具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

本实施例提供一种技术方案：一种二价锰佐剂和CpG佐剂的疫苗佐剂组合物，包括二价锰佐剂和CpG佐剂，CpG佐剂包含：K型ODN、D型ODN、C型ODN。CpG佐剂为ODN D-SL01，其序列为5’-tcg cga cgt tcg ccc gac gtt cgg ta-3’ (26 mer)，硫代修饰。

二价锰佐剂（CAS number：MS0002），CpG佐剂为引物公司合成。

一种二价锰佐剂和CpG佐剂的疫苗佐剂组合物的制作方法，将疫苗抗原和二价锰佐剂、CpG佐剂做成稳定形式组合，疫苗抗原浓度为50-100 ug/ml，二价锰佐剂浓度为1 mg/ml，CpG佐剂浓度为1-100 ug/ml，稳定剂明胶的浓度为2-3%；先将二价锰佐剂与CpG佐剂在磁力搅拌器上搅拌混匀10-30 min，温度为室温，转速设置为800-1000 rpm；再将10%的明胶溶液加入搅拌10-30min，温度为50-60摄氏度，转速设置为800-1000rpm；最后将疫苗抗原加入搅拌10-30 min，温度为室温，转速设置为800-1000rpm。疫苗抗原包括灭活病原体或者提取的病原体亚单位抗原及其组合。病原体包括常见对的病毒、细菌和/或寄生虫。病毒选自：DNA病毒和RNA病毒。优选的，病毒选自：疱疹病毒科、弹状病毒科、丝状病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、冠状病毒科、小RNA病毒科、嗜肝DNA 病毒科、黄病毒科、乳头瘤病毒科、痘病毒科、和逆转录病毒科。进一步优选，病毒选自：单纯疱疹病毒、水疱性口炎病毒、牛痘病毒、HIV和HBV。细菌选自革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。优选的，细菌选自肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、沙门氏菌、脑膜炎双球菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、 肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、绿脓假单胞菌和波美不动杆菌。寄生虫选自疟原虫、弓形虫、锥虫、血吸虫、丝虫和利什曼原虫。

一种二价锰佐剂和CpG佐剂的疫苗佐剂组合物的使用方法，包括肌肉注射、皮内注射、皮下注射、静脉注射、粘膜施用及其任意组合。

ELISA 方法测定RVG特异性IgG抗体：将来自免疫小鼠的稀释血清孵育在涂覆了 2μg/ml RVG 的 ELISA 板上。清洗后，使用 HRP-缀合的抗体小鼠 IgG（Proteintech, Cat#SA00001）检测结合的对应抗体。然后，将板与底物 TMB（ eBioscience）一起孵育，用 1 MH₃PO₄停止反应，然后测定 450 nm 和650nm吸收波长的吸光度。

实施例1.二价锰佐剂加CpG佐剂皮下免疫效果（图1）

CTL组：200 ul针剂中加10 ug蛋白，其余用生理盐水补齐，免疫小鼠。Alhy组：200ul针剂中加铝佐剂100 ug、蛋白10 ug，其余用生理盐水补齐。MnJ组：200 ul针剂中加二价锰佐剂100 ug、蛋白10 ug，其余用生理盐水补齐。MnJ+CpG组：200 ul针剂中加二价锰佐剂100 ug、CpG佐剂10 ug、蛋白10 ug，其余用生理盐水补齐。分别在第0天和第14天皮下免疫小鼠，第21天检测特异性抗体。二价锰佐剂加CpG佐剂组增强抗体产生效果显著高于二价锰佐剂组和铝佐剂组。

图1示了四种免疫方案:CTL表示单独免疫狂犬G蛋白10 ug，Alhy表示免疫铝佐剂100 ug加狂犬G蛋白10 ug，MnJ表示免疫二价锰佐剂100 ug加狂犬G蛋白10 ug，MnJ+CpG表示免疫二价锰佐剂100 ug加CpG佐剂10 ug加狂犬G蛋白10 ug。免疫途径是皮下免疫。免疫动物为C57BL/6小鼠。免疫时间是在第0天和第14天，第21天时取血清用ELISA方法检测血清中特异性IgG抗体。

实施例2.二价锰佐剂加CpG佐剂肌肉免疫效果（图2）

CTL组：200 ul针剂中加10 ug蛋白，其余用生理盐水补齐，免疫小鼠。Alhy组：200ul针剂中加铝佐剂100 ug、蛋白10 ug，其余用生理盐水补齐。MnJ组：200 ul针剂中加二价锰佐剂100 ug、蛋白10 ug，其余用生理盐水补齐。MnJ+CpG组：200 ul针剂中加二价锰佐剂100 ug、CpG佐剂10 ug、蛋白10 ug，其余用生理盐水补齐。分别在第0天和第14天肌肉免疫小鼠，第21天检测特异性抗体。二价锰佐剂加CpG佐剂组增强抗体产生效果显著高于二价锰佐剂组和铝佐剂组。

图2示了四种免疫方案:CTL表示单独免疫狂犬G蛋白10 ug，Alhy表示免疫铝佐剂100 ug加狂犬G蛋白10 ug，MnJ表示免疫二价锰佐剂100 ug加狂犬G蛋白10 ug，MnJ+CpG表示免疫二价锰佐剂100 ug加CpG佐剂10 ug加狂犬G蛋白10 ug。免疫途径是肌肉免疫。免疫动物为C57BL/6小鼠。免疫时间是在第0天和第14天，第21天时取血清用ELISA方法检测血清中特异性IgG抗体。

二价锰纳米颗粒可以直接激活免疫反应，二价锰佐剂和CpG佐剂都有免疫效果，在二价锰纳米颗粒中加入CpG佐剂可以提升原来的免疫效果。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

需要说明的是，本申请的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的术语在适当情况下可以互换，以便这里描述的本申请的实施方式，例如，能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、产品或设备固有的其它步骤或单元。

为了便于描述，在这里可以使用空间相对术语，如“在……之上”、 “在……上方”、“在……上表面”、“上面的”等，用来描述如在图中所示的一个器件或特征与其他器件或特征的空间位置关系。应当理解的是，空间相对术语旨在包含除了器件在图中所描述的方位之外的在使用或操作中的不同方位。例如，如果附图中的器件被倒置，则描述为“在其他器件或构造上方”或“在其他器件或构造之上”的器件之后将被定位为“在其他器件或构造下方”或“在其他器件或构造之下”。因而，示例性术语“在……上方”可以包括“在……上方”和“在……下方”两种方位。该器件也可以其他不同方式定位(旋转90度或处于其他方位)，并且对这里所使用的空间相对描述作出相应解释。

现在，将参照附图更详细地描述根据本申请的示例性实施方式。然而，这些示例性实施方式可以由多种不同的形式来实施，并且不应当被解释为只限于这里所阐述的实施方式。应当理解的是，提供这些实施方式是为了使得本申请的公开彻底且完整，并且将这些示例性实施方式的构思充分传达给本领域普通技术人员，在附图中，为了清楚起见，有可能扩大了层和区域的厚度，并且使用相同的附图标记表示相同的器件，因而将省略对它们的描述。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。