具体实施方式

应理解，在本发明范围中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。

发明人发现，式(I)所示的化合物或其药学上接受的盐或溶剂合物可通过Ca²⁺-Calcineurin-NFAT信号通路上调UCP1，从而促进脂肪细胞产热，达到治疗或预防肥胖症和代谢性疾病的效果。

本文中，UCP1上调至少20％、至少50％、至少100％、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少45倍、至少5倍、至少5.5倍、至少6倍、至少6.5倍、至少7倍、至少7.5倍、至少8倍、至少85倍、至少9倍、至少95倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍。

本文所述组织和细胞可以是哺乳动物的任何组织和细胞，优选脂肪组织和细胞。脂肪组织和细胞包括褐色脂肪组织和细胞以及白色脂肪组织和细胞。所述细胞可以是体外成熟细胞系或动物的分离细胞或者体内细胞。示例性的脂肪细胞是获自小鼠的白色或褐色脂肪细胞。从活体获取白色或褐色脂肪细胞的方法本领域周知。褐色和白色脂肪细胞具有产热作用，可应对肥胖和代谢疾病。因此本文所述化合物或试剂可用于治疗或预防受益于脂肪产热的疾病、抑制对象体重增加或减少对象脂肪含量。本文中，受益于脂肪产热的疾病包括受益于褐色或白色脂肪产热的疾病，包括肥胖症和/或代谢性疾病。代谢性疾病是代谢障碍和/或代谢旺盛，包括2型糖尿病、糖尿病酮症酸中毒、脂肪肝、高尿酸血症、高渗综合征、低血糖症、痛风、蛋白质-能量营养不良症、维生素A缺乏病、坏血病、维生素D缺乏病、骨质疏松症、高血脂、代谢性脑病、肝性脑病、先天性代谢障碍。

因此，本发明提供下式(I)所示的化合物或其药学上接受的盐或溶剂合物在提高细胞的UCP1表达或活性中的用途、或在增强细胞产热中的用途、或在制备治疗或预防受益于脂肪产热的疾病、抑制对象体重增加或减少对象脂肪含量的试剂中的用途，

其中，R1-R10各自独立地选自氢、卤素、羟基和C1-C3烷基，R11是被一个或多个取代基取代的吡咯、吡咯啉、苯基，取代基选自氧、C1-C3烷基、C1-C3烷氧基、卤素、羟基。

在一个或多个实施方案中，所述化合物是下式(II)所示的化合物

其中，R1-R10各自独立地选自氢、卤素、羟基和C1-C3烷基。

在一个或多个实施方案中，R1-R4各自独立地选自氢、卤素、羟基和C1-C3烷基，R5-R10是氢；或者，R3-R6各自独立地选自氢、卤素、羟基和C1-C3烷基，R1-R2、R7-R10是氢；或者，R1-R4各自独立地选自F和Cl，R5-R10是氢；或者，R1-R2各自独立地选自F和Cl，R3-R10是氢；或者，R3-R4各自独立地选自F和Cl，R1-R2和R5-R10是氢；或者，R1-R10是氢。在R1-R10是氢的情况下，式(II)所示的化合物是格列苯脲。

在一个或多个实施方案中，所述化合物是下式(III)所示的化合物

其中，R1-R10各自独立地选自氢和C1-C3烷基。

在一个或多个实施方案中，R1-R10各自独立地选自氢和甲基。在R1-R3和R5-R10是氢，R4是甲基的情况下，式(III)所示的化合物是格列美脲。

本文所述卤素包括但不限于F、I、Br。式(I)化合物可以具有本领域常见的不影响该化合物提高UCP1蛋白表达活性的化学修饰。本发明还包括格列苯脲的类似物或衍生物，包括但不限于：格列美脲、格列喹酮、甲苯磺丁脲、格列齐特。

如本文所用，术语“烷基”单独或与其它术语组合使用，是指饱和脂肪族烷基，包括1-20个碳原子的直链或支链烷基。优选地，烷基是指含有1-10个碳原子的中等烷基，如甲基、乙基、丙基、2-异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基及类似烷基。更优选地，是指含有1-4个碳原子的低级烷基，例如甲基、乙基、丙基、2-异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基及类似烷基。烷基可以被取代也可不被取代。当被取代时，取代基个数为1个或多个，优选1-3个，更优选1个或2个，取代基团独立地选自包括卤素、羟基、低级烷氧基、芳基。

如本文所用，术语“芳”、“芳基”单独或与其它术语组合使用，是指含有6-14个碳原子的芳香环基团(例如六元单环、十元双环或十四元三环体系)，示例性的芳基包括苯基、萘基、联苯基、茚基及蒽基。本文所述“亚苯基”指具有两个取代基的苯基。芳基可选地被一个或多个取代基取代，取代基独立地选自卤素、烷基、三卤烷基、羟基、巯基、氰基、N-氨基、单或二烷基胺基、羧基或N-磺酰胺基。具体地，苯基或亚苯基可任选被1-4个独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基的基团取代。

如本文所用，术语“烷氧基”是指-O-(无取代烷基)和-O-(无取代环烷基)。代表性例子包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、环丙氧基、环丁氧基、环戊氧基、环己氧基以及类似结构。

如本文所用，术语“取代”，是指一个化合物具有取代基，该取代基至少包含一个带有一个或多个氢原子的碳原子、氮原子、氧原子或硫原子。如果一个取代基被描述为被“取代”，是指一个非氢取代基占据了一个碳、氮、氧、或硫上的一个氢的位置。举例来说，一个取代的烷基取代基是指其中至少有一个非氢取代基占据了烷基上一个氢的位置。进一步说明，单氟烷基是指被一个氟取代的烷基，二氟烷基是指被两个氟取代的烷基。

本发明公开的化合物或其药学上可接受的盐可以包括一个或多个非对称中心，因此会存在对映异构体、非对映异构体以及其它可以被定义的立体异构体形式，根据立体化学可分为(R)-或(S)-、用于氨基酸的(D)-或(L)-。本发明意为包括所有这些可能的异构体，以及外消旋形式和光学纯形式。光学活性的(+)和(-)、(R)-和(S)-或(D)-和(L)-异构体可以通过手性合成子或手性试剂制备，或用通常的技术如使用手性柱的高效液相来分离制备。当本发明所述的化合物含有烯族双键或其它几何不对称中心时，除非另有说明，则其意为该化合物包括E和Z几何异构体。同样地，所有的互变异构体也包括在内。

本文所述“药学上可接受的盐”包括酸式盐和碱式盐。

“药学上可接受的酸式盐”是指可保持游离碱的生物活性和性质的盐，该类盐不会出现不理想的生物活性或其它方面的变化。该类盐可由无机酸构成，例如但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸及类似的酸。该类盐还可由有机酸构成，例如但不限于乙酸、二氯乙酸、己二酸、褐藻酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰氨基苯甲酸、樟脑酸、樟脑磺酸、癸酸、己酸、辛酸、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环拉酸、十二烷基磺酸、1,2-乙二磺酸、乙烷磺酸、羟乙基磺酸、蚁酸、延胡索酸(fiimaric acid)、半乳糖二酸、龙胆酸、葡庚糖酸、葡萄糖酸、葡糖醛酸、谷氨酸、戊二酸、2-氧代戊二酸、甘油磷酸、羟基乙酸、马尿酸、异丁酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、顺丁烯二酸、苹果酸、丙二酸、苦杏仁酸、甲烷磺酸、粘酸、萘-1,5-二磺酸、2-萘磺酸、1-萘酚-2-甲酸、烟酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、双羟萘酸、丙酸、焦谷氨酸、丙酮酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、酒石酸、硫氰酸、对甲苯磺酸、三氟乙酸、十一烯酸及类似酸。

“药学上可接受的碱式盐”是指可保持游离酸的生物活性和性质的盐，该类盐不会出现不理想的生物活性或其它方面的变化。这些盐通过向游离酸中加入无机碱或有机碱制成。通过无机碱得到的盐包括但不限于钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、铁盐、锌盐、铜盐、锰盐、铝盐及类似盐。优选的无机盐为铵盐、钠盐、钾盐、钙盐以及镁盐。通过有机碱得到的盐包括但不限于一级、二级、三级铵盐，取代的胺包括天然取代的胺、环胺以及碱性离子交换树脂，例如氨气、异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、二乙醇胺、乙醇胺、丹醇、2-二甲氨基乙醇、2-二乙氨基乙醇、二环己胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、哈胺、胆碱、甜菜碱、苯乙苄胺、N,N'-双苄基乙撑二胺、乙二胺、葡萄糖胺、甲葡糖胺、可可碱、三乙醇胺、缓血酸胺、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、聚酰胺树脂以及类似结构。优选的有机碱为异丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二环己胺、胆碱和咖啡因。

通常结晶会产生所公开化合物的溶剂化产物。当在本文中使用时，术语“溶剂化物”是指一种包含了一种或多种本专利公开的化合物分子与一种或多种溶剂分子的聚合物。溶剂可能是水，此时溶剂化物可能是水合物。可选地，溶剂还可能是有机溶剂。因此，本专利公开的化合物可以作为水合物存在，包括单水合物、二水合物、半水合物、倍半水合物、三水合物、四水合物及类似结构，还可作为相应的溶剂化产物存在。本发明公开的化合物可以是真正的溶剂化物，而在其它情况下，本发明公开的化合物也可以是仅保有一部分水，或者是保有水与一些溶剂的混合物。

如上所述，发明人发现式(I)化合物可通过Ca2+-Calcineurin-NFAT信号通路上调UCP1，从而促进脂肪细胞产热。因此，本发明还提供上调钙离子通道相关蛋白或其亚基表达或活性的试剂或钙离子通道活化剂、上调钙调磷酸酶的表达或活性的试剂和/或上调NFAT的表达或活性的试剂在提高细胞的UCP1表达或活性中的用途、或在增强细胞产热中的用途、或在制备治疗或预防受益于脂肪产热的疾病、抑制对象体重增加或减少对象脂肪含量的试剂中的用途。

通常，上调多肽或蛋白表达的试剂是所述多肽或蛋白的表达载体。例如，可利用本领域常规的技术构建适于在宿主细胞(例如脂肪细胞)中表达钙离子通道相关蛋白或其亚基、钙调磷酸酶和/或NFAT的表达载体，并通过常规方法转入宿主细胞中，使得表达载体在宿主细胞中表达所述分子，从而实现其表达的上调。所述表达载体包含在宿主细胞中表达这些基因所需的其他组件，并且本领域技术人员知晓这些组件。在某些实施方案中，可调控这些分子的上游基因的表达，从而提高这类分子的表达。例如，在某些实施方案中，可给予对象细胞表达钙离子通道相关蛋白或其亚基、钙调磷酸酶和/或NFAT的病毒载体(如慢病毒载体)，从而提高基因在对象细胞中的表达水平。根据NCBI上公开的基因或氨基酸序列，本领域技术人员可以获得包含钙离子通道相关蛋白或其亚基、钙调磷酸酶和/或NFAT的编码序列的表达载体。过表达上述蛋白的细胞的UCP1表达上调、细胞产热增加。本领域技术人员知晓钙离子通道相关蛋白或其亚基、钙调磷酸酶和/或NFAT的编码序列。示例性地，NFAT包含NFAT1、NFAT2、NFAT3和NFAT4，其中，NFAT1如NCBI基因登录号18019所示；NFAT2如NCBI基因登录号18018所示；NFAT3如NCBI基因登录号73181所示；NFAT4如NCBI基因登录号18021所示。

通常，上调多肽或蛋白活性的试剂是所述多肽或蛋白的激动剂。本发明涉及的钙离子通道相关蛋白或其亚基、钙调磷酸酶和/或NFAT的激动剂本领域周知。此外，钙离子通道活化剂也可用于本发明方法，实现UCP1表达上调、细胞产热增加。钙离子通道活化剂包括但不限于：硝苯地平、氨氯地平、拉西地平。

本发明另一方面提供一种药物组合物，包含本文所述的化合物或试剂和药学上可接受的辅料和任选的其他治疗或预防受益于脂肪产热的疾病、抑制对象体重增加或减少对象脂肪含量的试剂。本文中，“药学上可接受的辅料”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体、稀释剂和/或赋形剂，包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，碳水化合物，佐剂，抗氧化剂，螯合剂，离子强度增强剂、防腐剂、载剂、助流剂、甜味剂、染料/着色剂、增味剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、稳定剂、等渗剂、溶剂或乳化剂。在一些实施方案中，药学上可接受的辅料可以包括一种或多种非活性成分，包括但不限于：稳定剂、防腐剂、添加剂、佐剂、喷雾剂、压缩空气或其它适宜的气体，或其它适宜的与药效化合物合用的非活性成分。更具体而言，合适的药学上可接受的辅料可以是本领域常用于小分子药物或核酸给药的辅料。

通常，药物组合物中含有治疗有效量的本文所述的化合物或试剂。治疗有效量是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解疾病或病症的剂量。可根据患者年龄、性别、所患病症及其严重程度、患者的其它身体状况等因素确定治疗有效量。治疗有效量可作为单一剂量施用，或者可依据有效的治疗方案在多个剂量中给药。本文中，受试者或患者通常指哺乳动物，尤其指人。

本发明的化合物或试剂可被单独施用或作为药物组合物施用。本发明的化合物或试剂可以以适于治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由各种因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度。组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过注射、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内注射或腹膜内施用给患者。

本文所述的化合物或试剂可以与其他用于治疗或预防受益于脂肪产热的疾病、抑制对象体重增加或减少对象脂肪含量的试剂联用。其他治疗或预防受益于脂肪产热的疾病、抑制对象体重增加或减少对象脂肪含量的试剂包括减少脂肪吸收的试剂和/或抑制食欲的试剂，例如，中枢抑制食欲药物、食欲调节激素、脂肪酶抑制剂、5-HT2C受体激动剂、Ghrelin拮抗剂、MCHR1拮抗剂、SGLT2抑制剂、减少脂肪合成的试剂、促进脂肪水解的试剂、脂代谢通路上的酶。本文中，其他治疗或预防受益于脂肪产热的疾病、抑制对象体重增加或减少对象脂肪含量的试剂可选自安非他酮、纳曲酮、唑尼沙胺、阿托西汀、美曲普汀、TM-30339、Exenatide、Liraglutide、Albiglutide、Cetilistat、Pramlintide、Alkoxyphenoxythiazoles。本领域技术人员可确定其他试剂的给药剂量。

本发明还包括体外提高哺乳动物组织或细胞的UCP1表达或活性、或增强哺乳动物组织或细胞产热的方法，其特征在于，包括选自以下的一个或多个步骤：(1)在式(I)所示的化合物或其药学上接受的盐或溶剂合物存在下培养所述组织或细胞，(2)上调所述组织或细胞的钙离子通道相关蛋白或其亚基表达或活性或在钙离子通道活化剂存在下培养所述组织或细胞，(3)上调所述组织或细胞的钙调磷酸酶的表达或活性，(4)上调所述组织或细胞的NFAT的表达或活性。实现这些步骤的化合物或试剂如上所述。

本发明还涉及治疗或预防受益于脂肪产热的疾病、抑制对象体重增加或减少对象脂肪含量的方法。该方法包括向有需要的受试对象施用治疗有效量的本文所述的化合物、试剂或药物组合物。本发明还涉及治疗或预防受益于脂肪产热的疾病、抑制对象体重增加或减少对象脂肪含量的试剂盒，该试剂盒包含本文所述的化合物、试剂或药物组合物。本发明还涉及本文所述的化合物、试剂或药物组合物在制备用于治疗或预防受益于脂肪产热的疾病、抑制对象体重增加或减少对象脂肪含量的试剂盒中的应用。具体而言，“有效量”指的是对人或者动物能够产生治疗功能的，并且能够被动物和人所接受的量。例如，在片剂的组合药物中，式(1)化合物的含量可以是10mg、20mg、50mg、100mg、200mg或以上。

本发明中药物的给药方式可以包括但是并不限制于皮下注射、经皮注射、植入、局部给药、肌肉注射、缓释给药和口服等。本领域技术人员知晓在不同给药方式、剂量、给药部位等情况下将药物给予对象所需的其他试剂。例如敷料、溶剂(如水)等。

本发明通过参考以下实验实施例进一步详细地进行描述。这些实施例仅出于说明性的目的提供，并不意欲为限制性的，除非另有规定。因此，本发明决不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为包括由于本文提供的教导变得显而易见的任何和全部的变化。实施例中所用的方法和试剂，除非另有说明，否则为本领域常规的方法和试剂。

本发明还提供一种筛选增强哺乳动物的组织或细胞(例如脂肪组织或细胞)产热的化合物的方法，包括步骤：(1)在所述化合物存在下孵育组织或细胞，(2)检测组织或细胞的UCP1表达或活性，其中，UCP1表达或活性上调表示所述化合物为增强所述组织或细胞产热的化合物。所述检测是检测组织或细胞中UCP1的mRNA或蛋白的含量或活性。检测UCP1的mRNA或蛋白的含量的方法包括但不限于Southern，RT-PCR、Western。检测UCP1的mRNA或蛋白的含量的活性的方法包括：冷刺激实验、海马实验等。本领域技术人员知晓进行上述方法所需的试剂。

实施例

实施例1、小鼠和细胞构建

构建Ucp1-GFP小鼠

实验步骤：通过CRISPR-Cas9基因编辑的方法得到Ucp1基因插入P2A-GFP的敲入小鼠。设计策略如下：在Ucp1基因C端插入GFP基因，构建Ucp1基因后插入P2A-EGFP的转基因小鼠(图1)，并对得到的转基因小鼠进行PCR鉴定(图2)。针对Ucp1的第6号外显子处设计单链向导RNA(sgRNA)位点，sgRNA序列如SEQ ID NO:1所示。以小鼠基因组为模板，使用引物Ucp1-5 arm-F(SEQ ID NO:2)，Ucp1-5 arm-R(SEQ ID NO:3)，PCR扩增出5’同源臂；使用引物Ucp1-3 arm-F(SEQ ID NO:4)，Ucp1-3 arm-R(SEQ ID NO:5)，PCR扩增出3’同源臂；同时使用引物2A-GFP-F(SEQ ID NO:6)，2A-GFP-R(SEQ ID NO:7)扩增出片段2A-GFP片段。通过酶切连接的方法获得P2A-GFP敲入的载体(模板质粒)。通过受精卵雄原核注射和移植，得到子代小鼠。通过鉴定(Ucp1-genotype-5 arm-F(SEQ ID NO:8)，Ucp1-genotype-5 arm-R(SEQ ID NO:9)；Ucp1-genotype-3 arm-F(SEQ ID NO:10)，Ucp1-genotype-3 arm-R(SEQID NO:11))得到Ucp1-GFP阳性小鼠。

实验结果：针对插入部分的PCR结果表明(图2)，我们构建的转基因小鼠的基因组成功扩增出条带，而野生型小鼠无条带，说明P2A-EGFP成功插入，转基因小鼠构建成功。

构建Ucp1-GFP脂肪细胞

实验步骤：以褐色脂肪细胞为例，从出生后2天的雄性小鼠中分离得到褐脂血管基质部分SVF(Stromal Vascular Fraction)，得到的组织用分离液(123mM氯化钠，5mM氯化钾，1.3mM氯化钙，5mM葡萄糖，50mM HEPES，4％BSA，1.5mg/mL胶原酶A，2mg/mL中性蛋白酶II)消化。消化后的组织细胞通过70μm滤塞过滤，得到的细胞培养在原代培养液中(含20％FBS的高糖DMEM)，并转染表达T抗原的逆转录病毒，经过G418筛选，得到单克隆，之后将单克隆细胞扩增培养分管保存在液氮中。以同样的方法，我们得到了Ucp1-GFP白色脂肪细胞株(图3)。

实施例2、体外验证

1)格列苯脲和格列美脲可以促进体外褐色脂肪细胞UCP1表达

实验步骤：用构建的Ucp1-GFP褐色脂肪细胞在体外分化过程中加入格列苯脲(10μM溶于DMSO)或格列美脲(10μM溶于DMSO)，以溶剂DMSO作为对照。在细胞分化7天后加入格列苯脲，加入1天后收集细胞。用Trizol(ThermoFisher)提取细胞的总RNA，并反转成cDNA，通过qPCR检测标志基因Ucp1及褐脂分化相关的基因的表达。同时用RIPA裂解液(Millipore)提取细胞的总蛋白，通过western blot检测UCP1蛋白的表达。上述qPCR的引物如下：(5’-3’)

Ucp1-F:GCATTCAGAGGCAAATCAGC(SEQ ID NO:12)；

Ucp1-R:GCCACACCTCCAGTCATTAAG(SEQ ID NO:13)；

Cidea-F:GAATAGCCAGAGTCACCTTCG(SEQ ID NO:14)；

Cidea-R:AGCAGATTCCTTAACACGGC(SEQ ID NO:15)；

Prdm16-F:CCGACTTTGGATGGGAGATG(SEQ ID NO:16)；

Prdm16-R:CACGGATGTACTTGAGCCAG(SEQ ID NO:17)；

Pgc1a-F:TCACGTTCAAGGTCACCCTA(SEQ ID NO:18)；

Pgc1a-R:TCTCTCTCTGTTTGGCCCTT(SEQ ID NO:19)；

Ppara-F:CATTTCCCTGTTTGTGGCTG(SEQ ID NO:20)；

Ppara-R:ATCTGGATGGTTGCTCTGC(SEQ ID NO:21)。

实验结果如图4和图5所示。图4显示，在褐色脂肪细胞体外分化过程中，格列苯脲处理可以显著上调标志基因Ucp1在mRNA和蛋白水平的表达，同时褐脂分化相关的其它基因(Cidea，Pgc1α，Pparα，Prdm16)也显著上调。图5显示褐色脂肪细胞体外分化过程中，格列美脲处理可以显著上调标志基因Ucp1在mRNA和蛋白水平的表达。

2)格列苯脲可以促进体外白色脂肪细胞UCP1表达

实验步骤：用构建的Ucp1-GFP白色脂肪细胞在体外分化过程中加入格列苯脲(10μM溶于DMSO)，以溶剂DMSO作为对照。在细胞分化6天后加入格列苯脲，加入4天后收集细胞。提取RNA，并反转成cDNA，通过qPCR检测标志基因Ucp1及褐脂分化相关的基因的表达。同时提取蛋白，通过westernblot检测UCP1蛋白的表达。

实验结果如图6所示。图6显示，在白色脂肪细胞体外分化过程中，格列苯脲处理可以显著上调标志基因Ucp1在mRNA和蛋白水平的表达，同时褐脂分化相关的其它基因(Cidea,Pgc1α)也显著上调。

实施例3、体内验证

1)格列苯脲可以抑制高脂喂养条件下小鼠体重的增加

实验步骤：高脂(Research Diets，60kcal％脂肪)饮食条件下，每天2mg/kg格列苯脲通过灌胃给药8周龄的C57BL/6J雄鼠(斯莱克)，对照组每天给以等体积的溶剂(4.5wt％DMSO，1wt％吐温，水)。每周统计进食量和体重。每组12只小鼠。

实验结果如图7所示。图7显示，高脂饮食条件下，与对照组相比，格列苯脲处理的小鼠体重明显下降。喂药1周后，小鼠体重下降有显著性差异，而且随着时间的增加体重差异越来越大(左图)。与对照小鼠相比，给药11周后，格列苯脲处理的小鼠体重下降了9％(左图和中间的图)。而两组小鼠之间的进食量并没有差异(右图)。

2)格列苯脲处理的高脂饮食小鼠体重的减少是由于脂肪含量的减少

实验步骤：高脂饮食下，每天2mg/kg格列苯脲通过灌胃给药给小鼠，8周后用核磁共振仪器NMR(Echo MRI)检测小鼠的体脂和肌肉含量。每组12只小鼠。

实验结果如图8所示。图8显示，高脂饮食条件下，与对照组相比，格列苯脲处理的小鼠体脂含量减少了29.52％，而肌肉含量没有显著差异。说明给药小鼠体重的减少是由于脂肪含量的减少。

3)高脂饮食下格列苯脲处理的小鼠血液中甘油三酯含量显著减少

实验步骤：高脂饮食下，每天2mg/kg格列苯脲通过灌胃给药给小鼠，11周后，将小鼠饥饿4小时，通过小鼠的尾静脉取血，血样放冰上，4℃、3000rpm离心15min，取上清。分别用甘油三酯和胆固醇检测试剂盒(上海申索佑福公司)检测小鼠血液的甘油三酯和胆固醇含量。每组12只小鼠。

实验结果如图9所示。图9显示，高脂饮食条件下，与对照组相比，格列苯脲处理的小鼠血液中的甘油三酯含量下降了35.92％(左图)，但血液中的胆固醇含量没有明显变化(右图)。

4)高脂饮食下格列苯脲处理的小鼠基础代谢增加

实验步骤：高脂饮食下，每天2mg/kg格列苯脲通过灌胃给药给小鼠，11周后，通过代谢笼(Columbus Instruments)检测小鼠的耗氧量，二氧化碳呼出量及运动量。每组8只小鼠。

实验结果如图10所示。图10显示，高脂饮食条件下，与对照组相比，格列苯脲处理的小鼠的耗氧量和二氧化碳呼出量均显著增加(左上、左下)，且白天和晚上的耗氧量和二氧化碳呼出量均显著增加(右上一、右上二)。而小鼠的活动量没有差异(右下)。

5)高脂饮食下格列苯脲处理的小鼠脂肪组织中脂滴积累减少，褐色脂肪UCP1表达增加

实验步骤：高脂饮食下，每天2mg/kg格列苯脲通过灌胃给药给小鼠，11周后，分别取小鼠的褐色脂肪组织、皮下白色脂肪组织和附睾白色脂肪组织并称重。同时将新鲜的三种脂肪组织用4％PFA(多聚甲醛，国药集团化学试剂有限公司)固定过夜，做苏木精-伊红染色。并提取小鼠褐色脂肪组织的蛋白，通过western blot检测UCP1蛋白的表达。

实验结果如图11和12所示。图11显示，高脂饮食下，与对照组相比，格列苯脲处理的小鼠的三种脂肪组织重量均显著减少(左上、左下)，三种脂肪组织细胞大小均明显变小(右图)。图12显示，高脂饮食下，与对照组相比，格列苯脲处理的小鼠褐色脂肪组织UCP1蛋白表达显著上调。

6)通过原位注射给药，格列苯脲促进小鼠皮下白色脂肪UCP1表达

实验步骤：通过原位注射给药，将格列苯脲(1mg/kg)在7～8周龄雄性小鼠皮下腹股沟脂肪处注射给药。每只小鼠双侧腹股沟处分别注射一次，每次50μL，以溶剂和1mg/kgCL-316243(Tocris)分别设为阴性对照和阳性对照。小鼠在常规(大小鼠繁殖饲料，斯莱康)饮食条件下饲养。4天后进行冷耐受性实验，并取皮下白色脂肪组织，将新鲜的脂肪组织同时做苏木精-伊红(HE)染色和UCP1染色。同时提取组织蛋白，检测UCP1和氧化磷酸化相关蛋白表达。

实验结果如图13和14所示。图13显示，与阴性对照组相比，格列苯脲处理组小鼠褐色脂肪组织UCP1蛋白表达显著上调，与阳性对照CL-316243处理组类似(左图)。苏木精-伊红(HE)染色也显示格列苯脲处理组小鼠的细胞大小明显变小，单个细胞内出现多个脂滴，UCP1染色增加(右图)。图14显示，与阴性对照组相比，格列苯脲处理的小鼠对冷(4℃)的耐受性更好(右图)，小鼠氧化磷酸化相关蛋白明显增加(左图)。

实施例4、格列苯脲作用机制

1)格列苯脲上调脂肪细胞中脂质代谢相关基因，促进脂肪细胞褐色化

实验步骤：为了知道格列苯脲在褐色脂肪和白色脂肪细胞中上调UCP1的作用机制，我们首先对格列苯脲或DMSO处理的褐色脂肪和白色脂肪细胞进行RNAseq测序分析。其中褐色脂肪细胞在细胞分化7天后加10μM格列苯脲或DMSO处理，加入1天后收细胞；白色脂肪细胞在细胞分化6天后加10μM格列苯脲或DMSO处理，加入4天后收细胞。然后提取细胞的总RNA，再将提取的RNA做RNAseq测序分析(上海美吉医药科技有限公司)。对在格列苯脲处理的褐色脂肪细胞或白色脂肪细胞中富集的基因做GO分析。

实验结果如图15所示。图15显示，在褐色脂肪细胞中，与对照(DMSO)相比，格列苯脲上调的基因显著富集在脂质代谢相关通路、非颤抖性产热、类固醇代谢、脂肪细胞分化及氧化还原反应(左上)。在白色脂肪细胞中，与对照(DMSO)相比，格列苯脲上调的基因显著富集在脂质代谢相关通路、脂肪酸分解代谢、褐色脂肪细胞分化、胰岛素反应及氧化还原反应(右上)。在褐色脂肪细胞中被格列苯脲上调的基因有605个，在白色脂肪细胞中被格列苯脲上调的基因有504个(左下)，而在这两种细胞中被共同上调的基因有100个，且这些共同调控的基因部分富集在脂代谢调控通路(右下)。这些结果提示格列苯脲上调脂肪细胞中脂质代谢相关基因，促进脂肪细胞褐色化。

2)格列苯脲上调pATF2，同时下调pSTAT3和pERK

实验步骤：为了知道格列苯脲在褐色脂肪细胞中具体通过哪些信号通路进行调控，我们接着通过western blot对格列苯脲或DMSO处理的褐色脂肪细胞的蛋白进行分析。其中褐色脂肪细胞在细胞分化7天后加10μM格列苯脲或DMSO处理，加入1天后收集细胞。提取细胞总的蛋白，检测相应信号蛋白的表达。

实验结果如图16所示。图16显示，与溶剂(DMSO)相比，格列苯脲明显上调褐色脂肪细胞中pATF2，同时下调pSTAT3和pERK。提示格列苯脲可能通过激活ATF2并抑制STAT3和ERK信号通路调控UCP1表达。

3)格列苯脲上调UCP1不依赖ATP敏感的钾离子通道(K_ATP)

实验步骤：为检测格列苯脲上调UCP1的靶点是否为ATP敏感的钾离子通道(K_ATP)，我们首先在褐色脂肪细胞中将K_ATP通道的Kir亚基和SUR亚基进行敲除。我们针对Kir6.1、Kir6.2、Sur1和Sur2基因设计了sgRNA并筛选到高活性的sgRNA：

Kir6.1：CGAAGAGCAGCCAGCTGCAG(SEQ ID NO:22)；

Kir6.2：GAAGATGCAGCCCAGCATGA(SEQ ID NO:23)；

Sur1：CAGGACAAAGAGCAGCATGA(SEQ ID NO:24)；

Sur2：CAAACGTCAGAATCCATCTC(SEQ ID NO:25)。

然后通过慢病毒载体将Kir6.1-sgRNA和Kir6.2-sgRNA同时导入褐色脂肪细胞，以及将Sur1-sgRNA和Sur2-sgRNA同时导入褐色脂肪前体细胞，利用CRISPR-Cas9技术在褐色脂肪前体细胞中分别敲除Kir(同时敲除Kir6.1和Kir6.2)和Sur(同时敲除Sur1和Sur2)。然后将敲除的细胞按标准的分化流程进行分化，细胞分化8天后检测Ucp1的表达。同时检测敲除Kir或Sur的细胞在格列苯脲(细胞分化7天后加入，处理1天)刺激下的Ucp1的表达。

实验结果如图17和18所示。图17显示，针对Kir6.1的2号外显子、Kir6.2的1号外显子、Sur1的2号外显子和Sur2的4号外显子设计sgRNA(左上一、左上二、左下一、左下二)，并分别检测各sgRNA在褐色脂肪细胞中的活性。结果显示这4条sgRNA都有较高切割活性(右上一、右上二、右下一、右下二)。图18显示，在褐色脂肪细胞中分别敲除Kir和Sur，Ucp1在mRNA和蛋白的表达没有差异，且在Kir和Sur敲除的细胞中加格列苯脲处理，Ucp1在mRNA和蛋白水平的表达也没有差异。提示格列苯脲上调UCP1可能不依赖ATP敏感的钾离子通道(K_ATP)。

4)格列苯脲上调UCP1不依赖Epac2，也不依赖Cav1

实验步骤：为进一步验证格列苯脲上调UCP1是否通过K_ATP或Epac2，我们选了以下的4个化合物进行验证：

我们首先在褐色脂肪细胞分化过程中分别加这4个化合物(细胞分化7天后加入，作用浓度为10μM)处理1天，检测Ucp1的表达。同时在白色脂肪细胞分化过程中也分别加这4个化合物(细胞分化6天后加入，作用浓度为10μM)处理4天，检测Ucp1的表达。并同时在褐色脂肪细胞中敲除Epac2，我们针对Epac2基因设计了sgRNA并筛选到高活性的sgRNA，然后通过慢病毒载体将Epac2-sgRNA导入褐色脂肪前体细胞，利用CRISPR-Cas9技术在褐色脂肪前体细胞中敲除Epac2。然后将敲除的细胞按标准的分化流程进行分化，细胞分化8天后检测Ucp1的表达。同时检测敲除Epac2的细胞在格列苯脲(细胞分化7天后加入，处理1天)刺激下的Ucp1的表达。此外，为检验格列苯脲上调UCP1是否通过Cav1，我们在褐色脂肪细胞中敲除Cav1。我们针对Cav1基因设计了sgRNA并筛选到高活性的sgRNA：

Epac2：

Cav1：

然后通过慢病毒载体将Cav1-sgRNA导入褐色脂肪前体细胞，利用CRISPR-Cas9技术在褐色脂肪前体细胞中敲除Cavl。然后将敲除的细胞按标准的分化流程进行分化，细胞分化8天后检测Ucp1的表达。同时检测敲除Cav1的细胞在格列苯脲(细胞分化7天后加入，处理1天)刺激下的Ucp1的表达。

实验结果如图19、20、21和22所示。图19显示，只有格列苯脲可以显著促进褐色脂肪细胞Ucp1在mRNA和蛋白水平的表达。图20显示，只有格列苯脲可以促进白色脂肪细胞UCP1蛋白的表达。图21显示，针对Epac2的2号外显子和Cav1的2号外显子设计sgRNA(左一、右二)，并分别检测各sgRNA在褐色脂肪细胞中的活性。结果显示这2条sgRNA均有切割活性(左二、右一)。图22显示，在褐色脂肪细胞中敲除Epac2，Ucp1在mRNA和蛋白水平的表达没有差异，且在Epac2敲除的细胞中加格列苯脲处理，Ucp1在mRNA和蛋白水平的表达也没有差异。在褐色脂肪细胞中敲除Cav1，UCP1蛋白的表达没有差异，且在Cav1敲除的细胞中加格列苯脲处理，UCP1蛋白的表达也没有差异。以上结果表明，格列苯脲上调UCP1不依赖Epac2，也不依赖Cav1。

5)抑制Ca²⁺进入可抑制格列苯脲上调UCP1

实验步骤：为了检测格列苯脲上调UCP1是否由细胞内Ca²⁺水平调控，我们首先在体外分化的褐色脂肪细胞中分别用钙离子通道抑制剂尼群地平(Nitrendipine)和ATP敏感的钾离子通道激活剂二氮嗪(Diazoxide)进行验证。在褐色脂肪细胞分化7天后，在格列苯脲刺激下加尼群地平(30μM)或二氮嗪(10μM)处理，1天后检测Ucp1的表达。

实验结果如图23所示。图23显示，在褐色脂肪细胞中，只有钙离子通道抑制剂尼群地平可以显著抑制格列苯脲引起的UCP1上调。提示抑制Ca²⁺进入可抑制格列苯脲上调UCP1。

6)格列苯脲上调UCP1不依赖Trpv2

实验步骤：为检测格列苯脲上调UCP1的靶点是否为TRPV2(一种非选择性阳离子通道)，我们首先在褐色脂肪细胞中将Trpv2进行敲除。我们针对Trpv2基因设计了sgRNA并筛选到高活性的sgRNA，然后通过慢病毒载体将Trpv2-sgRNA(5’-CCCCATGGAGTCTCCCTTCC-3’，SEQ ID NO:28)导入褐色脂肪前体细胞，利用CRISPR-Cas9技术在褐色脂肪前体细胞中敲除Trpv2。然后将敲除的细胞按标准的分化流程进行分化，细胞分化8天后检测Ucp1的表达。同时检测敲除Trpv2的细胞在格列苯脲(细胞分化7天后加入10μM格列苯脲，处理1天)刺激下的Ucp1的表达。

实验结果如图24所示。图24显示，在褐色脂肪细胞中敲除Trpv2，UCP1蛋白的表达没有差异，且在Trpv2敲除的细胞中加格列苯脲处理，UCP1蛋白的表达也没有差异(左一)。针对Trpv2的3号外显子设计sgRNA(左二)，并检测sgRNA在褐色脂肪的活性。结果显示Trpv2-sgRNA有切割活性(右一)。这些结果表明格列苯脲上调UCP1不依赖Trpv2。

7)格列苯脲上调UCP1通过Ca²⁺-Calcineurin-NFAT信号通路

实验步骤：为了检测格列苯脲是否可能通过Ca²⁺-Calcineurin-NFAT信号通路调控UCP1表达。我们分别选用了钙调磷酸酶(Calcineurin)的抑制剂-环孢菌素A(CsA，Cyclosporine A)和NFAT的抑制剂VIVIT(MCE)进行了验证。VIVIT是一种NFAT的细胞渗透性肽抑制剂，可选择性抑制钙调磷酸酶介导的NFAT去磷酸化作用。我们首先在褐色脂肪细胞分化7天后，在格列苯脲刺激下加环孢菌素A或VIVIT(10μM)处理，1天后检测Ucp1的表达。同时在白色脂肪细胞分化6天后，在格列苯脲或罗格列酮刺激下加环孢菌素A(10μM)处理，4天后检测Ucp1的表达。

实验结果如图25和26所示。图26显示，在褐色脂肪细胞中，尼群地平和环孢菌素A均可以显著抑制格列苯脲引起的Ucp1在mRNA和蛋白水平上的上调(左一、左二)，且VIVIT也显著抑制格列苯脲引起的Ucp1在mRNA水平上的上调(右一)。说明在褐色脂肪细胞中，抑制Ca²⁺-Calcineurin-NFAT信号通路可以抑制格列苯脲引起的UCP1上调。图27显示，在白色脂肪细胞中，尼群地平和环孢菌素A均可以显著抑制格列苯脲或罗格列酮引起的UCP1蛋白的上调。

综上，我们的研究表明在褐色脂肪和白色脂肪细胞中，通过不同抑制剂抑制Ca²⁺-Calcineurin-NFAT信号通路可以阻止格列苯脲上调UCP1，提示格列苯脲可能通过Ca²⁺-Calcineurin-NFAT信号通路调控UCP1的表达(图27)。

序列表

<110> 中国科学院上海营养与健康研究所

<120> 增强细胞产热和治疗疾病的应用

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