一种诺卡氏菌免疫增强剂在鱼用疫苗中的应用
阅读说明：本技术 一种诺卡氏菌免疫增强剂在鱼用疫苗中的应用 (Application of nocardia immunopotentiator in fish vaccine ) 是由 张毓金 王文勇 严悌昆 黄淑芬 于 2021-08-20 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种诺卡氏菌免疫增强剂在鱼用疫苗中的应用,本发明一种诺卡氏菌免疫增强剂包括诺卡氏菌、茯苓多糖和透明质酸,并且提供了一种该诺卡氏菌免疫增强剂在鱼用油乳剂灭活疫苗中的应用,该鱼用油乳剂灭活疫苗可以根据选择的抗原不同,从而可以获得针对不同病毒或细菌性疫苗；动物实验验证表明,本发明提供的由诺卡氏菌免疫增强剂及其在鱼用疫苗中的应用,使得鱼用疫苗免疫性强,并且添加诺卡氏菌佐剂的油乳剂疫苗具备高度安全性,疫苗注射局部无明显残留,制备过程简单,适用范围广,相对应的疫苗特异性强。(The invention provides an application of a Nocardia immunopotentiator in a fish vaccine, the Nocardia immunopotentiator comprises Nocardia, pachymaran and hyaluronic acid, and the application of the Nocardia immunopotentiator in a fish oil emulsion inactivated vaccine, and the fish oil emulsion inactivated vaccine can be different according to selected antigens, so that different viruses or bacterial vaccines can be obtained; animal experiment verification shows that the nocardia immunopotentiator and the application thereof in the fish vaccine provided by the invention enable the fish vaccine to have strong immunity, and the oil emulsion vaccine added with the nocardia adjuvant has high safety, no obvious residue at the vaccine injection part, simple preparation process, wide application range and strong corresponding vaccine specificity.)
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，具体涉及一种诺卡氏菌免疫增强剂在鱼用疫苗中的应用。
背景技术
免疫增强剂是指单独或同时与抗原使用均能增强机体免疫应答的物质，目前佐剂的品种较多，按其作用的先决条件可分为三类：⑴免疫替代剂，用来代替某些具有免疫增强作用的生物因子的药物；⑵免疫恢复剂，能增强被抑制的免疫功能，但对正常免疫功能作用不大；⑶免疫佐剂，又称非特异性刺激剂。常用的免疫增强剂有卡介苗、短小棒状杆菌、内毒素、免疫核糖核酸、胸腺肽、转移因子、双链聚核苷酸、氢氧化铝铝胶佐剂等。
上述佐剂中，有的虽然已经研究应用于人类如胸腺素，但价格较为昂贵，不可能用于动物。目前动物疫苗所用佐剂如氢氧化铝铝胶佐剂，通过延长疫苗在注射部位的停留时间发挥佐剂效应，还没有直接通过增强动物机体自身的免疫应答能力的佐剂来提高免疫效果，致使动物免疫效果较差，影响了畜禽养殖业的快速健康发展。因此，研发新型的免疫增强剂，改善动物免疫效果，成为畜禽养殖业亟待解决的问题之一。
诺卡氏菌是具有较强免疫活性的微生物，其主要结构中的诺卡式霉菌酸，可非特异性刺激细胞免疫功能，并且促进多种细胞因子分泌，其添加到鱼用油乳剂灭活疫苗中可以明显促进疫苗诱导动物抗体的产生，并且明显改善猪只养殖过程。
中国专利申请CN108815198A公开了一种红色诺卡氏菌细胞壁骨架作为巨噬细胞增殖促进剂的用途，所述红色诺卡氏菌为Nr-8206，在体外可以用于促进巨噬细胞增殖、促进巨噬细胞表面功能分子MHC-II、CD86、CD80或TLR4的表达、促进巨噬细胞胞内活性氧的产生、促进巨噬细胞TNF-α、IL-6、IL-12p40、IL-1β或IFN-β的表达、抑制巨噬细胞IL-10的表达、以及促进巨噬细胞杀伤卵巢癌细胞。但是，这种促进作用是针对特定的巨噬细胞，适用范围窄，且可选择的菌种范围也窄，且对动物的免疫效果无明显促进作用。
综上可知，现有技术中的免疫增强剂普遍存在免疫效果差，适用范围窄，促进作用不明显等缺点。
发明内容
本发明旨在提供一种诺卡氏菌免疫增强剂在鱼用疫苗中的应用，将本发明提供的诺卡氏菌免疫增强剂应用在鱼用油乳剂灭活疫苗中，通过选择的抗原不同，制成的疫苗也不同。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明的第一目的是提供一种诺卡氏菌免疫增强剂，所述免疫增强剂由以下组分组成：诺卡氏菌、茯苓多糖和透明质酸。
优选的，所述复合免疫佐剂由以下重量百分含量的组分组成：25～35％诺卡氏菌、15～34％茯苓多糖和35～60％透明质酸。
本发明的第二目的是提供一种诺卡氏菌免疫增强剂的制备方法，包括如下步骤：
1)、将诺卡氏菌置于30L的发酵罐中培养45～55小时，高温高压灭活，获得诺卡氏菌灭活菌体；
2)、按重量百分含量配比称取各原料；
3)、将诺卡氏菌灭活菌体、茯苓多糖和透明质酸依次溶解于生理盐水，诺卡氏菌灭活菌体的浓度为100～115μg/mL，茯苓多糖的浓度为34～65mg/mL，透明质酸的浓度为3～7mg/mL，即得。
优选的，所述步骤1)发酵罐中培养基的配方为葡萄糖1～4％、酵母粉1～3％、胰蛋白胨2～5％、纯化水90～96％，pH7.0～7.2；所述发酵罐中的培养条件为：搅拌转速305～315r/min，通气量1:10、接种量5～10％、装液量为罐容积的65％、温度30℃；所述高温高压灭活的具体操作为120～123℃，101kPa，处理18～22min。
优选的，所述茯苓多糖的提取步骤包括：将煎煮后的茯苓在50～80℃干燥，干燥后通过200～300目的筛网进行超微粉碎得到茯苓破壁粉，破壁粉与水以质量比1：(2～6)混合进行研磨，制成茯苓乳浊液；往所述茯苓乳浊液加入β-葡聚糖水解酶进行水解得到酶解液，所述酶解液浓度为0.5～1.8％，酶解温度为45～55℃，酶解时间2.5～3.5h，酶解液pH值为4～6.5；将酶解液去活，并进行固液分离，收集滤液在60～80℃进行浓缩至滤液体积为15～18％，喷雾干燥，即得。
本发明的又一个目的是提供一种所述的免疫佐剂在鱼用油乳剂灭活疫苗中的应用。
本发明最后一个目的是提供一种所述的鱼用油乳剂灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：
S1、将诺卡氏菌佐剂进行定量，同时测定其类脂化合物、阿拉伯半乳糖及粘肽的含量，得定量的诺卡氏菌佐剂；
S2将步骤S1所得定量的诺卡氏菌佐剂按乳化配方添加至混合抗原水相中，搅拌均匀并进行常规乳化，得初始的鱼用油乳剂灭活疫苗；
S3、将步骤S2所得初始的鱼用油乳剂灭活疫苗经物理性状检测，安全性检测、效力试验检测及商品动物免疫检测，验证合格后，即得。
优选的，所述步骤S1中诺卡氏菌佐剂的定量过程为：无菌移取2mL佐剂样本平分到2支1.5mL eppendorf管中，12000rpm/min高速离心5min，弃除上清液后，置于103℃干燥箱中充分干燥2小时，测定样本干物质重量；所述步骤S1中测得类脂化合物含量为15～20％、多糖含量40～55％，粘肽含量为32～42％。
优选的，所述步骤S2的具体操作为：取适当量诺卡氏菌佐剂3mg添加入100mL抗原液中，加入5ml的TWEEN-80后混匀，制备成抗原水相；按照抗原水相：油相＝1:2比例，使用IKA T25乳化机，12000rpm高速乳化5min。
优选的，所述步骤S2中的抗原包括传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)抗原、石斑鱼虹彩病毒(GIV)抗原、大黄鱼虹彩病毒(LYCIV)抗原、大菱鲆红体病虹彩病毒(TRBIV)抗原、神经坏死病(Viral nervous necrosis，VNN)、鳜蛙病毒、黄鳍鲷腹水病病毒、鳜鱼弹状病毒、石斑鱼虹彩病毒、真鲷虹彩病毒、流行性造血器官坏死病毒、鲤疱疹病毒、锦鲤疱疹病毒、鲤春病毒血症病毒。
优选的，所述步骤S3中商品动物免疫检测是采用市购的商品鱼进行动物实验，模拟临床进行疫苗效果评估
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明创造性的将诺卡氏菌作为一种免疫佐剂用于鱼用油乳剂灭活疫苗的制备过程，并根据选择的抗原不同，从而使获得针对不同病毒或细菌性疫苗。
动物实验验证表明，本发明提供的由免疫佐剂制成的疫苗免疫性强，并且添加诺卡氏菌佐剂的油乳剂疫苗具备高度安全性，疫苗注射局部无明显残留。
本发明提供的一种免疫佐剂及其制备方法和应用，制备过程简单，适用范围广，相对应的疫苗特异性强。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。
实施例1一种免疫佐剂的制备过程
一种诺卡氏菌免疫增强剂，所述免疫增强剂由以下组分组成：28％诺卡氏菌、30％茯苓多糖和42％透明质酸。
诺卡氏菌免疫增强剂的制备方法，包括如下步骤：
1)、将诺卡氏菌置于30L的发酵罐中培养48小时，高温高压灭活，获得诺卡氏菌灭活菌体；所述步骤1)发酵罐中培养基的配方为葡萄糖2％、酵母粉2％、胰蛋白胨3％、纯化水95％，pH7.0；所述发酵罐中的培养条件为：搅拌转速310r/min，通气量1:10、接种量8％、装液量为罐容积的65％、温度30℃；所述高温高压灭活的具体操作为120℃，101kPa，处理22min。
2)、按重量百分含量配比称取各原料；
3)、将诺卡氏菌灭活菌体、茯苓多糖和透明质酸依次溶解于生理盐水，诺卡氏菌灭活菌体的浓度为110μg/mL，茯苓多糖的浓度为50mg/mL，透明质酸的浓度为4mg/mL，即得；
所述茯苓多糖的提取步骤包括：将煎煮后的茯苓在60℃干燥，干燥后通过200目的筛网进行超微粉碎得到茯苓破壁粉，破壁粉与水以质量比1：4混合进行研磨，制成茯苓乳浊液；往所述茯苓乳浊液加入β-葡聚糖水解酶进行水解得到酶解液，所述酶解液浓度为1.8％，酶解温度为50℃，酶解时间3h，酶解液pH值为4；将酶解液去活，并进行固液分离，收集滤液在60℃进行浓缩至滤液体积为18％，喷雾干燥，即得。
实施例2一种免疫佐剂的制备过程
一种诺卡氏菌免疫增强剂，所述免疫增强剂由以下组分组成：30％诺卡氏菌、25％茯苓多糖和45％透明质酸。
诺卡氏菌免疫增强剂的制备方法，包括如下步骤：
1)、将诺卡氏菌置于30L的发酵罐中培养50小时，高温高压灭活，获得诺卡氏菌灭活菌体；所述步骤1)发酵罐中培养基的配方为葡萄糖3％、酵母粉1％、胰蛋白胨5％、纯化水96％，pH7.1；所述发酵罐中的培养条件为：搅拌转速310r/min，通气量1:10、接种量7％、装液量为罐容积的65％、温度30℃；所述高温高压灭活的具体操作为122℃，101kPa，处理20min。
2)、按重量百分含量配比称取各原料；
3)、将诺卡氏菌灭活菌体、茯苓多糖和透明质酸依次溶解于生理盐水，诺卡氏菌灭活菌体的浓度为110μg/mL，茯苓多糖的浓度为50mg/mL，透明质酸的浓度为4mg/mL，即得；
所述茯苓多糖的提取步骤包括：将煎煮后的茯苓在70℃干燥，干燥后通过250目的筛网进行超微粉碎得到茯苓破壁粉，破壁粉与水以质量比1：5混合进行研磨，制成茯苓乳浊液；往所述茯苓乳浊液加入β-葡聚糖水解酶进行水解得到酶解液，所述酶解液浓度为1％，酶解温度为55℃，酶解时间2.8h，酶解液pH值为5；将酶解液去活，并进行固液分离，收集滤液在65℃进行浓缩至滤液体积为17％，喷雾干燥，即得。
实施例3一种免疫佐剂的制备过程
一种诺卡氏菌免疫增强剂，所述免疫增强剂由以下组分组成：28％诺卡氏菌、17％茯苓多糖和55％透明质酸。
诺卡氏菌免疫增强剂的制备方法，包括如下步骤：
1)、将诺卡氏菌置于30L的发酵罐中培养46小时，高温高压灭活，获得诺卡氏菌灭活菌体；所述步骤1)发酵罐中培养基的配方为葡萄糖4％、酵母粉2％、胰蛋白胨3％、纯化水93％，pH7.2；所述发酵罐中的培养条件为：搅拌转速315r/min，通气量1:10、接种量8％、装液量为罐容积的65％、温度30℃；所述高温高压灭活的具体操作为121℃，101kPa，处理20min。
2)、按重量百分含量配比称取各原料；
3)、将诺卡氏菌灭活菌体、茯苓多糖和透明质酸依次溶解于生理盐水，诺卡氏菌灭活菌体的浓度为110μg/mL，茯苓多糖的浓度为50mg/mL，透明质酸的浓度为4mg/mL，即得；
所述茯苓多糖的提取步骤包括：将煎煮后的茯苓在60℃干燥，干燥后通过280目的筛网进行超微粉碎得到茯苓破壁粉，破壁粉与水以质量比1：3混合进行研磨，制成茯苓乳浊液；往所述茯苓乳浊液加入β-葡聚糖水解酶进行水解得到酶解液，所述酶解液浓度为1.2％，酶解温度为48℃，酶解时间3.5h，酶解液pH值为6；将酶解液去活，并进行固液分离，收集滤液在75℃进行浓缩至滤液体积为16％，喷雾干燥，即得。
对比例1
与实施例1相比，本实施例免疫增强剂不含诺卡氏菌，其他同实施例1。
对比例2
与实施例1相比，本实施例免疫增强剂不含茯苓多糖，其他同实施例1。
对比例3
与实施例1相比，本实施例免疫增强剂不含茯苓多糖和透明质酸，其他同实施例1。
实验一鱼用油乳剂疫苗的制备
Ⅰ.诺卡氏菌佐剂样本灭菌处理及定量
取实施例1～3和对比例1～3诺卡氏菌免疫增强剂液体样本若干，采用121℃高压蒸汽灭活30min，灭菌后样本待温度降至室温时，4℃保存备用。
所述免疫增强剂样本定量方法如下：无菌移取2mL佐剂样本平分到2支1.5mLeppendorf管中，12000rpm/min高速离心5min，弃除上清液后，置于103℃干燥箱中充分干燥2小时，测定样本干物质重量。
测得类脂化合物含量为17.3％、多糖含量47.2％，粘肽含量为35.5％，免疫增强剂样品合格。
Ⅱ.添加诺卡氏菌佐剂的油乳剂灭活疫苗的制备
将实施例1～3及对比例1～3实验组免疫增强剂分为实验组ABCDEF组，同时，未添加诺卡氏菌免疫增强剂的为对照组。
⑴鳜蛙病毒病病灭活疫苗的制备
①抗原水相的制备
先制备不加佐剂的对照组抗原水相，然后再制备含佐剂的实验组抗原水相。
鳜蛙病毒病灭活疫苗对照组：未添加诺卡氏菌免疫增强剂的，对照组与试验组的差异仅为是否添加佐剂，其他均相同处理。
实验组与对照组鳜蛙病毒病灭活疫苗的制备：取经过定量的诺卡氏菌佐剂样本5mg，添加入鳜蛙病毒抗原中，按照乳化配方量添加TWEEN-80，充分混合溶解后，最终总体积为100mL。
②乳化制备疫苗
制备疫苗时应先制备不加佐剂的对照组疫苗，然后再制备含佐剂的实验组疫苗。
取上述制备的抗原水相100mL，缓慢加入200mL按照乳化配方制备的油相中，使用IKA T25乳化机乳化，要求乳化机在抗原加入过程中保持5000rpm/min低速搅拌，待抗原完全加入到油相后，调节乳化机转速为15000rpm/min高速剪切乳化3min。乳化后制备的疫苗分装后，置于4℃保持备用。
实验二鱼用油乳剂疫苗性能检测
(1)油乳剂灭活疫苗物理性状检测
取上述制备并分装的疫苗，回温到室温后，分别检测以下物理性状：
A.每组疫苗取10mL样本用旋转粘度计检测疫苗粘度；
B.将疫苗缓慢滴加到静置水面上，观察疫苗扩散情况；
C.每组取30mL疫苗，分别分装入3支10mL离心管，3000rpm/min离心20min，观察有无分层破乳现象。如有破乳分层，说明疫苗制备不成功，需重新制备；
D.上述经过离心的疫苗，标记后分别置于37℃，室温，4℃保存1个月，观察是否破乳。
鳜蛙病毒病灭活疫苗物理性状实验结果：
A.试验组疫苗粘度36.4cp，对照组疫苗41.6cp，二者均合格；
B.试验组疫苗与对照组疫苗均合格；
C.试验组疫苗与对照组疫苗均无破乳，二者均合格；
D.试验组疫苗与对照组疫苗均无破乳，二者均合格。
(2)油乳剂灭活疫苗安全性试验
采用上述制备的疫苗免疫30g健康鳜鱼，0.2mL/尾，每组疫苗免疫50尾，每日观察鳜鱼健康状态，连续观察14天。
鳜蛙病毒病油乳剂灭活疫苗安全性试验检测结果：动物无死亡，健康状况良好，合格。
(3)油乳剂灭活疫苗效力性试验
采用上述制备的疫苗免疫30g健康鳜鱼，0.1mL/尾，每组疫苗免疫50尾，疫苗免疫后28天，用传染性脾肾坏死病毒进行攻毒，比较对照组疫苗与诺卡氏菌佐剂添加的实验组疫苗免疫效果差异。
鳜蛙病毒病油乳剂灭活疫苗效力试验检测结果，动物无死亡，健康状况良好，合格。
鳜蛙病毒病灭活疫苗攻毒保护结果如下表1所示：
表1鳜蛙病毒病灭活疫苗攻毒保护结果
试验组别
鳜鱼数量(尾)
免疫后28天攻毒保护
实验组A
50
49/50保护
实验组B
50
47/50保护
实验组C
50
45/50保护
实验组D
50
35/50保护
实验组E
50
38/50保护
实验组F
50
35/50保护
对照组
50
30/50保护
空白组
50
45/50发病，且40/50死亡
由表1可知，本发明提供的疫苗免疫鳜鱼28天后，其攻毒后保护率与对照组呈显著差异，且攻毒对照组成立。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。