm或更小(例如，约50nm)。在一些示例中，直径或长度和宽度为约0.4μm。每个凹入部54的直径或长度和宽度可以大于、小于上文指定的值或介于它们之间。

在图5C所示的示例中，聚合物水凝胶42定位在凹入部中的每个凹入部54内。聚合物水凝胶42可如参考图5B所述那样施加，使得聚合物水凝胶42存在于凹入部54中并且不存在于周围间隙区域48上。

虽然在图5A、图5B或图5C中未示出，但应当理解，流通池36还可包括附接到基底38的盖。在一个示例中，盖可粘结到基底38的至少一部分，例如，粘结在间隙区域48中的一些间隙区域处。在盖和基底38之间形成的粘结可以是化学粘结或机械粘结(例如，使用紧固件等)。

盖可以是对导向基底38的激发光透明的任何材料。例如，盖可以是玻璃(例如，硼硅酸盐、熔融二氧化硅等)、塑料等。合适的硼硅酸盐玻璃的可商购获得的示例为购自Schott North America,Inc.的D合适的塑料材料(即环烯烃聚合物)的可商购获得的示例为购自Zeon Chemicals L.P.的产品。

可使用任何合适的技术(诸如激光粘结、扩散粘结、阳极粘结、共熔粘结、等离子体活化粘结、玻璃熔块粘结或本领域已知的其他方法)将盖粘结到基底38。在一个示例中，间隔物层可用于将盖粘结到基底38。间隔物层可以是将基底38的至少一部分和盖密封在一起的任何材料。在一些示例中，间隔物层可以是有助于粘结基底38和盖的辐射吸收材料。

在其他示例中，流通池36还可包括附接到基底38的附加图案化或非图案化基底38。基底38可如本文所述那样进行粘结。

方法

方法通常包括针对来自基因组样品的多个邻近性保留文库片段14、14'生成一系列基于时间的簇生成图像。该系列中的每个基于时间的簇生成图像通过以下方式按顺序生成：向流通池36引入包括邻近性保留文库片段14、14'中的一些邻近性保留文库片段的相应样品，其中邻近性保留文库片段14、14'中的所述一些邻近性保留文库片段附接到固体支持物16(图1)或彼此附接(例如图3所示的附接片段34)；引发邻近性保留文库片段14、14'从固体支持物16或从彼此34释放；扩增邻近性保留文库片段14、14'以生成多条相应的模板链；将相应的模板链染色；以及将相应的模板链成像。

利用本文所公开的方法，将邻近性保留文库片段14、14'与顺序扩增和成像组合使用，以便生成该系列基于时间的簇生成图像。每个基于时间的簇生成图像记录使用特定样品生成的模板链的空间位置和取向。因此，这些图像可用于识别簇(模板链)位置，其中簇来源于在特定时间引入流通池中的特定样品。

方法可根据复合物10是否被引入流通池36中或者附接片段34是否被引入流通池中而略有变化。现在将描述各种示例。

使用复合物10或10'的方法

在该示例中，基因组样品(例如，样品30)被片段化以形成多个邻近性保留片段14、14'，这些片段中的每一个片段附接到固体支持物16。应当理解，并不是来自基因组样品30的所有邻近性保留片段14、14'都可附接到相同的固体支持物16；而是，与基因组样品30的特定部分相关联的邻近性保留片段14、14'可附接到相应的固体支持物16。因此，基因组样品30被片段化以形成多个复合物10或10'。这可如参考图1、图2A至图2C、图3所述，或使用将接头18、22或18'、22掺入片段14、14'中的每一个片段以使得它们成为即用测序片段12、12'的任何其他邻近性保留方法来实现。

可将使用基因组样品30形成的复合物10或10'掺入混合物中。因此，多个邻近性保留片段14、14'中的每一个邻近性保留片段也被掺入到混合物中。混合物的液体载体可为缓冲液，诸如Tris-HCl缓冲液或0.5×柠檬酸钠盐水(SSC)缓冲液。

可将液体载体添加到多个邻近性保留片段14、14'中(例如，存在于复合物10或10'中)以初始形成混合物，然后可用附加的液体载体稀释混合物以生成预先确定数量的稀释样品，该预先确定数量的稀释样品将被单独引入流通池36(或其单独的通道40)中。

可以任何期望的方式控制所生成的混合物的最终体积，从而控制混合物的稀释。在一些情况下，稀释可取决于流通池36的体积(或例如，多通道流通池的每个通道40)和待引入流通池36中的样品的期望数量。在一个示例中，流通池36(或其通道40)的体积可用作极限稀释度。因此，在一些示例中，可添加载体液体以将混合物稀释到预先确定的体积，其中预先确定的体积基于i)作为极限稀释度的流通池36的体积和ii)待引入流通池36中的稀释样品的预先确定数量。例如，流通池36或流通池36的一个通道40可具有约50μL的体积，并且样品的期望数量可以是200个。在该示例中，可将混合物稀释到约10,000μL。又如，流通池36或流通池36的一个通道40可具有约100μL的体积，并且样品的期望数量可以是384个。在该示例中，可将混合物稀释到约38,400μL。

稀释样品的期望数量可取决于例如流通池36的体积和相应的基于时间的簇生成图像中各条模板链的期望分辨率。当使用较小体积的流通池38时，可能期望具有稀释较多的混合物，使得待引入流通池36中的每个单独的稀释样品含有较少的邻近性保留文库片段14、14'(与如果使用稀释较少的混合物相比)。在这种类型的流通池36中，较少的邻近性保留文库片段14、14'将导致较少的模板链，这可提高模板链在相应的基于时间的簇生成图像中的分辨率。在一个示例中，样品的期望数量可在约100个样品至约1000个样品的范围内。在其他示例中，要由混合物制备的稀释样品的期望数量可超过1000个。稀释样品的数量的上限可部分地取决于执行总体方法的期望时间范围。

然后可将混合物分成预先确定数量的稀释样品。在一个示例中，可将稀释的混合物分开，使得所有稀释样品同时生成。在另一个示例中，当预定体积的任何一种稀释样品被引入流通池36中时，该样品可与本体混合物分离。

图6A至图6D示出了在生成基于时间的簇生成图像的不同阶段期间从顶视图观察的非图案化流通池36(例如，如图5B所示)的示例。

如图6A至图6D示意性地所示，流通池36可被引入这样的系统中，该系统包括流通池容座35；流体控制系统37，该流体控制系统包括用以将稀释样品56A和染色剂(未示出)分别递送到定位在流通池容座35中的流通池36的流体递送器39；照明系统62，该照明系统被定位成照亮定位在流通池容座35中的流通池36；检测系统64，该检测系统被定位成捕获定位在流通池容座35中的流通池36的图像；和控制器41，该控制器与流体控制系统37、照明系统62和检测系统64可操作地通信，该控制器41：使得流体递送器39将稀释样品56A引入定位在流通池容座35中的流通池36；在定位在流通池容座35中的流通池36中从存在于稀释样品56A中的邻近性保留文库片段生成模板链58A之后，使得流体递送器39将染色剂引入定位在流通池容座35中的流通池36；使得照明系统62照亮定位在流通池容座35中的流通池36中的染色模板链；并且使得检测系统64将定位在流通池容座35中的流通池36中的被照亮的染色模板链成像。

当处于适当的位置时，流通池36与流体控制系统39(例如，泵、阀等)流体连通并且与照明系统62和检测系统64光学连通。

在图6A中，将稀释样品56A中的第一稀释样品(包括复合物10或10'中的一些复合物，在图6A中示为10A)引入流通池36中。引入相应的稀释样品56A(或例如图6C中的56B)中的任何稀释样品涉及将稀释样品56A、56B中的一个稀释样品以流体方式引导到流通池36。可将稀释样品56A引入例如料筒45中，并且流体控制系统37可使用流体递送器39(例如，泵、阀等)将稀释样品56A从料筒45以流体方式输送到流通池36的流动通道40。

考虑到稀释样品56A中复合物10A的浓度，大部分(如果不是全部的话)复合物10A将沉降到聚合物水凝胶42和其上的任何引物44、46上(其在图6A至图6D中未示出)。在一些示例中，由于流动通道40或凹入部54的深度，复合物10A可沉降并保留在流动通道40或凹入部54中。在其他示例中，流动通道40或凹入部54可包括复合物10A附着的捕获位点。

应当理解，一些复合物10A可能不沉降，并且将在进一步处理之前从流通池36中移除这些复合物10A。因此，方法的一些示例然后包括从流通池36洗掉未捕获的复合物10A。洗涤可涉及将流体引入流通池36中。该流动可推动尚未沉降和/或附着的任何复合物10A通过流通池36的出口。

方法的该示例然后包括引发邻近性保留文库片段14、14'从它们所附接的相应固体支持物16释放。在该示例中，即用测序核酸片段12、12'(包括邻近性保留文库片段14、14'和与其附接的接头18、22或18'、22)从相应的固体支持物16释放。在图6A中，即用测序核酸片段12、12'从固体支持物16的释放由从每个固体支持物16向外指向的箭头表示。

可以若干不同的方式引发即用测序核酸片段12、12'的释放。在一个示例中，引发释放涉及加热流通池36。在该示例中，系统可包括加热器43。控制器41可使得加热器43引发邻近性保留文库片段12、12'中的一些邻近性保留文库片段从固体支持物16或从彼此释放。例如，可使用高于70℃的温度至少部分地破坏键，从而引发即用测序核酸片段12、12'的释放。在另一个示例中，引发释放涉及将裂解剂引入流通池36中。流体控制系统37可用于递送裂解剂。裂解剂可引发即用测序核酸片段12、12'从固体支持物16中化学、酶促或光化学释放。在这些示例中，另一种刺激(诸如热或光)可触发裂解剂从固体支持物16释放即用测序核酸片段12、12'。例如，可引入游离的生物素作为裂解剂，并且加热到约92℃可用于诱导生物素-寡核苷酸从固体支持物16释放。

所释放的即用测序核酸片段12、12'从固体支持物16输送并接种到聚合水凝胶42上。更具体地讲，扩增引物46、48以相对限制的方式接种所释放的即用测序核酸片段12、12'。在一个示例中，通过片段12、12'的第一序列或第二序列与流通池36中聚合物水凝胶42上的引物46、48中的互补引物之间的杂交来完成接种。接种可在适合片段即用测序核酸片段12、12'和引物46、48的杂交温度下进行。可控制加热器43以使流通池36达到接种温度。

可执行洗涤过程以移除珠。

然后可以使用任何合适的方法(诸如簇生成)来扩增接种的即用测序核酸片段12、12'。在簇生成的一个示例中，使用高保真DNA聚合酶通过3'延伸从杂交引物46、48复制所释放的即用测序核酸片段12、12'。使原始的即用测序核酸片段12、12'变性，从而使这些拷贝固定在流动通道40或凹入部54中的一些凹入部内。可使用任何克隆扩增过程。在一个示例中，等温桥扩增可用于扩增固定的拷贝。例如，复制的模板环回以与相邻的互补引物46、48杂交，并且聚合酶复制所复制的模板以形成双链桥，使这些双链桥变性以形成两条单链。这两条链环回并与相邻的互补引物46、48杂交，并且再次延伸以形成两个新的双链环。通过等温变性和扩增循环对每个模板拷贝重复该过程，以产生密集的克隆簇。使双链桥的每个簇变性。在一个示例中，通过特异性碱基裂解移除反义链，留下正向模板多核苷酸链。应当理解，成簇使得在流动通道40或凹入部54中的一些凹入部中形成若干模板链58A。在一些示例中，控制器41使得加热器43运行热循环以扩增接种的即用测序核酸片段12、12'。

图6B示出了由第一稀释样品56A(隔室)的复合物10A生成的模板链58A的簇60A。为了清楚起见，概述了图6B中的簇60A。虽然图6B示出了四个簇60A，但应当理解，簇60A的数量将取决于引入样品56A中的复合物10A的数量以及从每个固体支持物16释放的即用测序核酸片段12、12'的数量。簇60A由所释放的即用测序核酸片段12、12'中的每一个即用测序核酸片段生成。此外，所释放的即用测序核酸片段12、12'可在整个流通池表面上扩散，因此可在整个流通池表面上生成簇60A。

在针对第一稀释样品56A生成簇60A之后，将染色剂引入流通池36中。可使用能够将模板链58A染色的任何荧光染色剂。合适的荧光染色剂的示例包括得自MolecularProbes,Inc.的染料家族(例如Green、Gold、Safe等)、溴化乙锭、碘化丙啶、结晶紫、染料(得自Biotium)、DAPI(4′,6-二脒基-2-苯基吲哚)等。将染色剂例如从第二料筒(未示出)引入流通池36中，允许其温育合适的时间段以对模板链58A染色，然后使其从流通池36排出。

然后可使用照明系统62来照亮流通池36中的染色模板链58A。照明系统可包括光源和多个光学部件。光源的示例可包括激光器、弧光灯、LED或激光二极管。光学部件可以是例如反射器、二向色镜、分束器、准直器、透镜、滤光器、楔镜、棱镜、反射镜、检测器等。照明系统可被可操作地定位以将激发光引导到对应于所用染色剂的流通池表面。

检测系统64可用于捕获荧光模板链58A的图像I₁。该图像I₁是针对稀释样品56A的基于时间的簇生成图像，这是因为它描绘了与稀释样品56A相关联的模板链58A的空间位置和取向。可使用任何合适的相机来捕获流通池36上的簇60A的图像I₁。

图像I₁可以电子方式存储以供后续检索和使用。因此，系统的一些示例包括用以存储图像I₁的电子存储部件47。在电子记录中，图像I₁可连接到稀释样品56A。也可为图像I₁分配时间记录。因此，方法的一些示例包括为该系列中的每个基于时间的簇生成图像₁分配引入包括邻近性保留文库片段中的一些邻近性保留文库片段的相应样品的时间记录。时间记录可包括指示何时引入稀释样品56A和/或对其成像的时间戳、引入和/或成像序列中的步数(例如，200的样品1、200的样品2、...200的样品X)或它们的组合。

可在流通池36上的簇60A成像之后进行洗涤。可使用水、缓冲液或另一种温和的洗涤溶液。

然后用第二稀释样品56B(图6C中所示)重复参考图6A和图6B所示和所述的过程。

在图6C中，将第二稀释样品56B引入流通池36中。复合物10B(其可为复合物10或10')沉降和/或附着到流通池表面。

如图6C所示，方法然后包括引发邻近性保留文库片段14、14'从它们所附接的相应固体支持物16释放。在该示例中，即用测序核酸片段12、12'(包括邻近性保留文库片段14、14'和与其附接的接头18、22或18'、22)从相应的固体支持物16释放。

所释放的即用测序核酸片段12、12'从固体支持物16输送并接种到聚合水凝胶42上。然后可以使用任何合适的方法(诸如簇生成)来扩增接种的即用测序核酸片段12、12'。应当理解，该轮成簇使得在流动通道40或凹入部54中的一些凹入部中形成若干更多的模板链58B。

图6D示出了由第二稀释样品56B(隔室)的相应复合物10B生成的模板链58B的簇60B。为了清楚起见，概述了图6D中的簇60A和60B。虽然图6D示出了三个簇60B，但应当理解，簇60B的数量将取决于引入样品56B中的复合物10B的数量以及从每个固体支持物16释放的即用测序核酸片段12、12'的数量。

在针对第二稀释样品56B生成簇60B之后，将染色剂再次引入流通池36中。用于将模板链58A染色的相同染色剂可用于将模板链58B和任何后续生成的模板链染色。

然后可使用照明系统62来照亮流通池36中的染色模板链58A和58B。检测系统64可用于捕获相应簇60A和60B中的荧光模板链58A和58B的图像I₂。

图像I₂也可以电子方式存储以供后续检索和使用。在电子记录中，图像I₂可连接到稀释样品56B。也可为图像I₂分配时间记录。时间记录可包括指示稀释样品56B何时成像的时间戳、序列中的步数(例如，200的样品2)或它们的组合。

可在流通池36上的簇60A、60B成像之后进行洗涤。可使用水、缓冲液或另一种温和的洗涤溶液。

然后可例如使用所述系统重复参考图6A和图6B所示和所述的过程，以获得来源于原始混合物的稀释样品的数量。每个附加图像I₃、I₄、…I_x将描绘通过引入相应的稀释样品56C、56D、…56X而生成的模板链58C、58D、…58X的新簇60C、60D、…60X。针对相应的稀释样品56A、56B、…56X获得的所有图像I₁、I₂、…I_x均与特定的混合物相关联，并因此与特定的较长核酸分子30相关联。

因为每个顺序图像I₂、I₃、I₄、…I_x描绘了相对于紧邻前一图像I₁、I₂、I₃、…I_x新形成的簇60B、60C、60D、…60X，所以可以使用图像相减来生成针对在第一样品56A之后引入的每个样品的经解析的簇图像。一些示例性经解析的簇图像RI_x示于图6中。

图7描绘了针对如参考图6A和图6B所述顺序地引入、扩增、染色和成像的六个不同稀释样品56A、56B、56C、56D、56E、56F拍摄的图像I₁、I₂、I₃、I₄、I₅、I₆。如图所描绘的，分别针对新引入和处理的稀释样品56A、56B、56C、56D、56E、56F中的每一个稀释样品生成新簇60A、60B、60C、60D、60E和60F。

因为针对第一样品56A的图像I₁包括来自一个样品的簇60A，所以不需要生成经解析的簇图像，这是因为原始图像I₁可以用于簇60A的空间识别。对于在第一样品56A之后引入的每个样品而言，针对其他图像I₂、I₃、I₄、I₅、I₆中的每一个图像生成经解析的簇图像RI₂、RI₃、RI₄、RI₅、RI₆。例如，可从图像I₂(描绘簇60A中的模板链58A和簇60B中的模板链58B)中减去图像I₁(描绘簇60A中的模板链58A)来生成针对第二样品56B的经解析的簇图像RI₂。该经解析的簇图像RI₂描绘了与第二样品56B相关联的簇60B中的模板链58B的空间位置和取向。又如，可从图像I₃(其描绘簇60A中的模板链58A、簇60B中的模板链58B和簇60C中的模板链58C)中减去图像I₁(描绘簇60A中的模板链58A)和图像I₂(描绘簇60A中的模板链58A和簇60B中的模板链58B)以生成针对第三样品(例如56C)的经解析的簇图像RI₃。该经解析的簇图像RI₃描绘了与第三样品56C相关联的簇60C中的模板链58C的空间位置和取向。经解析的簇图像RI₄、RI₅和RI₆可以类似的方式通过减去前述图像中的任何前述图像而生成。

应当理解，可对一系列I₁、I₂、I₃、…I_x中的任一者进行图像相减。针对任何给定稀释样品56X的所得经解析的簇图像RI_x描绘了与该稀释样品56X相关联的模板链58X的空间位置和取向。

可存储经解析的簇图像以用于后续分析。

使用附接片段34的方法

在该示例中，基因组样品被片段化以形成多个邻近性保留片段14、14'，该多个邻近性保留片段例如作为附接片段34彼此附接。应当理解，并不是来自基因组样品的所有邻近性保留片段14、14'都可彼此附接；而是，图4所示的过程可导致形成若干附接片段34。

可将使用基因组样品形成的附接片段34掺入混合物中。因此，多个邻近性保留片段14、14'中的每一个邻近性保留片段也被掺入到混合物中。混合物的液体载体可为缓冲液，诸如Tris-HCl缓冲液或0.5×柠檬酸钠盐水(SSC)缓冲液。

可将液体载体添加到多个附接片段34中以初始形成混合物，然后可用附加的液体载体稀释混合物以生成预先确定数量的稀释样品，该预先确定数量的稀释样品将被单独引入流通池36(或其单独的通道40)中。

可以任何期望的方式并如本文所述控制所生成的混合物的最终体积，从而控制混合物的稀释。

然后可将混合物分成预先确定数量的稀释样品。在一个示例中，可将稀释的混合物分开，使得所有稀释样品同时生成。在另一个示例中，当预定体积的任何一种稀释样品被引入流通池36中时，该样品可与本体混合物分离。

在该示例性方法中，将图4所示的附接片段34作为稀释样品中的一个稀释样品的一部分引入流动通道中。该稀释样品66A的示例描绘于图8中。

如图8所示，在流通池36内，将转座酶32从附接片段34中移除。这可例如使用SDS或蛋白酶来实现。转座酶32的移除从相邻的邻近性保留片段14、14'释放相应的邻近性保留片段14、14'(和直接或间接与其附接的任何链26'、28')。换句话讲，附接片段34的子片段72被释放，并且能够经由转移链26'接种到聚合物水凝胶42上。如图8示意性地示出，转移链26'与在流通池36表面上的相应和互补引物46杂交。在一些情况下，可在杂交期间施加热量。热量的施加可取决于转移链26'的熔融温度。例如，转移链26'的P5'部分与附接到聚合物水凝胶42的互补P5扩增引物46杂交。

洗涤溶液可流动通过流通池36的流动通道以从流通池36移除转座酶32。合适的洗涤溶液的示例包括SDS，其可移除转座酶。第二洗涤溶液诸如TRIS或杂交洗涤缓冲液可用于冲洗流通池36。

在扩增之前，该方法示例还包括在与杂交端部相对的末端处将第二序列部分(例如非转移链28')引入杂交邻近性保留文库片段14、14'中的每一个杂交邻近性保留文库片段中。因此，在方法的一些示例中，邻近性保留文库片段14、14'中的每个邻近性保留文库片段包括在第一端部处的与在流通池26表面上的第一引物序列46杂交的第一序列部分；并且在扩增之前，方法还包括在与第一端部相对的第二端部处将第二序列部分附接到杂交邻近性保留文库片段14、14'中的每个杂交邻近性保留文库片段，第二序列部分与在流通池36表面上的第二引物序列48相同，使得第二序列部分的拷贝可以与第二引物序列48杂交。

第二序列部分的引入可使用延伸连接来进行。在一个示例中，可引发延伸连接(如图8中的箭头74所表示)以将非转移链28'接合到对应的片段14、14'。在一个示例中，可通过将延伸连接混合物引入流通池36中并加热到适合酶活性的温度(例如，约37℃至约50℃的范围)来引发延伸连接。

延伸连接混合物可包括连接酶(例如DNA连接酶)，该连接酶催化非转移链28'与其对应片段14或14'之间的键的形成。如参考图4所述，非转移链28'包括第二测序引物序列(例如，读段2测序引物序列)和第二序列(P7)，该第二序列与流通池表面上的扩增引物中的另一扩增引物48(P7)的至少一部分相同。该第二序列使得互补拷贝(例如P7')能够在扩增期间生成，该互补拷贝可在簇生成期间与流通池表面上的扩增引物48(P7)杂交。因此，连接导致形成附接到流通池表面的即用测序文库片段12、12'。

延伸连接混合物还可包括附接到引物46的暴露末端的封闭基团，以防止在这些引物46处不期望的延伸。另选地，引物46可接枝到其上附接有封闭基团(例如3'磷酸基团)的表面。在其他示例中，可以不使用封闭基团。

当所得的片段12、12'彼此附接时，可使用加热来使片段12'与片段12离解。可通过洗涤从流通池36移除未与引物46杂交的片段12'。

当使用时，然后可将任何封闭引物46解封闭(例如，使用激酶或另一种合适的解封闭剂)，使得可进行扩增。在该示例中，可使用任何合适的方法诸如簇生成来进行扩增。簇生成可如本文参考图6A所述来执行。可使用参考图6A所述的系统。

图9A示出了由稀释样品66A(图8中所示)的附接片段34生成的模板链68A的簇70A。为了清楚起见，概述了图9A中的簇70A。虽然图9A示出了四个簇70A，但应当理解，簇70A的数量将取决于引入样品66A中的附接片段34的数量以及从附接片段34释放的即用测序核酸片段12、12'的数量。

在针对第一稀释样品66A生成簇70A之后，将染色剂引入流通池36中，如参考图6B所述。将染色剂引入流通池36中，允许其温育合适的时间段以对模板链68A染色，然后使其从流通池36排出。

然后可使用照明系统62来照亮流通池36中的染色模板链68A，并且检测系统64可用于捕获荧光模板链68A的图像I₁。该图像I₁是针对稀释样品66A的基于时间的簇生成图像，这是因为它描绘了与稀释样品66A相关联的模板链68A的空间位置和取向。

图像I₁可以电子方式存储以供后续检索和使用。在电子记录中，图像I₁可连接到稀释样品66A。也可为图像I₁分配时间记录。时间记录可包括指示何时引入稀释样品66A和/或对其成像的时间戳、引入和/或成像序列中的步数(例如，200的样品1、200的样品2、...200的样品X)或它们的组合。

可在流通池36上的簇70A成像之后进行洗涤。可使用水、缓冲液或另一种温和的洗涤溶液。

然后用第二稀释样品66B(图9B中所示)重复参考图8和图9A所示和所述的过程。

在图9B中，将第二稀释样品66B引入流通池36中。附接片段34可被分解成子片段72，如参考图8所述。子片段72中的至少一些子片段的一条转移链26将与流通池36上的互补扩增引物46杂交。然后可执行参考图8所述的延伸连接和其他过程，这导致即用测序核酸片段12附接到流通池表面。

簇生成可如本文参考图6A所述来执行。

图9C示出了由第二稀释样品66B的附接片段34生成的模板链68B的簇70B。为了清楚起见，概述了图9C中的簇70A和70B。虽然图9C示出了两个簇70B，但应当理解，簇70B的数量将取决于引入样品66B中的附接片段34的数量以及从附接片段34释放的即用测序核酸片段12、12'的数量。

在针对第二稀释样品66B生成簇70B之后，将染色剂再次引入流通池36中。用于将模板链68A染色的相同染色剂可用于将模板链68B和任何后续生成的模板链染色。

然后可使用照明系统62来照亮流通池36中的染色模板链68A和68B。检测系统64可用于捕获相应簇70A和70B中的荧光模板链68A和68B的图像I₂。

图像I₂也可以电子方式存储以供后续检索和使用。在电子记录中，图像I₂可连接到稀释样品66B。也可为图像I₂分配时间记录。时间记录可包括指示稀释样品56B何时成像和/或引入的时间戳、序列中的步数(例如，1000的样品2)或它们的组合。

可在流通池36上的簇70A、70B成像之后进行洗涤。可使用水、缓冲液或另一种温和的洗涤溶液。

然后可重复参考图9B和图9C所示和所述的过程，以获得来源于原始混合物的稀释样品的数量。每个附加图像I₃、I₄、…I_x将描绘通过引入相应的稀释样品66C、66D、…66X而生成的模板链68C、68D、…68X的新簇70C、70D、…70X。针对相应的稀释样品66A、66B、…66X获得的所有图像I₁、I₂、…I_x均与特定的混合物相关联，并因此与特定的较长核酸分子30相关联。

因为每个顺序图像I₂、I₃、I₄、…I_x描绘了相对于紧邻前一图像I₁、I₂、I₃、…I_x新形成的簇70B、70C、70D、…70X，所以可以使用图像相减来生成针对在第一样品66A之后引入的每个样品的经解析的簇图像。可以如参考图7所述生成经解析的簇图像RI_x。

应当理解，可对一系列I₁、I₂、I₃、…I_x中的任一者进行图像相减。针对任何给定稀释样品66X的所得经解析的簇图像RI_x描绘了与该稀释样品66X相关联的模板链68X的空间位置和取向。

可存储经解析的簇图像以用于后续分析。

其他方法

不同于引入单独的稀释样品56A、66A，可将稀释混合物按预先确定的体积扩散到流通池中，并且可如本文所述进行流通池38上的处理以扩增、染色和记录所生成模板链58X、68X的图像。可控制扩散，使得一次引入一个预先确定的体积。

因此，方法的一些示例包括通过以下方式生成针对引入流通池36中的极限稀释样品中的每个极限稀释样品的基于时间的簇生成图像：控制混合物到流通池中的扩散，使得一次引入流通池36中极限稀释样品中的一个极限稀释样品；在流通池36中的极限稀释样品中的一个极限稀释样品中引发邻近性保留文库片段14、14'从固体支持物16或从彼此(例如，从附接片段34)释放；扩增邻近性保留文库片段14、14'以生成多个相应的模板链58A、68A；将相应的模板链58A、68A染色；以及将相应的模板链58A、68A成像。

测序和分析

当如本文所述扩增来自混合物的所有稀释样品并对其成像时，流通池36准备好用于测序操作。可使用多种测序方法或技术，包括通常被称为合成测序(SBS)、循环阵列测序、连接测序、焦磷酸测序等的技术。

例如，合成测序(SBS)反应可在诸如HISEQ^TM、HISEQX^TM、MISEQ^TM、MISEQDX^TM、MINISEQ^TM、NOVASEQ^TM、NEXTSEQDX^TM、ISEQ^TM、NEXTSEQ^TM或得自Illumina(加利福尼亚州圣地亚哥)的其他测序机系统上运行。在SBS中，监测测序引物沿模板链58A、58B、…58X的延伸，以确定模板中核苷酸的序列。可阻断模板链58A、58B、…58X和任何流通池结合的引物46、48(未附接到模板链58A、58B、…58X)的3'末端，以防止干扰测序反应，并且具体地，防止不期望的引发。

可引入与模板链58A、58B、…58X上的互补序列杂交的测序引物。该测序引物使得模板链58A、58B、…58X准备好用于测序。

基础化学过程可以是聚合(例如，由聚合酶催化)或连接(例如，由连接酶催化)。在特定基于聚合酶的SBS过程中，以模板依赖性方式将荧光标记的核苷酸添加到测序引物中，使得可以使用对添加到测序引物中的核苷酸的顺序和类型的检测来确定模板的序列。例如，为了引发第一SBS循环，可将一种或多种标记的核苷酸、DNA聚合酶等递送到流通池36中/通过该流通池等，在该流通池中，测序引物延伸引起标记的核苷酸被掺入。这种掺入可以通过成像事件来检测。在成像事件期间，照明系统62可向流通池36提供激发光。

在一些示例中，荧光标记的核苷酸可以进一步包括可逆终止属性，一旦将核苷酸添加到模板中，该属性就会终止进一步的引物延伸。例如，可以将具有可逆终止子部分的核苷酸类似物添加到模板中，使得随后的延伸直到递送解封闭剂以除去该部分才发生。因此，对于使用可逆终止的示例，可以将解封闭剂递送到流通池36等(在检测发生之后)。

洗涤可在各种流体递送步骤之间发生。然后可以重复SBS循环n次以将模板延伸n个核苷酸，从而检测长度为n的序列。

虽然已经详细描述了SBS，但应当理解，本文所述的流通池36可与其他测序方案一起用于基因分型，或用于其他化学和/或生物应用中。

可基于经解析的簇图像RI₂、RI₃、…RI_x将在测序操作期间获得的测序读段组合在一起。然后可基于经解析的簇图像RI₂、RI₃、…RI_x将经组合的测序读段连接到稀释样品中的相应的一个稀释样品。可推断，经组合的和连锁的测序读段源自相同的较长核酸样品30。因此，方法的一些示例包括在流通池26上执行测序操作，该流通池包括用于多个文库片段中的每个文库片段的相应的模板链；以及基于经解析的簇生成图像RI、RI₂、RI₃、…RI_x将测序读段在不同的组中组合在一起。

为了进一步说明本公开，本文给出了实施例。应当理解，提供这些实施例是出于说明目的，而不应理解为限制本公开的范围。

实施例

实施例1

将条形码寡核苷酸(例如接头18)经由生物素接头附接到M280链霉亲和素珠(Thermofisher)上以形成珠池。将通用转座体与寡核苷酸末端处的互补序列杂交以形成珠连接的转座体(BLT)。然后将BLT在洗涤缓冲液中洗涤，重悬于工作缓冲液中，并添加辅助蛋白(单链结合蛋白(Thermofisher)和双链结合蛋白(Illumina))。

将高分子量NA12878 DNA(使用QiagenHMW DNA提取方案从培养的细胞中提取)添加到BLT混合物中，并且将管轻轻翻转以混匀。然后将管在室温下温育约15分钟，以使DNA包裹在珠周围。然后将标记缓冲液(含有氯化镁和tris乙酸酯)添加到每个管中，并且将样品在约55℃下温育约10分钟。在该步骤期间，转座体标记的DNA和带标签的DNA附接到BLT。在标记反应后，添加十二烷基硫酸钠(SDS)并将样品在室温下温育约5分钟以使转座酶变性。然后将管置于磁体上并移除上清液。用洗涤缓冲液洗涤珠。在最后一次洗涤后，将珠重悬于连接酶混合物(含有T7连接酶及其相关缓冲液—来自NEB的T7连接酶缓冲液)中。然后将样品混合并在室温下温育约45分钟。在这段时间内，将转移链中的间隙(转座体最初杂交的位置)连接，从而将带标签的DNA物理附接到珠。然后将样品置于磁体上，移除上清液，并将珠再次在洗涤缓冲液中洗涤。

然后将带标签的珠分成两组，用于移除非转移链和引入样品索引(例如，接头22)。将一组(比较组)暴露于比较工作流程，在比较工作流程中使用加热来移除非转移链。将另一组(示例组)暴露于示例性工作流程，在示例性工作流程中使用核酸外切酶来移除非转移链。

将比较组重悬于洗涤缓冲液中，并加热到约80℃，保持约5分钟，以使非转移链变性。然后将盛有比较组的管置于磁体上，移除上清液，并洗涤珠。然后将在洗涤缓冲液中稀释的样品索引添加到比较组的珠中，并且将该混合物在约80℃下温育约1分钟，之后使温度缓慢下降。

将示例组悬浮于T7核酸外切酶混合物(含有T7核酸外切酶和NEB缓冲液4)中，并使其在室温下温育约10分钟。T7核酸外切酶的5'至3'核酸外切酶活性消化非转移链。然后将盛有示例组的管置于磁体上，移除上清液，并洗涤珠。然后将在洗涤缓冲液中稀释的样品索引添加到示例组的珠中，并且将该混合物在约55℃下温育约5分钟以允许样品索引退火。

将分别盛有比较组和示例组的管置于磁体上并移除上清液。添加延伸连接混合物，并将样品在约37℃下温育约5分钟。将管再次置于磁体上，移除上清液，并将比较组和示例组的珠在洗涤缓冲液中洗涤。在最后一次洗涤后，将珠重悬于洗涤缓冲液中。

对比较组的一些珠和示例组的一些珠进行二次采样并将其用于PCR反应中。除相应的珠之外，每种PCR混合物由Illumina PCR混合物EPM以及P5和P7寡核苷酸组成。使用PCR扩增每个样品。

在PCR之后，将比较组和示例组中的每一者的PCR上清液的子样品转移到新管中，并使用样品纯化珠进行0.50×-0.62×尺寸选择(固相可逆固定，SPRI)。将所得文库在重悬缓冲液中洗脱。将这些文库在单独的HISEQ^TM2500Rapid流通池(使用标准2×101循环读段长度)上测序。Fastq生成之后，将样品与人基因组(hg38)进行比对，并将数据导入IGV中。

图10示出了使用来自比较组(标记为热变性)和示例组(标记为T7核酸外切酶)中的每一者的文库获得的针对人类基因组的富含AT区域的覆盖度，已知该区域受文库制备方案中的高温步骤的负面影响。其非转移链经由热变性移除的比较组文库片段的结果在图10的顶部示出，并且其非转移链经由核酸外切酶消化移除的示例组文库片段的结果在图10的底部示出。如图所示，对于示例组文库片段而言在富含AT区域中存在完全覆盖，而对于比较组文库片段而言在相同区域中仅存在部分覆盖。这些结果表明，在与热变性进行比较时，使用本文所公开的酶消化方法增加了文库覆盖度并改善了在基因组的富含AT区域上的测序。

实施例2

如图2A至图2C的方法(多步连接和消化)和图3的方法(单釜的连接和消化)中所述那样制备复合物。

BLT生成、DNA结合、标记和暴露于SDS如实施例1所述那样进行。在移除转座酶和与其相关联的洗涤之后，然后将加标签的珠分成两组，以经由多步的连接和消化(称为示例组2)或经由单釜的连接和消化(称为示例组3)移除非转移链。

将示例组2重悬于大肠杆菌DNA连接酶混合物中，该混合物包括大肠杆菌DNA连接酶及其相关联的缓冲液，两者均来自NEB。然后将示例组2样品混合并在约16℃下温育约15分钟。然后将盛有示例组2样品的管置于磁体上，移除上清液，并在洗涤缓冲液中洗涤示例组2珠。洗涤后，将示例组2珠重悬于含有T7核酸外切酶和NEB缓冲液4的混合物中，并在约25℃下温育约10分钟。

将示例组3在约25℃下重悬于组合的连接酶和核酸外切酶混合物(包括大肠杆菌DNA连接酶、T7核酸外切酶、NAD⁺和CUTSMART^TM缓冲液(来自NEB))中保持约15分钟。

然后将盛有示例组2和示例组3的管置于磁体上，移除上清液，并洗涤相应的珠。然后将在洗涤缓冲液中稀释的样品索引添加到每个示例组的珠中，并且将这些混合物在约55℃下温育约5分钟以允许样品索引退火。

将分别盛有示例组2和示例组3的管置于磁体上并移除上清液。添加延伸连接混合物，并将样品在约37℃下温育约5分钟。将管再次置于磁体上，移除上清液，并将比较组和示例组的珠在洗涤缓冲液中洗涤。在最后一次洗涤后，将珠重悬于洗涤缓冲液中。

对示例组2的一些珠和示例组3的一些珠进行二次采样并将其用于PCR反应中。除相应的珠之外，每种PCR混合物由Illumina PCR混合物EPM以及P5和P7寡核苷酸组成。使用PCR扩增每个样品。

在PCR之后，将示例组2和示例组3中的每一者的PCR上清液的子样品转移到新管中。添加样品纯化珠并进行2.5×SPRI，其中所得的文库在重悬缓冲液中洗脱。然后在Bioanalyzer 2100高灵敏度芯片上运行纯化文库，并获得图11中的迹线。结果显示，就多步的连接和消化而言以及就单釜的连接和消化而言，文库的尺寸分布和收率是相当的。这些结果表明，组合的试剂配方不会不利地影响连接，并且不会导致片段或转移链的消化。

可将使用实施例1和2中所述的文库制备方法获得的示例性珠结合文库片段(复合物)分成子样品并加以稀释以形成如本文所述的多个稀释样品。然后可使用稀释样品中的每个稀释样品执行参考图6A至图6D所述的方法(包括簇生成、染色和成像)以生成一系列基于时间的簇生成图像。当扩增所有稀释样品并对其成像时，流通池准备好用于测序操作。本文所公开的文库制备技术和基于时间的成像技术可一起用于有效且可靠地重构长DNA片段。

附加说明

此外，应当理解，本文提供的范围包括规定范围和规定范围内的任何值或子范围，如同它们被明确列举一样。例如，由约2mm至约300mm表示的范围应当解释为不仅包括明确列举的限值约2mm至约300mm，而且还包括单个值诸如约15mm、22.5mm、245mm等，以及子范围诸如约20mm至约225mm等。

应当理解，前述概念和下文更详细讨论的附加概念(假设此类概念不相互矛盾)的所有组合都被设想为是本文所公开的发明主题的一部分。具体地讲，出现在本公开末尾的要求保护的主题的所有组合都被设想为是本文所公开的发明主题的一部分。还应当理解，本文明确采用的也可出现在以引用方式并入的任何公开中的术语应被赋予与本文所公开的特定概念最一致的含义。

虽然已经详细描述了若干示例，但是应当理解，可以对所公开的示例进行修改。因此，上述说明应被认为是非限制性的。