一种用于动物疫苗的复合佐剂、制备方法及疫苗
阅读说明：本技术 一种用于动物疫苗的复合佐剂、制备方法及疫苗 (Compound adjuvant for animal vaccine, preparation method and vaccine ) 是由 舒建洪 何玉龙 冯华朋 李遥 张丰昌 陈晓威 于 2020-06-16 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种用于动物疫苗的复合佐剂、制备方法及疫苗。在一个实施方案中,所述复合佐剂通过由角鲨烯、SPAN85和TWEEN 80的组合物乳化制成。在另一实施方案中,所述复合佐剂通过由角鲨烯、SPAN85、TWEEN 80和皂甙的组合物乳化制成。利用本发明的方法,能够以较高的配比跟抗原配合使用且具有良好的生物相容性和稳定性的动物疫苗佐剂。(The invention relates to a composite adjuvant for an animal vaccine, a preparation method and the vaccine. In one embodiment, the composite adjuvant is made by emulsifying a composition of squalene, SPAN85 and TWEEN 80. In another embodiment, the composite adjuvant is prepared by emulsifying a composition of squalene, SPAN85, TWEEN 80 and saponin. The method of the invention can be used with antigen in a higher proportion, and the animal vaccine adjuvant has good biocompatibility and stability.)
技术领域
本发明涉及制备动物疫苗的领域，具体涉及一种用于动物疫苗的复合佐 剂、制备方法及疫苗。
背景技术
疫苗佐剂是能够非特异性地改变或增强机体对抗原的特异性免疫应答、 发挥辅助作用的一类物质。佐剂能够诱发机体产生长期、高效的特异性免疫反 应，提高机体保护能力，同时又能减少免疫物质的用量，降低疫苗的生产成本。 近年来，为适应新型疫苗的需求，佐剂已经从传统、单一的形式向新型、多元 化形式发展，尤其用于黏膜疫苗、DNA疫苗及肿瘤疫苗的佐剂研究成为热点。
目前，在动物疫苗中，应用较为普遍的佐剂为矿物油佐剂，一般抗原与 油的体积比为1～3：1。在生产乳化过程中，为使剂型稳定，抗原的配比上限需 严格控制；同时抗原作为水相，随着水相添加量增大，乳化产品的粘度也会随 之提高，影响成品注射体验和佐剂的吸收。
因此，在本领域中，仍然需要一种能够以较高的配比跟抗原配合使用且 具有良好的生物相容性和稳定性的动物疫苗佐剂。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的之一是提供一种用于动物疫苗 的复合佐剂，所述复合佐剂的主要成分为矿物油、动物组织提取物、植物提取 物等，具有生物相容性好、抗原载量高及成本低廉等效果。
本发明的上述目的通过以下技术方案得以实现：
在第一方面，本发明提供了一种用于动物疫苗的复合佐剂，所述复合佐剂通过 由角鲨烯、SPAN85和TWEEN 80组成的组合物乳化制成。
通过采用该技术方案，利用所述三种组分组成的组合物，能够制得颜色 通透且不分层的油相。当该油相制成动物疫苗进行使用(例如注射)时，在注 射部位能够诱导产生局部的免疫刺激环境，增加趋化因子、细胞因子含量。此 外，还能够增强树突状细胞摄取抗原的能力。此外，由于所述佐剂的生物相容 性好，因此存在较好的使用安全性。特别地，在与抗原(例如人工灭活的细菌 或病毒)进行组合时，该佐剂能够载有较高比例的抗原，从而减少疫苗用量并 且提高疫苗效率。
在一较佳示例中，根据第一方面所述的技术方案可以进一步配置为：角 鲨烯、SPAN85和TWEEN 80的重量配比为(120-140):(15-30):(30-50)，优选为 134:23:43。
在第二方面，本发明提供了一种用于动物疫苗的复合佐剂，所述复合佐 剂通过由角鲨烯、SPAN85、TWEEN 80和皂甙组成的组合物乳化制成。
在一较佳示例中，根据第一方面所述的技术方案可以进一步配置为：角 鲨烯、SPAN85、TWEEN 80和皂甙的重量配比为(5-20):(1-4):(2-10):(0.5-3)，优 选为12:2:5:1。
在一较佳示例中，根据第一方面所述的技术方案可以进一步配置为：所 述皂甙选自人参皂甙或皂角甙。例如，从人参中提取的人参皂甙Re(Re)具有 提高机体免疫功能的作用，表现出良好的免疫佐剂活性。
在第三方面，本发明提供了一种利用根据第一方面所述的复合佐剂制备 疫苗的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)制备油相：将角鲨烯、SPAN85和TWEEN 80以前述重量配比混合，在中 低速搅拌20-50min，静止得到颜色通透的溶液；
(2)制备水相：抗原用适当体积的PBS稀释制成水相；
(3)将步骤(1)获得的溶液重新混匀，然后以水相：油相＝5:1至8:1的体积比 加入水相，在搅拌下乳化，然后离心，得到稳定的水包油型疫苗。
在第四方面，本发明提供了一种利用根据第二方面所述的复合佐剂制备 疫苗的方法，所述方法包括以下步骤：
制备油相：将角鲨烯、SPAN85、TWEEN 80和皂甙以前述重量配比混合，在中 低速搅拌20-50min，静止得到颜色通透的溶液；
制备水相：抗原用适当体积的PBS稀释制成水相；
将步骤(1)获得的溶液重新混匀，然后以水相：油相＝5:1至8:1的体积比加入 水相，在搅拌下乳化，然后离心，得到稳定的水包油型疫苗。
在一较佳示例中，根据第一方面所述的技术方案可以进一步配置为：所 述中低速搅拌为磁力搅拌，转速为80-160r/min。
利用该方案，能够在较低的搅拌转速下实现疫苗的制备，从而避免在较 高的转速下产生的较高温度下乳化对免疫抗原带来不利影响。
在第五方面，本发明提供了一种疫苗，其包含根据前述第一或第二方面 所述的复合佐剂或利用根据第三方面或第四方面所述的方法制得。
利用该技术方案，能够获得高水相/油相比的疫苗，从而大幅提升疫苗的 抗原含量。
综上所述，本发明包括以下至少一种有益技术效果：
1.用于动物疫苗乳化赋型，抗原可添加量高于现有常规佐剂(例如白油、吐温 80、司本80、硬脂酸铝)3倍，甚至在高达8:1的抗原：佐剂体积比下也可形成 稳定的水包油乳化小颗粒；
2.通过调整各组分的配比，实现了乳液亲水性和亲油性的比值平衡，使得根据本 发明的乳化可使用中低速剪切实现，从而避免高温乳化产热对免疫抗原的影响；
3.利用根据本发明制备的疫苗佐剂，能够制备抗原载量高的水包油型疫苗，且其 粘度不会随着水相添加量的增加而增加，从而避免出现油包水型疫苗中随着水 相添加量增加导致的粘度增加的问题；
4.所载荷的抗原在受体内快速、持续释放，快速诱导高浓度的特异性抗体的表达， 刺激体液免疫应答。
附图说明
图1是根据实施例1制备的疫苗乳液的粒径分布示意图；
图2是根据实施例2制备的疫苗乳液的粒径分布示意图；
图3是根据实施例1制备的疫苗乳液在37℃存放28天之后的照片；
图4是根据实施例2制备的疫苗乳液在37℃存放28天之后的照片；
图5是根据对比例1制备的疫苗乳液在37℃存放12小时之后的照片；
图6是根据对比例2制备的疫苗乳液在37℃存放7天之后的照片。
具体实施方式
以下结合附图对本发明作进一步详细说明。
疫苗中抗原的含量高低对疫苗的最终效果具有比较重要的影响。如果疫 苗中的抗原含量较低，则容易导致病毒易于失活、疫苗活性受个体差异影响较 大及疫苗接种成功率较低等问题。在目前常规使用的疫苗中，一般抗原与油的 体积比为1：1～3：1，如果抗原含量过高则容易导致分层、乳液不稳定等问题。
经过大量实践，本申请的发明人发现，利用以特定比例混合的角鲨烯、 SPAN85和TWEEN 80(以及皂甙)的组合物，在合适的温度下，按照一定的配 方和混合工艺，能够形成一个表面亲水性的小颗粒。经自乳化或均质后，所述 小颗粒能够与水性抗原结合，形成稳定的250-350nm的脂质小粒，具有良好的 色透性。利用该复合佐剂，能够制得大幅提升抗原载量的疫苗。而且，该复合 佐剂的可以在温和的搅拌条件下制备，从而避免高速搅拌或剪切带来的热量降 低抗原活性等问题。
基于上述发现，本发明人做出了本发明。在一个实施方案中，本发明提 供了一种用于动物疫苗的复合佐剂，所述复合佐剂由包含角鲨烯、SPAN85和 TWEEN 80的组合物乳化制成。在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于 动物疫苗的复合佐剂，所述复合佐剂由包含角鲨烯、SPAN85、TWEEN 80和皂 甙的组合物乳化制成。
下面将参考实施例详细描述本发明，以使本领域的普通技术人员能够更 好地理解本发明。然而，本领域的普通技术人员会理解，提供所述实施例的目 的仅仅是为了举例说明的目的，而无意于以任何方式限制本发明。
实施例1
(1)将角鲨烯、SPAN85和TWEEN 80以134:23:43重量配比混合，以150rpm 转速搅拌30min，静止得到颜色通透的溶液；
(2)制备水相：无菌检测合格的灭活后的PCV2细胞培养物为水相；
(3)将步骤(1)获得的溶液重新混匀，然后以水相：油相＝6:1的体积比加入 水相，在150rpm速度搅拌下乳化，静置得到水包油型疫苗。吸取少量成品滴于 冷水表面，呈云雾状扩散，为水包油型；取10ml成品以3000r/min离心15分钟， 管底无水相析出；在4℃和37℃下分别存放28天，没有出现分层现象，所得疫 苗为稳定的乳液。
(4)将成品用旋转式黏度计，测得黏度为6.3cP。
(5)按步骤(1)制备油相800ml,PES膜穿透，高压灭菌后分层，灭菌 后混匀，以1:6的体积比乳化抗原1：6，然后进行离心，乳液仍然均一，在4℃ 和37℃下分别存放28天，没有出现分层现象(见图3)。
实施例2
(1)将角鲨烯、SPAN85、TWEEN 80和皂甙以12:2:5:1重量配比混合，以150rpm 转速搅拌40min，静止得到颜色通透的溶液；
(2)制备水相：无菌检测合格的灭活后的PCV2细胞培养物为水相；
(3)将步骤(1)获得的溶液重新混匀，然后以水相：油相＝8:1的体积比加入 水相，在150rpm速度搅拌下乳化，静置得到水包油型疫苗。吸取少量成品滴于 冷水表面，呈云雾状扩散，为水包油型；取10ml成品以3000r/min离心15分钟， 管底无水相析出；在4℃和37℃下分别存放28天，没有出现分层现象，所得疫 苗为稳定的乳液，。
(4)将成品用旋转式黏度计，测得黏度为5.8cP。
(5)按步骤(1)制备油相800ml,PES膜穿透，高压灭菌后分层，灭菌 后混匀，以1:8的体积比乳化抗原1：8，然后进行离心，乳液仍然均一，在4℃ 和37℃下分别存放28天，没有出现分层现象(见图4)。
对比例1
(1)制备水相：无菌检测合格的灭活后的PCV2细胞培养物为水相；
(2)以206佐剂为油相，提前分别预热水相及油相至31℃，然后以水相：油相 ＝1:1的体积比将水相加入油相，在350rpm下搅拌50分钟，静置即得到水包油 包水型疫苗。吸取少量成品滴于冷水表面，呈云雾状扩散，为水包油包水型； 取10ml成品以3000r/min离心15分钟，管底水相明显析出，析出量大于0.5ml； 在37℃存储12小时，乳液破裂，分为三层,上、中层均为油，下层为水(见图5)。
(3)将成品用旋转式黏度计，测得黏度为7.3cP。
对比例2
(1)制备水相：无菌检测合格的灭活后的PCV2细胞培养物，加入2％Tween-80 混匀即为水相；
(2)Marcol52白油加入Span-80混合均匀为油相，然后以水相：油相＝2:1的体 积比加入步骤(1)中制备的水相，在高速搅拌下乳化，静置得到水包油型疫苗。 吸取少量成品滴于冷水表面，除第1滴外均不扩散，为油包水型；取10ml成品 以3000r/min离心15分钟，管上层油相析出，析出量约0.5ml；在37℃存放21 天，上层析出5mm白色油相；下层管底色浅，色不均(见图6)。
(3)将成品用旋转式黏度计，测得黏度为61.4cP。
实施例3：小鼠免疫试验
一、试验材料
表1：疫苗信息
表2：试剂盒信息
3、试验小白鼠：购自杭州师范大学，30日龄左右。其中雄鼠11只，雌鼠14 只。雄鼠每5只分为1组，共2组，剩余1只作为对照组；雌鼠每5只分为1 组，共2组，剩余4只作为对照组。
二、免疫程序：雄鼠、雌鼠各挑选一组(5只/组)免疫圆净诺疫苗，0.2ml/ 只；剩余两组(5只/组)免疫HS1010乳化疫苗，0.2ml/只；对照组注射生理盐 水，0.2ml/只。
第一次免疫后28天，圆净诺疫苗免疫组和HS1010乳化疫苗免疫组各挑 选2只，进行第二次免疫，7天后采血并剖杀取肝脏、脾脏进行PCR检测。
三、样本采集方案：免疫前进行断尾采血，分离血清，保存于-20℃冰箱； 免疫后，每间隔7天对各实验组进行断尾采血分离血清；一免后21天，除需要 进行二次免疫的2组4只小鼠以及一只对照小鼠外，对剩余小鼠进行剖杀取肝 脏、脾脏冻存。
四、试验结果：
表3：小鼠血清圆环抗体ELISA检测结果(OD值)
*图中“♂”代表雄鼠；“♀”代表雌鼠。
由表3可见：
(1)对照组OD值始终保持稳定，处于阴性水平；
(2)圆净诺疫苗免疫组抗体水平较HS1010组增长慢，免疫后28天，两组抗体 水平逐渐趋于一致，表明新佐剂组能刺激机体较快产生特异性抗体；
(3)圆净诺疫苗免疫组同组间检测OD值相差较HS1010组大；
(4)二次免疫的小鼠，圆净诺疫苗免疫组7天后检测值继续增长，HS1010组 保持在稳定水平。