与日本蛇根草花色苷合成相关的dfr酶、编码基因、表达载体、双元表达载体及其应用
阅读说明：本技术 与日本蛇根草花色苷合成相关的dfr酶、编码基因、表达载体、双元表达载体及其应用 (DFR enzyme related to synthesis of japonicas anthocyanin, coding gene, expression vector, binary expression vector and application thereof ) 是由 鞠志刚 孔德静 施洪喜 于 2021-09-06 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物工程技术领域,特别是涉及与日本蛇根草花色苷合成相关的DFR酶、编码基因、表达载体、双元表达载体及其应用。本发明所述DFR酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过对日本蛇根草花瓣组织的转录组进行测序,根据测序结果设计引物,扩增得到控制日本蛇根草花色苷合成的OjDFR1基因的cDNA,通过表达载体得到所述DFR酶,进而验证其具有DFR酶的催化活性,从而证明了本发明提供的DFR酶可以控制日本蛇根草花色苷的合成,编码该DFR酶的基因可以用于植物花色苷的改良。(The invention relates to the technical field of bioengineering, in particular to DFR enzyme related to synthesis of japonicas anthocyanin, a coding gene, an expression vector, a binary expression vector and application thereof. The amino acid sequence of the DFR enzyme is shown in SEQ ID NO. 1. The invention verifies that the DFR enzyme has the catalytic activity of the DFR enzyme by sequencing the transcriptome of the petal tissue of the Japanese snakeroot, designing a primer according to the sequencing result, amplifying to obtain the cDNA of the OjDFR1 gene for controlling the synthesis of the anthocyanin of the Japanese snakeroot and obtaining the DFR enzyme through an expression vector, thereby proving that the DFR enzyme provided by the invention can control the synthesis of the anthocyanin of the Japanese snakeroot and the gene for coding the DFR enzyme can be used for improving the plant anthocyanin.)
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，特别是涉及与日本蛇根草花色苷合成相关的DFR酶、编码基因、表达载体、双元表达载体及其应用。
背景技术
花色苷是影响植物颜色呈现的最主要色素物质之一，它可以赋予植物从红色到紫色等一系列不同颜色。研究显示，花色苷除可以赋予花、果实等组织颜色外，其还有很多重要的功能。它可以保护植物细胞免受紫外线的伤害，抵抗病原体与食草动物，作为信号分子促进植物与微生物之间的相互作用，影响花粉的生长与发育、植物体内激素的转运等。另外大量实验已经证明花色苷与人体健康之间也有密切的关系，它具有抗氧化、抗病毒、抗细胞增殖等生物活性，已经被用于治疗动脉硬化及心脑血管等疾病，是现阶段研究者们重点关注的次生代谢产物之一。花色苷是由编码其合成的结构基因控制合成的，二氢黄酮醇4-还原酶DFR是花色苷合成途径中重要的调控点，是植物多种花色苷生物合成所必需的酶。经DFR催化，可以使二氢黄酮醇反应生成相应的无色花色素进而再在其它酶的催化作用下生成相应的花色苷。综上，DFR不仅在决定花色苷含量和种类上发挥重要作用，同时作为改变植物颜色的重要调控点，在提高植物抗逆性、促进果实成熟等方面也具有重要意义。
DFR基因最早是于1985年首次从玉米中分离得到的，现已从杨树、牡丹、甘蓝、白菜、桂花、草莓、香雪兰、芒果、葡萄风信子等植物中克隆到了DFR基因。随着cDNA克隆技术的不断完善，国内也有研究人员从众多植物中陆续克隆到了DFR基因的cDNA或基因组DNA序列，但是目前关于茜草目植物日本蛇根草DFR基因的功能解析研究还未见报道，这极大地限制了人们对DFR的进化研究，同时也限制了人们对茜草目植物DFR的利用及对其花色苷生物合成的调控与改良。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了与日本蛇根草花色苷合成相关的DFR酶、编码基因、表达载体、双元表达载体及其应用。本发明提供的与日本蛇根草花色苷合成相关的DFR酶可以控制日本蛇根草花色苷的合成，编码该DFR酶的基因可以用于植物花色苷的改良。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种与日本蛇根草花色苷合成相关的DFR酶，所述DFR酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了一种编码权利要求1所述DFR酶的基因OjDFR1，所述基因OjDFR1的cDNA的序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了一种扩增上述基因OjDFR1的引物对，所述引物对包括OjDFR1F1和OjDFR1R1；所述OjDFR1F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述OjDFR1R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供了一种表达上述DFR酶的表达载体，所述表达载体包括上述基因OjDFR1和基础载体；所述基础载体包括pET-32a(+)载体。
优选的，所述基因OjDFR1的cDNA序列位于基础载体的EcoR I和Hind III酶切位点之间。
本发明还提供了一种双元表达载体，所述双元表达载体包括权利要求2所述基因OjDFR1和基础载体；所述基础载体包括pBI121载体。
优选的，所述基因OjDFR1的cDNA序列位于基础载体的BamH I和Xba I酶切位点之间。
本发明还提供了上述的基因OjDFR1或上述的引物对或上述的双元表达载体在植物花色苷改良中的应用。
优选的，所述植物包括日本蛇根草、烟草或拟南芥。
本发明还提供了一种改变植物花色苷的方法，包括：将上述的双元表达载体导入农杆菌中，利用所述农杆菌侵染植物，得到花色苷改变的植物。
有益效果：
本发明提供了一种与日本蛇根草花色苷合成相关的DFR酶，所述DFR酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过对日本蛇根草花瓣组织的转录组进行测序，根据测序结果设计引物，扩增得到控制日本蛇根草花色苷合成的OjDFR1基因的cDNA，通过表达载体得到所述DFR酶，进而验证其具有DFR酶的催化活性，从而证明了本发明提供的DFR酶可以控制日本蛇根草花色苷的合成，利用编码该DFR酶的基因可以用于植物花色苷的改良。
附图说明
图1为OjDFR1蛋白的多序列比对分析图；其中AtDFR为拟南芥的DFR，NtDFR为烟草DFR，OjDFR1为蛇根草DFR，OjANR为蛇根草花青素还原酶，OjFR为蛇根草黄酮还原酶；
图2为OjDFR1蛋白的系统进化分析；
图3为OjDFR1蛋白的纯化及酶活检测分析，其中A为OjDFR1可溶性重组蛋白的分离和纯化，1～5分别代表1：Maker，2：可溶性空载体蛋白，3：OjDFR1可溶性重组蛋白未加IPTG诱导，4：OjDFR1可溶性重组蛋白诱导24小时后；5：纯化后的OjDFR1可溶性重组蛋白；B为以二氢槲皮素为底物的酶活检测；C为以二氢杨梅素为底物的酶活检测；D为以二氢山奈酚为底物的酶活检测；
图4为OjDFR1转基因拟南芥植株的表型变化及RT-PCR检测，其中Wild Type为野生型，Mutant为突变体，OjDFR1-3为转基因拟南芥植株3，OjDFR1-5为转基因拟南芥植株5；右图中的OjDFR1为目的基因，β-actin为内参基因；
图5为OjDFR1转基因烟草花瓣的表型变化及RT-PCR检测，其中Wild Type为野生型，OjDFR1-4为转基因烟草植株4，OjDFR1-5为转基因烟草植株5；右图中的OjDFR1为目的基因，NtTub1为内参基因。
具体实施方式
本发明提供了一种与日本蛇根草花色苷合成相关的DFR酶，所述DFR酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：MGVEDATAAAAATKAGTVCVTGAGGFIGSWLVMRLLERDYIVRATVRNPGDTKKVKHLLELPKASTNLTLWKADMTEEGSFDEAIQDCDGVFHVATPMDFESKDPENEVIKPTIDGILNIIRSCVKAKTVKRLVYTSSAGTVNVQEHQRPVYDENDESDLDFIYSKKMTGWMYFASKLLAEKEAREASKENNIDFISIIPTLVVGPFITPTFPPSLITALSLITGNEAHYSIIKQGQFVHLDDLCEAHIFLYENPKAEGRYICSNYDGTIHDLAKIMREKWPEYYIPDELKGIDKNIPVVSFCSKKLTGMGFQYKYNLDDMFKGAIDTCRQKGLLPHSTQILENGQENGLIPESQQK。本发明所述DFR酶能够催化二氢槲皮素和二氢杨梅素反应生成相应的无色花色素。
本发明提供了一种编码上述DFR酶的基因OjDFR1，所述基因OjDFR1的cDNA的序列如SEQ ID NO.2所示：ATGGGAGTGGAGGATGCAACTGCTGCTGCTGCTGCGACAAAGGCCGGCACAGTGTGTGTGACCGGAGCTGGTGGATTTATAGGATCATGGCTTGTTATGAGACTCCTTGAACGTGACTATATTGTTCGTGCCACTGTCCGGAATCCAGGGGATACAAAGAAAGTGAAACATCTTCTTGAGTTGCCAAAAGCCAGCACGAATTTGACCCTTTGGAAAGCCGATATGACTGAAGAAGGAAGTTTTGATGAGGCCATTCAAGATTGTGATGGGGTTTTTCATGTTGCCACACCTATGGATTTTGAATCTAAAGACCCTGAGAATGAAGTGATCAAGCCAACAATTGATGGGATTTTGAACATCATAAGATCATGCGTCAAGGCCAAAACAGTGAAGAGGCTGGTTTACACTTCATCAGCTGGAACAGTCAATGTTCAAGAACACCAACGGCCTGTCTATGACGAGAACGACGAGAGTGATTTGGATTTCATCTATTCCAAGAAGATGACAGGATGGATGTATTTTGCTTCAAAACTTTTGGCTGAGAAAGAAGCACGAGAAGCATCCAAAGAGAACAATATTGATTTCATCAGTATTATACCAACGCTAGTCGTAGGTCCATTCATCACGCCAACATTCCCACCAAGCCTAATAACTGCACTTTCATTGATAACTGGGAATGAAGCACATTATTCAATCATTAAGCAAGGTCAATTCGTGCATTTGGATGATCTGTGTGAAGCCCATATATTCTTGTACGAGAATCCCAAAGCCGAGGGAAGATACATTTGCTCCAATTATGATGGAACTATTCATGATTTGGCCAAAATTATGAGAGAGAAATGGCCAGAATACTATATCCCTGATGAGTTGAAGGGAATAGACAAGAACATACCTGTGGTGTCCTTTTGTTCCAAGAAATTGACAGGCATGGGTTTCCAATATAAGTACAATTTGGATGACATGTTCAAGGGAGCCATTGATACGTGCCGTCAAAAGGGACTACTACCCCATTCAACCCAAATCCTTGAAAACGGCCAAGAGAATGGATTAATCCCAGAATCCCAGCAAAAATAG。本发明通过对日本蛇根草花瓣组织的转录组进行测序，根据测序结果设计引物，扩增得到上述控制日本蛇根草花色苷合成的OjDFR1基因的cDNA，通过表达载体得到所述DFR酶，进而验证其具有DFR酶的催化活性，从而证明了本发明提供的DFR酶可以控制日本蛇根草花色苷的合成，编码该DFR酶的基因可以用于植物花色苷的改良。
本发明还提供了一种扩增上述基因OjDFR1的引物对，所述引物对包括OjDFR1F1和OjDFR1R1；所述OjDFR1F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：CGATTCTCACATTCCATCTTCA；所述OjDFR1R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示：GGGAAGACATTTACGCAT。
本发明提供了一种表达权利要求1所述DFR酶的表达载体，所述表达载体包括上述基因OjDFR1和基础载体；所述基础载体包括pET-32a(+)载体。本发明对所述基础载体的来源没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的市售商品即可。
在本发明中，所述基因OjDFR1的cDNA序列优选位于基础载体的EcoR I和Hind III酶切位点之间；扩增所述基因OjDFR1的cDNA序列的引物对包括OjDFR1F2和OjDFR1R2；所述OjDFR1F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示：CGGAATTCATGGGAGTGGAGGATGCA；所述OjDFR1R2的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示：CCCAAGCTTCTATTTTTGCTGGGATTC。
本发明还提供了一种双元表达载体，所述双元表达载体包括上述基因OjDFR1和基础载体；所述基础载体包括pBI121载体。在本发明中，所述基因OjDFR1的cDNA序列优选位于基础载体的BamH I和Xba I酶切位点之间；扩增所述基因OjDFR1的cDNA序列的引物对包括OjDFR1F3和OjDFR1R3；所述OjDFR1F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示:GCTCTAGAATGGGAGTGGAGGATGCA；所述OJDFR1R3的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示:CGGGATCCCTATTTTTGCTGGGATTC。本发明对所述基础载体的来源没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的市售商品即可。
本发明还提供了上述的基因OjDFR1或上述的引物对或上述的双元表达载体在植物花色苷改良中的应用。在本发明中，所述植物优选包括日本蛇根草、烟草或拟南芥。本发明提供的含有基因OjDFR1的双元表达载体可以使拟南芥突变子叶和下胚轴中的花色苷的合成得到恢复，并加深烟草的花色；本发明提供的基因OjDFR1在转基因植物花卉的花色修饰及药用植物药用成分的改良方面具有潜在的应用价值。
本发明还提供了一种改变植物花色苷的方法，包括：将上述双元表达载体导入农杆菌中，利用所述农杆菌侵染植物，得到花色苷改变的植物。在本发明中，所述农杆菌优选包括GV310农杆菌。本发明对所述导入的方式没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的导入方式即可。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的与日本蛇根草花色苷合成相关的DFR酶、编码基因、表达载体、双元表达载体及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
日本蛇根草OjDFR1基因的克隆
根据日本蛇根草花瓣组织的转录组测序结果设计引物OjDFR1F1(SEQ ID NO.3所示)和OjDFR1R1(SEQ ID NO.4所示)，扩增控制日本蛇根草花色苷合成的OjDFR1基因的cDNA，通过PCR扩增，获得1074bp的扩增片段(SEQ ID NO.2所示)，编码357个氨基酸(SEQ IDNO.1所示)；所述PCR扩增的反应体系如表1所示：
表1 PCR扩增反应体系
成分
用量(μl)
模板(日本蛇根草花瓣的cDNA)
1
OjDFR1F1
1
OjDFR1R1
1
dNTP(2.5mM)
1.6
MgCl2(25mM)
2
Taq酶(2.5U)
0.4
10×Taq Buffer
2
所述PCR扩增的反应进程如下：94℃预变性8min；94℃变性30s，53℃退火90s，72℃延伸8min，30个循环。
将上述扩增得到的OjDFR1基因的cDNA与烟草拟南芥的DFR进行比对分析，结果表明OjDFR1基因具有二氢黄酮醇4-还原酶普遍存在的活性位点与保守结构域(图1)。
随后，将不同植物来源的DFR与其它NADPH依赖的还原酶的氨基酸序列与OjDFR1基因的cDNA编码的氨基酸序列(OjDFR1蛋白)进行多序列比对完成系统进化树的构建，结果显示，OjDFR1蛋白归到了DFR家族，这一结果与氨基酸比对结果是一致的(图2)。根据上述生物信息学分析结果，推测日本蛇根草DFR1基因可能具有二氢黄酮醇4-还原酶类似的功能。
实施例2
日本蛇根草OjDFR1的酶活检测
原核表达载体的构建
为验证OjDFR1蛋白的酶活，利用克隆得到的全长OjDFR1基因作为模板，分别带有EcoR I和Hind III酶切位点的引物OjDFR1F2(SEQ ID NO.5所示)和OjDFR1R2(SEQ ID NO.6所示)进行OjDFR1开放阅读框的PCR扩增，PCR反应体系见表2，所述PCR扩增的反应进程如下：94℃预变性8min；94℃变性30s，53℃退火90s，72℃延伸8min，30个循环。分别利用EcoRI和Hind III两种限制性内切酶酶切上述扩增得到的DNA片段，并将其克隆到pET-32a(+)上，这样构建的重组质粒命名为pET32-OjDFR1，并导入大肠杆菌BL21细胞中，准备可溶性重组蛋白的大量制备(具体实验过程参考如下文献：Sun W,Shen H,Xu H,et al.ChalconeIsomerase a Key Enzyme for Anthocyanin Biosynthesis inOphiorrhizajaponicaData_Sheet_1.doc[J].Frontiers in Plant Science,2019,10)。
表2 PCR扩增反应体系
成分
用量(μl)
模板(含有OjDFR1基因的T载体质粒1ng/μl)
1
引物1
1
引物2
1
dNTP(2.5mM)
1.6
MgCl<sub>2</sub>(25mM)
2
Taq酶(2.5U)
0.4
10×Taq Buffer
2
可溶性重组蛋白的诱导和表达
将上述大肠杆菌划线接种于含Amp(浓度为0.1mg/mL)的LB固体培养基中，37℃恒温培养箱倒置培养12～16h；挑取克隆，200rpm，37℃，培养14h；次日取1ml培养物接种于5ml含有LB液体培养基的试管中，200rpm，37℃，震荡培养，每半小时拿出来一支，4℃暂时保存；其中一只试管不接菌，作空白对照。
将各个时间段的菌液取出2ml，测定OD600值，每个时间点重复测三次，绘制生长曲线，结果显示在2h后大肠杆菌进入生长对数期，在2.5h时生长速度最快，菌的状态最佳，所以选择2.5h后对该菌进行IPTG诱导。经不同IPTG浓度及不同诱导时间的试验，最终确定该蛋白的最佳诱导条件为15℃，IPTG浓度为0.2mM下诱导24h。
按照上述条件大量制备蛋白，并通过镍柱与咪唑洗脱对目的蛋白进行分离与纯化，洗脱过程如下：
a.装柱：在Ni-NTA预装柱中缓慢加入填充液，期间不断用20％乙醇压实，当填充物到2ml左右时，用10ml 20％乙醇进一步压实，最后用20mM PBS缓冲液平衡柱子，4℃保存备用；
b.重组蛋白的大量制备
(1)在最佳诱导条件大量制备大肠杆菌培养物；
(2)将大肠杆菌培养物分装至50ml离心管中，置于高速离心机中进行离心，温度设置为：4℃，转速：5000rmp，离心10min，倒掉上清，收集菌体；
(3)每50ml菌液加入5ml 20mM PBS悬浮菌体，插入冰中，冰浴30min；
(4)超声：超5s，停5s，400～600W输出，设定10min，超声破碎细胞，待菌液冷却后重复超声一次；
(5)破壁后的菌液置于高速离心机中离心，设置温度为：4℃，转速6000rpm离心15min，上清即为蛋白粗提取液；
c.上样：将收集的上清溶液重复上Ni柱3次，并用3倍体积的PBS平衡；
d.咪唑洗脱：平衡后，用咪唑浓度依次为10mM、20mM、50mM、100mM、200mM、500mM的洗脱缓冲液进行洗脱，每个浓度梯度收集5管洗脱液，2ml/管；
e.洗柱：用20mM PBS缓冲液洗柱，洗净后用20％乙醇浸泡，4℃保存；
f.SDS-PAGE电泳验证：将过柱后收集的各管洗脱液进行SDS-PAGE电泳，分析重组蛋白的洗脱及纯化情况。
将洗脱后得到的蛋白进行大量收集并完成透析，利用变色硅胶在低温条件下完成目的蛋白的浓缩，将得到的目的蛋白保存于-80℃冰箱中，待酶活检测(图3中的A)。
OjDFR1蛋白的活性鉴定
以三种二氢黄酮醇(DHQ、DHM和DHK)为底物，反应体系为DFR1蛋白35μg，二氢黄酮醇(10mg/ml)10μl，100mM TrisHCl(pH7.0)40μl，20mM NADPH 50μl，30℃条件下反应30min后，利用HPLC检测反应产物。结果如图3中的B～D所示。
由图3中的B～D的结果可知，OjDFR1蛋白能够催化DHQ和DHM反应生成相应的无色花色素，证明日本蛇根草OjDFR1具有二氢黄酮醇4-还原酶的活性。
实施例3
OjDFR1基因对拟南芥和烟草花色苷合成的影响
双元表达载体的构建
为验证OjDFR1基因对拟南芥花色苷合成的影响，利用克隆得到的全长OjDFR1基因作为模板，分别带有BamH I和Xba I酶切位点的引物OjDFR1F3(SEQ ID NO.7所示)和OjDFR1R3(SEQ ID NO.8所示)进行OjDFR1开放阅读框的PCR扩增，PCR扩增的体系和反应进程与实施例2相同。分别利用BamH I和Xba I两种限制性内切酶酶切上述扩增得到的DNA片段，并将其克隆到pBI121上(克隆方法与实施例2方法相似，区别在于将质粒pET-32a(+)替换为质粒pBI121)。这样构建的重组质粒命名为pBI121-OjDFR1，并导入农杆菌GV3101细胞中，准备拟南芥的遗传转化，具体的导入方法入下：
(1)取200μl农杆菌GV3101感受态细胞，加入10μl重组质粒轻轻混匀后冰浴30min；
(2)将混合物放入42℃水浴锅中，热击90s；
(3)取出混合物，立即冰浴2min；
(4)在无菌操作台中加入500μl无抗LB液体培养基，30℃，200rpm，恒温振荡培养1.5h后，5000rpm，离心3min；
(5)在无菌操作台中取100μl上清悬浮菌体并涂布于LB固体培养基(50mg/LKan+50mg/LRif)，30℃，倒置培养48h。
转基因植株表型分析
日本蛇根草的组织培养及植株再生体系正在建立中，因此，首先将OjDFR1基因导入拟南芥突变体中进行初步功能验证。
利用上述构建好的真核表达载体，通过农杆菌侵染液侵染拟南芥，受体材料DFR突变体植株，通过Kan抗性筛选获得过表达转基因植株3和转基因植株5。将转基因植株单株培养，并收集种子，将收取的种子种在含有抗性的花色苷诱导培养基上，观察T2代幼苗的表型变化(具体实验过程参考如下文献：Wei S,Meng X,Liang L,et al.Molecular andBiochemical Analysis of Chalcone Synthase from Freesia hybrid in FlavonoidBiosynthetic Pathway[J].Plos One,2015,10(3):e0119054.)，结果如图4所示。
同时通过注射法与组织培养获得转基因烟草植株4和转基因植株5，待烟草成功生根后，移栽到土壤中继续培养，待开花后观察花瓣表型变化(具体实验过程参考如下文献：Sparkes I A,Runions J,Kearns A,et al.Rapid,transient expression offluorescent fusion proteins in tobacco plants and generation of stablytransformedplants.[J].Nature Protocols,2006,1(4):2019-25.)，结果如图5所示。
由图4可知，与突变体植株相比，转基因植株子叶与下胚轴中的花色苷得到成功恢复，同时分别提取野生型、突变体和转基因植株的总RNA，通过RT-PCR验证发现，在转基因植株中成功检测到OjDFR1，而野生型与突变体中没有检测到。
由图5可知，与野生型植株相比，烟草花瓣颜色加深，通过RT-PCR验证发现，在转基因植株中成功检测到OjDFR1，而野生型中没有检测到。
通过酶活检测分析发现，OjDFR1可以催化二氢黄酮醇反应生成无色花色素，证明我们克隆得到OjDFR1确实是二氢黄酮醇4-还原酶。同时，当OjDFR1基因转入拟南芥突变体后，可以使拟南芥突变体子叶和下胚轴中的花色苷的合成得到恢复，同时加深烟草的花色。
综上所述，本发明提供的的日本蛇根草的OjDFR1基因可以控制日本蛇根草花色苷的合成，同时可应用于其它植物花色苷的改良；在转基因植物花卉的花色修饰及药用植物药用成分的改良方面具有潜在的应用价值。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 贵州中医药大学
<120> 与日本蛇根草花色苷合成相关的DFR酶、编码基因、表达载体、双元表达载体及其应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 357
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Gly Val Glu Asp Ala Thr Ala Ala Ala Ala Ala Thr Lys Ala Gly
1 5 10 15
Thr Val Cys Val Thr Gly Ala Gly Gly Phe Ile Gly Ser Trp Leu Val
20 25 30
Met Arg Leu Leu Glu Arg Asp Tyr Ile Val Arg Ala Thr Val Arg Asn
35 40 45
Pro Gly Asp Thr Lys Lys Val Lys His Leu Leu Glu Leu Pro Lys Ala
50 55 60
Ser Thr Asn Leu Thr Leu Trp Lys Ala Asp Met Thr Glu Glu Gly Ser
65 70 75 80
Phe Asp Glu Ala Ile Gln Asp Cys Asp Gly Val Phe His Val Ala Thr
85 90 95
Pro Met Asp Phe Glu Ser Lys Asp Pro Glu Asn Glu Val Ile Lys Pro
100 105 110
Thr Ile Asp Gly Ile Leu Asn Ile Ile Arg Ser Cys Val Lys Ala Lys
115 120 125
Thr Val Lys Arg Leu Val Tyr Thr Ser Ser Ala Gly Thr Val Asn Val
130 135 140
Gln Glu His Gln Arg Pro Val Tyr Asp Glu Asn Asp Glu Ser Asp Leu
145 150 155 160
Asp Phe Ile Tyr Ser Lys Lys Met Thr Gly Trp Met Tyr Phe Ala Ser
165 170 175
Lys Leu Leu Ala Glu Lys Glu Ala Arg Glu Ala Ser Lys Glu Asn Asn
180 185 190
Ile Asp Phe Ile Ser Ile Ile Pro Thr Leu Val Val Gly Pro Phe Ile
195 200 205
Thr Pro Thr Phe Pro Pro Ser Leu Ile Thr Ala Leu Ser Leu Ile Thr
210 215 220
Gly Asn Glu Ala His Tyr Ser Ile Ile Lys Gln Gly Gln Phe Val His
225 230 235 240
Leu Asp Asp Leu Cys Glu Ala His Ile Phe Leu Tyr Glu Asn Pro Lys
245 250 255
Ala Glu Gly Arg Tyr Ile Cys Ser Asn Tyr Asp Gly Thr Ile His Asp
260 265 270
Leu Ala Lys Ile Met Arg Glu Lys Trp Pro Glu Tyr Tyr Ile Pro Asp
275 280 285
Glu Leu Lys Gly Ile Asp Lys Asn Ile Pro Val Val Ser Phe Cys Ser
290 295 300
Lys Lys Leu Thr Gly Met Gly Phe Gln Tyr Lys Tyr Asn Leu Asp Asp
305 310 315 320
Met Phe Lys Gly Ala Ile Asp Thr Cys Arg Gln Lys Gly Leu Leu Pro
325 330 335
His Ser Thr Gln Ile Leu Glu Asn Gly Gln Glu Asn Gly Leu Ile Pro
340 345 350
Glu Ser Gln Gln Lys
355
<210> 2
<211> 1074
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgggagtgg aggatgcaac tgctgctgct gctgcgacaa aggccggcac agtgtgtgtg 60
accggagctg gtggatttat aggatcatgg cttgttatga gactccttga acgtgactat 120
attgttcgtg ccactgtccg gaatccaggg gatacaaaga aagtgaaaca tcttcttgag 180
ttgccaaaag ccagcacgaa tttgaccctt tggaaagccg atatgactga agaaggaagt 240
tttgatgagg ccattcaaga ttgtgatggg gtttttcatg ttgccacacc tatggatttt 300
gaatctaaag accctgagaa tgaagtgatc aagccaacaa ttgatgggat tttgaacatc 360
ataagatcat gcgtcaaggc caaaacagtg aagaggctgg tttacacttc atcagctgga 420
acagtcaatg ttcaagaaca ccaacggcct gtctatgacg agaacgacga gagtgatttg 480
gatttcatct attccaagaa gatgacagga tggatgtatt ttgcttcaaa acttttggct 540
gagaaagaag cacgagaagc atccaaagag aacaatattg atttcatcag tattatacca 600
acgctagtcg taggtccatt catcacgcca acattcccac caagcctaat aactgcactt 660
tcattgataa ctgggaatga agcacattat tcaatcatta agcaaggtca attcgtgcat 720
ttggatgatc tgtgtgaagc ccatatattc ttgtacgaga atcccaaagc cgagggaaga 780
tacatttgct ccaattatga tggaactatt catgatttgg ccaaaattat gagagagaaa 840
tggccagaat actatatccc tgatgagttg aagggaatag acaagaacat acctgtggtg 900
tccttttgtt ccaagaaatt gacaggcatg ggtttccaat ataagtacaa tttggatgac 960
atgttcaagg gagccattga tacgtgccgt caaaagggac tactacccca ttcaacccaa 1020
atccttgaaa acggccaaga gaatggatta atcccagaat cccagcaaaa atag 1074
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgattctcac attccatctt ca 22
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cgggatccct atttttgctg ggattc 26
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