具体实施方式

实施例1：螺旋富贵草碱A制备方法：

取三角咪用75％乙醇加热回流提取3次，每次2h，合并滤液减压蒸馏至干燥浸膏，浸膏再经柱层析分离纯化，得螺旋富贵草碱A纯品。

实施例2：螺旋富贵草碱A制备方法：

取三角咪药材590g，加入7倍药材重量75％乙醇，加热回流提取3次，每次2h，合并滤液减压蒸馏至干燥浸膏。将浸膏加水稀释，用正丁醇萃取3次，回收溶剂后得到正丁醇部分。正丁醇部分硅胶柱层析，V_(氯仿)：V_(甲醇)(1:1)为洗脱剂，得螺旋富贵草碱A粗品。螺旋富贵草碱A粗品再经硅胶柱层析，V_(石油醚)：V_(丙酮)：V_(二乙胺)(20:5:1)为洗脱剂，得螺旋富贵草碱A纯品。

实施例3：螺旋富贵草碱A制备方法：

取三角咪药材590g，加入5倍药材重量75％乙醇，加热回流提取3次，每次2h，合并滤液减压蒸馏至干燥浸膏。将浸膏加水稀释，用正丁醇萃取3次，回收溶剂后得到正丁醇部分。正丁醇部分硅胶柱层析，V_(氯仿)：V_(甲醇)(1:1)为洗脱剂，得螺旋富贵草碱A粗品。螺旋富贵草碱A粗品再经硅胶柱层析，V_(石油醚)：V_(丙酮)：V_(二乙胺)(20:5:1)为洗脱剂，得螺旋富贵草碱A纯品。

实施例4：螺旋富贵草碱A制备方法：

取三角咪药材590g，加入10倍药材重量75％乙醇，加热回流提取3次，每次2h，合并滤液减压蒸馏至干燥浸膏。将浸膏加水稀释，用正丁醇萃取3次，回收溶剂后得到正丁醇部分。正丁醇部分硅胶柱层析，V_(氯仿)：V_(甲醇)(1:1)为洗脱剂，得螺旋富贵草碱A粗品。螺旋富贵草碱A粗品再经硅胶柱层析，V_(石油醚)：V_(丙酮)：V_(二乙胺)(20:5:1)为洗脱剂，得螺旋富贵草碱A纯品。

实施例5：螺旋富贵草碱A的应用：将螺旋富贵草碱A作为单一活性成分，加入药用载体或赋形剂(一种或多种固体、半固体、液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂)，制成治疗肝癌的药物制剂(剂型可以是混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂或冲剂)。

实施例6：螺旋富贵草碱A的应用：将螺旋富贵草碱A与其他具有肝癌抑制活性的药用成分搭配使用，加入药用载体或赋形剂(一种或多种固体、半固体、液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂)，制成治疗肝癌的药物组合物(剂型可以是混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂或冲剂)。

试验例：

一、螺旋富贵草碱A抗肝癌活性实验

1螺旋富贵草碱A的制备方案见实施例1-4。

2螺旋富贵草碱A体外抗肝癌细胞活性筛选方案

将培养皿中对数生长期的肝癌(MHCC97H)细胞消化后重悬。使用细胞计数仪计数，调节细胞密度在3000-5000个/每孔接种于96孔板中。置于37℃，5％的CO₂培养箱中培养过夜，贴壁后加入螺旋富贵草碱A(1.25、2.5、5、10μM)，继续培养48h。48h后于每孔加入10μL的MTT，再继续孵育4h。移去含MTT的培养液，加入200μL的DMSO溶液，水平放置在摇床上震荡10min，使结晶完全溶解，采用酶标仪测定490nm处吸光度值，重复三次实验，计算细胞增殖抑制率。计算公式：

增殖抑制率＝[(对照组OD值—实验组OD值)/对照组OD值]×100％。

3螺旋富贵草碱A诱导MHCC97H细胞产生空泡化现象研究方案

将培养皿中对数生长期的MHCC97H肝癌细胞，用1ml胰酶消化后重悬，用细胞计数仪调节密度为每孔2×10⁵个细胞铺于6孔板中。过夜放在37℃，5％的CO₂培养箱中培养。贴壁后分别用(0μM，1.25μM，2.5μM，5μM)梯度的螺旋富贵草碱A处理细胞，分别在6h、12h、24h、48h、72h后，用倒置荧光显微镜观察并拍照。

4螺旋富贵草碱A可能诱导肿瘤细胞出现胞质空泡化死亡作用机制的探究

4.1螺旋富贵草碱A诱导非自噬性细胞死亡研究方案

4.1.1溶酶体红色荧光探针(Lyso-tracker Red)染色

将培养皿中对数生长期的肝癌细胞(MHCC97H)，用胰酶消化后重悬，接种在6孔板中，过夜贴壁。贴壁后分别用不同浓度(0μM，1.25μM，2.5μM，5μM)的螺旋富贵草碱A处理细胞。在24h后，弃去旧的培养基，用PBS清洗2-3次，然后加入染料(Lyso-tracker Red)染色1h，弃去染料，用PBS清洗2-3次，再加入新的培养基，避光在倒置荧光显微镜下观察并拍照。

4.1.2WB实验检测自噬相关蛋白(LC3和P62)的表达

(1)MHCC97H细胞中总蛋白的提取：

1)将螺旋富贵草碱A处理后的细胞，用PBS洗两遍，加入预热的裂解液，用刮刀刮下细胞，吸取至EP管中。

2)95℃，20min加热变性。

3)用BCA法，绘制标准曲线，测定吸光度，计算细胞的蛋白浓度。

(2)SDS-PAGE电泳：

1)SDS-PAGE胶的配制：根据目的蛋白选择不同浓度的分离胶(配制见表1)。待分离胶凝固后，再配制浓缩胶(配制见表2)，然后快速并水平的插入上样梳子，其相应胶的配方如下表：

表1分离胶配方

表2浓缩胶胶配方

2)待浓缩胶凝固后，再将上样梳子水平并向上拔出，安置于电泳槽内，加入1×电泳缓冲液。

3)上样和电泳：37℃预热处理好的样品蛋白和标准蛋白Marker，按照标准曲线计算蛋白浓度，取出30-80μg的蛋白浓度所对应的体积，进行上样，完成后连接电泳仪，恒压80V使得蛋白样品跑出浓缩胶，再换120V电压，使溴酚蓝跑到电泳槽的底部，停止电泳。

4)转膜：取出电泳完毕的胶，切除浓缩胶和溴酚蓝以下部分，按照分离胶的大小裁剪出合适的PVDF膜。按照负极－海绵－滤纸－分离胶－PVDF膜－滤纸－海绵的顺序组装，轻轻赶走气泡，安装到电转槽中。恒压110V，1-2h。

5)封闭：转膜结束，将PVDF膜取出，放在用TBST配制的5％的脱脂奶粉中，水平摇床缓慢摇动1h。

6)孵育一抗：将封闭好的PVDF膜放在TBST溶液中，随后根据实验需要孵育不同的抗体。摇床孵育，4℃过夜。

7)洗膜：次日，取出PVDF膜，回收一抗，用TBST溶液快速洗涤15min，共3次。

8)孵育二抗：将洗好的膜，放入预先配置的二抗中，常温孵育2h。

9)洗膜：取出PVDF膜，回收二抗，用TBST溶液快速洗涤15min，共3次。

10)显影：预先配制ECL发光液，A:B＝1:1配成工作液，使PVDF膜浸在发光液中，迅速放在凝胶成像仪中成像，结果用Image Lab软件处理分析。

4.1.3自噬抑制3-MA对螺旋富贵草碱A诱导的细胞质空泡影响

将培养皿中对数生长期的MHCC97H肝癌细胞，用1ml胰酶消化后重悬，用细胞计数仪调节密度为每孔2×10⁵个细胞铺于6孔板中。过夜放在37℃，5％的CO₂培养箱中培养。贴壁后先用2mM的3-MA预处理细胞6h，后吸走3-MA处理液，再用5μM梯度的螺旋富贵草碱A处理细胞，分别在48h、72h后，用倒置荧光显微镜观察并拍照。

4.2螺旋富贵草碱A诱导非副凋亡性细胞死亡研究方案

4.2.1线粒体绿色荧光探针(Mito-tracker Green)染色

方法同4.1.1。

4.2.2内质网红色荧光探针(ER-tracker Red)染色

方法同4.1.1。

4.2.3WB实验检测MAPK信号通路关键蛋白(P38,JNK,ERK)的表达

方法同4.1.2。

4.3螺旋富贵草碱A诱导产生巨胞饮死亡研究方案

4.3.1细胞外液绿色荧光探针(Lucifer Yellow)染色

方法同4.1.1。

4.3.2电镜实验

①固定：将0μM和5μM梯度的螺旋富贵草碱A处理的MHCC97H细胞经3％戊二醛预固定，1％四氧化锇再固定；②脱水：丙酮逐级脱水，脱水剂浓度梯度为30％→50％→70％→80％→90％→95％→100％(100％浓度中换3次)；③渗透和包埋：将脱完水的样品先后经过脱水剂和环氧树脂(型号为Epon812)渗透液，比例分别为3:1、1:1、1:3，每步30～60min。将渗透好的样品块放到适当模具中，灌上包埋液包埋经过加温聚合形成一种固体基质(包埋块)，以备下一步切片；④超薄切片：采用超薄切片机制备约60～70nm厚的超薄切片后，漂浮于刀槽液面上，再捞至铜网；⑤染色及观察：先用醋酸铀染色10～15min，再用枸橼酸铅染色1～2min，室温下染色，采用日本电子生产的JEM-1400FLASH透射电镜对铜网进行图像采集，每张铜网先于6000倍下观察，选择要观察的区域采集图片，观察具体病变。

4.4螺旋富贵草碱A诱导非凋亡性细胞死亡研究方案

4.4.1流式细胞仪检测细胞凋亡

将培养皿中对数生长期的MHCC97H肝癌细胞，消化后重悬，接种在6孔板中，过夜贴壁，用不同浓度梯度(0μM，1.25μM，2.5μM，5μM)的螺旋富贵草碱A处理细胞24h。后用无EDTA胰酶消化，1000rmp离心4min，收集细胞悬液至EP管中，冷的PBS洗涤一次，3000rmp离心5min。倒去PBS。加入100μL的稀释buffer重悬细胞，再向每管中加入5μL的Annexin/FITC，再加入10μL的PI，常温避光孵育10min。用流式细胞仪检测，检测完后用Flow Jo软件对结果进行分析。

4.4.2WB实验检测凋亡相关蛋(Cleaved Caspase-8、Cleaved Caspase-3、CleavedCaspase-9以及BAX和Bcl2)的表达

方法同4.1.2。

4.5螺旋富贵草碱A诱导非周期阻滞的DNA损伤研究方案

4.5.1WB实验检测DNA损伤相关蛋白(P53、Cleaved PARP和Histone H2A.X)的表达

方法同4.1.2。

4.5.2细胞周期实验

将培养皿中对数生长期的MHCC97H肝癌细胞，消化后重悬，接种在6孔板中，过夜贴壁。用不同浓度梯度(0μM，1.25μM，2.5μM，5μM)的螺旋富贵草碱A处理细胞24h。再用无EDTA胰酶消化，1000rmp离心4min，收集细胞悬液至EP管中。冷的PBS洗涤一次，3000rmp离心5min。倒去PBS，用预冷的75％的乙醇固定过夜。次日，2000rpm离心10min，弃去乙醇，用PBS洗涤1-2遍，每次3000rmp离心5min。再加入300μL的1×PBS重悬细胞，再向每管中加入3μL的10×PI，常温避光孵育30min。用流式细胞仪检测，检测完后用Flow Jo软件对结果进行分析。

5螺旋富贵草碱A体内抗肿瘤活性研究方案

5.1体内移植瘤抑制实验

(1)荷瘤模型建立、分组和给药：将生长状态良好的MHCC97H肝癌细胞调节细胞数以5×10⁶个/0.1mL注射于SPF级Balb/c无胸腺裸鼠的大股下，待肿瘤长至100mm³后随机分为三组。以空白组(生理盐水)、给药组1(25mg/kg螺旋富贵草碱A)和给药组2(50mg/kg螺旋富贵草碱A)参照裸鼠的体重，灌胃给药为0.1mL/只，每天给药一次，连续给药18天。

(2)药效评价：分组后，每两天测量裸鼠体重和肿瘤体积并记录。给药结束后，所有裸鼠均脱颈处死，解剖分离出的瘤块称重和拍照。取出一部分瘤块置于4％的多聚甲醛中，用于切片、包埋和HE染色。取出另一部分冻存于-20℃的冰箱中，用于WB实验验证蛋白的表达。再解剖出裸鼠的内部肝脏，用于切片、包埋和HE染色来评价裸鼠的用药安全性。

5.2肝/肿瘤组织切片HE染色

取出一部分瘤块和肝脏置于4％的多聚甲醛中，固定成功后需要修剪25px*25px*5px，放入包埋盒中，流水冲洗(去除组织中的固定液)30分钟。至于不同浓度的酒精脱水，一般用由低浓度到高浓度酒精作脱水剂，逐渐脱去组织块中的水份。再将组织块置于二甲苯中透明。再将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中，放入溶蜡箱保温。待石蜡完全浸入组织块后进行包埋，冷却凝固成块即可。立即将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成薄片，一般为5-8微米厚。放到加热的水中烫平，再贴到载玻片上，放45℃恒温箱中烘干。染色前，须用二甲苯脱去切片中的石蜡，再经由高浓度到低浓度酒精，最后入蒸馏水，就可染色。即将已入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染色数分钟。染色后的切片经纯酒精脱水，再经二甲苯使切片透明。最后将已透明的切片滴上树胶，盖上盖玻片封固。待树胶略干后，贴上标笺，切片标本即可使用。

5.3WB法检测各肿瘤组织中凋亡、副凋亡和自噬死亡等相关的关键蛋白的表达水平变化方法同4.1.2。

二、螺旋富贵草碱A抗肝癌活性实验结果

1螺旋富贵草碱A的制备结果

得9.4g螺旋富贵草碱A纯品，得率为1.59％，无色针晶，mp.278-280℃.IR(KBr)cm^-1:2930,2860,1690,1610,1593,1468.EI-MS m/z:462([M⁺]),447,432,418,391,376,360,172,105,91,72(100).¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ:7.78(1H,m,H-6'),7.53(1H,m,H-4'),7.40(2H,m,H-3',H-5'),3.39(3H,s,N-CH₃),2.17(6H,s,N(CH₃)₂),1.00(3H,s,19-CH₃),0.88(3H,d,J＝6.8Hz,21-CH₃),0.69(3H,s,18-CH₃).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃,)δ:35.45(C-1),32.18(C-2),64.04(C-3),39.68(C-4),42.37(C-5),28.70(C-6),31.77(C-7),35.03(C-8),54.85(C-9),35.51(C-10),20.90(C-11),39.68(C-12),41.63(C-13),56.60(C-13),23.94(C-15),27.62(C-16),54.51(C-17),12.35(C-18),11.45(C-19),61.01(C-20),9.80(C-21),39.85(N(CH₃)₂),29.45(N-CH₃),168.89(C＝O),130.66(C-1'),152.61(C-2'),127.73(C-3'),123.26(C-4'),120.88(C-5'),131.54(C-6').以上波谱数据与文献(邱声祥，张壮鑫，周俊，合掌消的甾体成分，云南植物研究，1990,12(1):107-109)对照基本一致。

2螺旋富贵草碱A体外抗肝癌细胞活性筛选结果

由图1可知，螺旋富贵草碱A浓度大于2.5μM时能够显著抑制肝癌细胞的增值。

3螺旋富贵草碱A诱导MHCC97H细胞产生空泡化现象结果

我们在对不同剂量螺旋富贵草碱A处理肝癌(MHCC97H)细胞0h、12h、24h、36h和48h时发现经药物处理后的细胞除了数量显著减少外，细胞质出现了空泡化现象，而且这种小泡会随着给药时间的延长不断增多，并且不断地相互融合成较大的空泡且呈较好的时间-剂量依赖性，见图2。上述结果提示螺旋富贵草碱A可能是通过诱导肝癌细胞的胞质空泡化而发挥抗肿瘤活性。

4螺旋富贵草碱A可能诱导肿瘤细胞出现胞质空泡化死亡作用机制的探究结果

4.1螺旋富贵草碱A诱导非自噬性细胞死亡研究结果

溶酶体荧光探针Lyso-tracker Red染色发现该染液无法进入螺旋富贵草碱A诱导的细胞质空泡，见图3，提示该空泡并非来源于溶酶体。Western blotting分析结果表明虽然螺旋富贵草碱A作用可使LC3-II/I比值升高，但自噬底物P62的蛋白水平并未降低，见图4-1至4-3，提示自噬溶酶体降解途径被抑制，自噬流被阻断。而且，自噬抑制3-MA并未能抑制螺旋富贵草碱A诱导的细胞质空泡的产生，见图5，提示其并未形成正常的自噬流。综上研究结果表明，螺旋富贵草碱A可能并不是通过自噬诱导MHCC97H细胞产生胞质空泡。

4.2螺旋富贵草碱A诱导非副凋亡性细胞死亡研究结果

结果表明螺旋富贵草碱A诱导的细胞质空泡未能被Mito-tracker Green及ER-tracker Red染色，见图6和7，提示该空泡并非来源于线粒体和内质网。同时，Westernblotting实验结果表明MAPK信号通路关键靶点的磷酸化水平并未出现明显变化，见图8-1至8-4，表明螺旋富贵草碱A诱导的细胞质空泡与MAPK信号通路无关。以上结果表明螺旋富贵草碱A可能并不是通过副凋亡途径诱导细胞质空泡。

4.3螺旋富贵草碱A诱导产生巨胞饮死亡研究结果

结果表明螺旋富贵草碱A诱导的细胞质空泡能被Lucifer Yellow染料染成绿色，见图9，提示该空泡中液体主要来源于巨胞饮摄入的细胞外液。我们发现螺旋富贵草碱A处理细胞产生的小泡形态与巨胞饮的胞饮小泡十分相似，均围绕着细胞核且数目众多，见图9中细胞成像。与此同时，使用标记细胞外液的Lucifer Yellow染料可以通过巨胞饮途径进入部分胞饮的小泡中，但进入较少且荧光强度较弱且随着时间的推移，小泡会逐渐形成大泡，空泡中进入的染料越多，荧光强度也逐渐增强，见图9中荧光和成像的融合。透射电子显微镜进一步证实了这一结论，如图10所示，其结果清楚地表明，这些细胞器仍然整合在液泡之外。在巨泡式死亡中，液泡来源于大小体，它们相互融合，但不与细胞膜合并。因此，我们推测螺旋富贵草碱A诱导的细胞质空泡化死亡主要与巨胞饮所致的巨泡式死亡有关。

4.4螺旋富贵草碱A诱导非凋亡性细胞死亡研究结果

研究发现螺旋富贵草碱A处理后引起的细胞形态与细胞凋亡形态是完全不同的。而且流式细胞仪检测细胞凋亡结果表明螺旋富贵草碱A处理后的细胞凋亡率与空白对照组相比无显著性差异，见图11-1至11-2，表明螺旋富贵草碱A引起的细胞死亡可能与凋亡无关。有文献报道，相关凋亡的媒介物Caspase家族发生寡聚且自身切割活化，并能激活下游，产生凋亡效应。因此，我们通过Western blotting实验检测细胞凋亡相关蛋白CleavedCaspase-8、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9以及BAX和Bcl2的蛋白表达水平的变化，结果显示Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、Cleaved Caspase-8和BAX/Bcl2的蛋白表达水平均没有显著变化，见图12-1至12-4。综上，螺旋富贵草碱A诱导细胞巨泡式死亡可能并非通过经典的凋亡途径。

4.5螺旋富贵草碱A诱导非周期阻滞的DNA损伤研究结果

Western blotting实验的结果显示P53、Cleaved PARP和Histone H2A.X的蛋白表达水平均没有明显变化，见图13-1至13-5，提示螺旋富贵草碱A诱导细胞巨泡式死亡可能并不是一种通过DNA损伤的死亡方式。同时流式细胞仪检测结果显示细胞周期没有出现显著阻滞，见图14-1至14-2，提示可能影响螺旋富贵草碱A抑制细胞的增殖作用不是通过周期阻滞。

5螺旋富贵草碱A体内抗肿瘤活性研究结果

Balb/c无胸腺裸鼠注射MHCC97H肝癌细胞造模后分为空白组和给药组(25mg/kg和50mg/kg)。待肿瘤长至100mm³时，持续每天灌胃并每隔两天测量统计裸鼠的异位移植的肿瘤体积，见图15-1、15-2、15-4和15-5。结果显示：从灌胃第二天到第8天，50mg/kg组裸鼠的肿瘤体积明显低于空白组肿瘤体积；第10天到灌胃结束，50mg/kg组裸鼠肿瘤生长情况基本被抑制。同时25mg/kg组肿瘤的体积也是略低于空白对照组。在持续给药18天中，50mg/kg组能够明显抑制肿瘤，其抑制率基本达到了50％。肿瘤重量与对照相比也明显降低，见图15-1、15-2、15-4和15-5；并且较空白组并没有出现明显的体重下降及其他的不良反应，表明给药剂量是安全且有效的，见图15-3，同时，肝组织切片HE染色结果表明未见明显的损伤说明给药剂量是在安全范围内，见图15-3、15-6。

肿瘤组织切片HE染色结果表明：50mg/kg剂量能使肿瘤组织中有大量组织坏死并形成一些破碎的细胞，有的细胞还呈现出明显的空泡现象，这表明螺旋富贵草碱A可以诱导异种移植瘤模型中肿瘤组织出现巨泡性死亡，见图16-1。

Western Blotting法检测各肿瘤组织中凋亡、副凋亡和自噬死亡等相关的关键蛋白的表达水平变化结果表明：与体外实验结果一致，肿瘤组织中凋亡相关蛋白包括CleavedPARP、PARP、Caspase-3、BAX、Bcl2和Cleaved Caspase-9的表达水平与对照组相比并未出现明显变化，见图16-2和16-3。此外，副凋亡相关的关键蛋白p-P38也并未观察到明显变化，提示螺旋富贵草碱A诱导肿瘤组织出现的巨泡并非通过副凋亡产生，见图16-4和16-5。最后，我们检测了肿瘤组织中自噬底物P62的蛋白水平。如图16-6、16-7和16-8所示，随着给药剂量的增加，自噬底物P62的蛋白水平相应升高，提示自噬溶酶体降解途径被抑制，自噬流被阻断。由此可见，螺旋富贵草碱A诱导肿瘤组织出现的巨泡并非自噬导致的。

综上，我们推测螺旋富贵草碱A诱导肿瘤组织出现的巨泡主要是源于巨胞饮所致的巨泡式死亡，继而产生抑制肿瘤生长的效果。