具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1、维甲酸纳米乳佐剂(RA-NE)的配方筛选

配方1：维甲酸纳米乳佐剂(100g)：维甲酸1g、吐温-80 2g、丙二醇2g、蒸馏水95g。

配方2：维甲酸纳米乳佐剂(100g)：维甲酸0.1g、吐温-80 30g、甘油10g、辛癸酸甘油酯(GTCC)10g、蒸馏水49.9g。

配方3：维甲酸纳米乳佐剂(100g)：维甲酸2g、吐温-20 5g、丙二醇0.1g、乙酸乙酯0.1g、蒸馏水92.8g。

配方4：维甲酸纳米乳佐剂(100g)：维甲酸5g、吐温-60 20g、丙二醇4g、药用石蜡油6g、蒸馏水65g。

配方5：维甲酸纳米乳佐剂(100g)：维甲酸2g、吐温-85 30g、1,3丁二醇10g、GTCC15g、蒸馏水43g。

配方6：维甲酸纳米乳佐剂(100g)：维甲酸1g、吐温-80 2g、丙二醇0.2g、甘油0.1g、GTCC 0.1g、IPM 0.1g、蒸馏水96.5g。

配方7：维甲酸纳米乳佐剂(100g)：维甲酸2g、吐温-85 1g、乙醇1g、石蜡油0.1g、蒸馏水95.9g。

配方8：维甲酸纳米乳佐剂(100g)：维甲酸2g、吐温60 1g、吐温-80 2g、司盘-600.1g、十四酸异丙酯(IPM)0.1g、蒸馏水94.8g。

配方9：维甲酸纳米乳佐剂(100g)：维甲酸5g、RH40 3.5g、乙醇0.5g、GTCC 0.5g、蒸馏水90.5g。

配方10：维甲酸纳米乳佐剂(100g)：维甲酸1g、EL 35 30g、1,3丁二醇0.5g、乙酸乙酯 10g、蒸馏水58.5g。

配方11：维甲酸纳米乳佐剂(100g)：维甲酸2g、EL40 30g、乙醇10g、油酸乙酯10g、蒸馏水48g。

配方12：维甲酸纳米乳佐剂(100g)：维甲酸5g、EL40 1g、1,3丙二醇0.1g、石蜡油0.5g、蒸馏水93.4g。

配方13：维甲酸纳米乳佐剂(100g)：维甲酸10g、吐温-60 1g、司盘-80 0.1g、角鲨烯0.1g、蒸馏水88.8g。

配方14：维甲酸纳米乳佐剂(100g)：维甲酸5g、吐温-80 5g、司盘-85 0.1g、角鲨烯0.5g、蒸馏水89.4g。

配方15：维甲酸纳米乳佐剂(100g)：维甲酸0.1g、吐温-80 25g、司盘-60 10g、角鲨烷-10g、蒸馏水54.9g。

配方16：维甲酸纳米乳佐剂(100g)：维甲酸10g、吐温-85 5g、司盘-80 1g、角鲨烷0.1g、角鲨烯0.5g、生理盐水83.4g。

配方17：维甲酸纳米乳佐剂(100g)：维甲酸2g、吐温-85 25g、司盘-85 15g、角鲨烯10g、蒸馏水48g。

配方18：维甲酸纳米乳佐剂(100g)：维甲酸5g、聚氧乙烯蓖麻油(EL35)10g、司盘-80 0.1g、角鲨烯0.1g、蒸馏水84.8g。

配方19：维甲酸纳米乳佐剂(100g)：维甲酸6g、吐温80 30g、司盘80 15g、角鲨烯5g、蒸馏水44g。

配方20：维甲酸纳米乳佐剂(100g)：维甲酸2g、EL40 20g、丙二醇1g、油酸乙酯0.5g、生理盐水76.5g。

对表面活性剂(SF)，如：吐温-80、吐温-85、吐温60、吐温20和聚氧乙烯蓖麻油(EL40、 EL35)、聚氧乙烯氢化蓖麻油等进行筛选，根据高速离心稳定实验、粒度和电位等检测，发现上述处方及其范围内均可形成维甲酸纳米乳佐剂。

将上述配方稀释100倍用纳米电位分析仪进行粒度和分散性检测；用高速离心13000rpm，30min观察离心前后的是否分层、絮凝，药物析出、破乳等不稳定性现象发生。

其检测结果如表1所示：

表1、不同配方检测结果

上述配方的纳米乳佐剂，用100倍用纳米电位分析仪进行粒度和分散性检测；用高速离心13000rpm，30min观察离心前后的是否分层、絮凝，药物析出、破乳等不稳定性现象发生，均满足要求，粒径在1-100nm，分散性指数小于0.3，离心后均未分层，未絮凝、未药物析出、未破乳为合格的纳米乳佐剂配方。实验中选择上述合格配方，随机选择19号配方为研究配方。并且制备的维甲酸纳米乳佐剂只要粒径范围在100nm以内的，稳定性好的纳米乳在后续实施例中都有相同的结果。

实施例2、优选的atRA-NE的制备及表征

1、atRA-NE的制备

于50ml洁净干燥烧杯中精密称量10mg维甲酸(atRA)，滴加油相、表面活性剂和助表面活性剂并搅拌至充分溶解后，采用低能乳化法，即边搅拌边缓慢滴加灭菌纯水至体系体积为 10mL，制备维甲酸纳米乳佐剂(atRA-NE)，室温静置避光保存。空白纳米乳佐剂(BNE)，则处方中不需要加入维甲酸。

2、粒径及Zeta电位检测

用超纯水将制得的纳米乳佐剂稀释100倍，在Nano ZA动态光散射粒径电位仪中检测粒径及Zeta电位。

3、透射电镜(TEM)检测

用超纯水将制得的纳米乳佐剂稀释100倍，取5μL于电镜铜网上，静置10分钟，使用滤纸小心吸干多余水分，滴加10μL 1％磷钨酸染色1分钟，之后再次使用滤纸吸干多余水分，在TEVNAI10透射电镜下观察并采集图像。

4、扫描电镜(SEM)检测

将纳米乳佐剂送至陆军军医大学分析测试中心扫描电镜室制样并检测。

5、包封率与载药量测定

0.4mL纳米乳佐剂中加入0.8mL无水乙醇破乳或者加入0.8mL纯水，13000rpm离心30 分钟，取上清和沉淀分别测其中全反式维甲酸的浓度。

包封率＝实际维甲酸装载量/理论维甲酸装载量×100％；

载药量＝(破乳上清中维甲酸的含量+破乳沉淀中维甲酸的含量)/样品总质量×100％。

检测结果如图1所示，其粒径与zeta电位分布较为集中，平均粒径为27.23nm(图1，a)。分散性为0.181，zeta电位为-25.8mV(图1，b)。另经测定，其包封率为99.26％，载药量为0.998mg/mL。扫描电镜(图1，c)与透射电镜(图1，d)观察到atRA-NE呈球形，分散性良好，无聚集，具有良好的质量特征。

6、稳定性检测

用高速离心13000rpm，30min观察离心前后的是否分层、絮凝，药物析出、破乳等不稳定性现象发生，均满足要求，粒径在1-100nm，分散性指数小于0.3，离心后均未分层，未絮凝、为药物析出、为破乳为合格的纳米乳佐剂配方。将1.5ml纳米乳佐剂在13000rpm下离心30min，然后观察结果如图2所示。结果显示，本发明制备的纳米乳佐剂稳定性好。

实施例3、atRA-NE刺激小鼠淋巴细胞成熟能力

1、atRA-NE促BMDC细胞成熟能力

处死小鼠取其股骨，用1mL注射器吸取含10％FBS的1640培养基冲洗骨髓5次，收集骨髓细胞冲洗液，1500rpm离心15分钟，将收集到的细胞种于细胞培养板中，每隔一天半量换液一次，第6天离心收集细胞即得小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDCs)，调整细胞浓度至 5×10⁵个/mL，于6孔板中2ml/孔加入。之后每孔加入20μL培养基、20μL 1：100稀释后的Blank-NE、20μg atRA或20μL 1：100稀释后的atRA-NE，吹打混匀后置于细胞培养箱孵育 24小时。离心并用PBS洗涤细胞，用staining buffer以1：50稀释APC标记小鼠CD11c抗体、PE标记小鼠CD40抗体、PerCP/Cy7标记小鼠CD86抗体混合稀释，每管细胞100μL染色液重悬，4℃避光染色30分钟。离心弃上清，用100μL staining buffer重悬后用FACSVerse 流式细胞仪检测。

2、atRA-NE促进淋巴细胞表面CCR9的表达

取小鼠肠道淋巴结置于200目筛网中研磨，取研磨液1500rpm，10分钟离心，加入完全培养基重悬并调整细胞浓度到5×10⁵个/mL，于12孔板中2mL/孔加入，之后每孔加入20μL培养基、20μL 1：100稀释后的Blank-NE、20μg atRA或20μL 1：100稀释后的atRA-NE，吹打混匀后置于细胞培养箱孵育48小时，离心收集细胞，使用细胞RNA提取试剂盒提取RNA，之后逆转录为DNA；PCR体系：取2μL DNA加入7μL无酶水，CCR9引物，10μL SYBR Green，按程序95℃30秒，(95℃5秒，58℃20秒，72℃10秒)40个循环，95℃10秒，(65℃上升至 95℃5秒，每次上升0.5℃)，Realtime-PCR仪检测CCR9基因表达情况。

CD40+/CD11c+、CD86+/CD11c+细胞的比例，atRA-NE组显著高于其余对照组(图3，a)，显示了atRA-NE具有更强的刺激DC细胞成熟的能力。与atRA-NE共孵育的细胞的CCR9基因表达水平显著高于其他对照组(图3，b)，说明atRA-NE有更强的刺激淋巴细胞表面表达CCR9的能力，由于肠道表面高表达CCR9的配体CCL25，这使得atRA-NE提高了淋巴细胞向肠道归巢的趋向性。

实施例4、以OVA模式抗原为模型，维甲酸纳米乳佐剂增强免疫应答作用

1、动物分组与免疫

实验分为5组，依次为PBS组，OVA组，OVA+氢氧化铝组，OVA+空白纳米乳佐剂(BNE)组和OVA+atRA-NE组，每组8只BALB/c小鼠(6-8周龄，雌性，购自北京维通利华公司)。采用肌肉注射的方式于0天、14天和28天三次免疫。抗原OVA为10μg/只，氢氧化铝为100μg/ 只，空白及其维甲酸纳米乳佐剂为100μg/只。

2、注射部位急性炎症的表征

IL-6与IL-15都是参与免疫调控的重要细胞因子，可增强自然杀伤细胞的裂解功能，同时能促使B细胞前体成为产生抗体的浆细胞，另有报道表明IL-15的分泌对于激活atRA受体 RAR有积极作用。单次免疫后48h，取小鼠股四头肌(12±1mm×5±1mm，0.18±0.02g)置于组织破碎管中，加入1mL PBS、5颗3mm氧化锆研磨球，在匀浆机上匀浆15s×10次；匀浆液14800rpm，4℃离心20分钟取上清，按照小鼠IL-6ELISA试剂盒与IL-15ELISA试剂盒说明书定量检测各个样本匀浆上清中IL-6，IL-15的浓度。

结果表明，单次免疫后48h，纳米乳佐剂在注射部位诱导了与铝佐剂相当水平的IL-6(图 4，a)、IL-15(图4，b)，形成了有利于提升淋巴细胞肠粘膜趋向性的炎症微环境。

3、血清中OVA特异性IgG、IgG1、IgG2a的检测

3次免疫后14天，眼眶取血，室温静置眼球血至明显分层，6000rpm离心10分钟分离血清，用抗体稀释液将其稀释1000倍；取ELISA 96孔板，100μL/孔加入含10μg/mL OVA的包被缓冲液，4℃过夜后洗板；250μL/孔加入含1％BSA的PBST，37℃温育封闭2小时后洗板；加入1：1000稀释后的血清并用抗体稀释液倍比稀释，37℃温育1小时后洗板；根据检测目的分别加入1：10000稀释的山羊抗小鼠IgG、山羊抗小鼠IgG1、山羊抗小鼠IgG2a，温育40min 后洗板；100μL/孔加入TMB显色15分钟，之后100μL/孔加入终止液终止显色反应，用酶标仪读取波长为450nm的吸光值；以PBS组小鼠OD450nm平均值的2.1倍作为cutoff值计算抗体滴度。

结果表明，atRA-NE在血清中引发了与铝佐剂相当的高水平OVA特异性IgG(图5，a)，证明其可有效激活系统体液免疫应答。分析其IgG亚型，与铝佐剂相比，atRA-NE诱导了更强的特异性IgG1(图5，b)与IgG2a(图5，c)，提示其在介导CD8+与CD4+T细胞应答的能力可能强于铝佐剂；且IgG1的水平要高于IgG2a(图5，d)，提示atRA-NE可能诱导了Th2偏向型的细胞免疫应答。

4、小肠灌洗液中OVA特异性sIgA的检测

配备含0.1mg/mL trypsin inhibitor，50mM EDTA-2Na，1mM PMSF的PBS溶液作为小肠灌洗液；沿肠管将小肠剖开浸入小肠灌洗液，于4℃冷库中涡旋震荡30分钟使小肠内容物充分溶出，4000rpm离心20分钟，取上清再以14800rpm离心10分钟，取上清即得小肠灌洗液样本。ELISA板包被步骤同前述；洗板后250μL/孔加入含20％FBS的PBST温育封闭2小时后洗板，每孔加入含20％FBS的PBST 100μL，之后在各样品孔中分别加入100μL小肠灌洗液，倍比稀释后，于37℃温育1小时后洗板；100μL/孔加入1：10000稀释的山羊抗小鼠IgA，温育40分钟后洗板；显色、读板并检测抗体水平。

结果表明，肌注纯抗原以及与铝佐剂联用均不能在肠粘膜诱导特异性sIgA，而atRA-NE 显著提升了肠粘膜中OVA特异性sIgA的水平(图6)，说明atRA-NE具有显著的肠粘膜佐剂效应。

5、阴道灌洗液中OVA特异性sIgA抗体水平的检测

阴道灌洗液：75μl PBST冲洗经OVA抗原处理的小鼠的阴道4次，得300μl阴道灌洗液，14800rpm，4℃，10min离心，ELISA测上清中抗体含量。结果如图7所示，表明atRA-NE 能显著增强阴道粘膜OVA特异性抗体IgA的分泌，说明atRA-NE能有效诱导阴道粘膜的免疫效应。

6、肺泡灌洗液中OVA特异性sIgA抗体水平的检测

处死小鼠，用500μl灭菌PBS灌洗经OVA抗原处理的小鼠肺部3次，得肺泡灌洗液(BALF)，ELISA法测其中抗体含量。结果如图8所示，表明atRA-NE能显著增强肺粘膜 OVA特异性抗体sIgA的分泌，说明atRA-NE能有效诱导肺部粘膜的免疫效应。

7、胃匀浆液中OVA特异性sIgA抗体水平的检测

取经OVA抗原处理的小鼠全胃，加入1ml生理盐水，匀浆，14800rpm，4℃，10min离心取上清测抗体含量。结果如图9所示，表明atRA-NE能显著增强胃粘膜OVA特异性抗体 IgA的分泌，说明atRA-NE能有效诱导胃粘膜的免疫效应。

8、脾淋巴细胞培养上清中IL-4，IL-17的检测

取出小鼠脾脏，在3mL红细胞裂解液中研磨得脾细胞悬液，离心弃上清后用完全培养基重悬细胞并调整脾淋巴细胞浓度至1×10⁷个/mL，于24孔板中1mL/孔加入；配备含1mg/mL OVA的完全培养基溶液，0.22μm滤器滤过除菌，每孔细胞悬液中加入10μL，于37℃细胞培养箱中孵育48小时；1500rpm离心10分钟取上清；按照IL-4，IL-17检测试剂盒说明书所述方法测定细胞培养上清中各细胞因子的浓度。

结果表明，ELISpot检测经OVA_257-264或OVA_323-339表位肽刺激后的脾淋巴细胞培养上清中，铝佐剂组IL-4的水平显著大于纳米乳佐剂组(图10，a)，纳米乳佐剂组IL-17A的水平显著大于铝佐剂组(图10，b)，提示铝佐剂主要激发了Th2型细胞免疫应答，而atRA-NE 有助于Th1、Th17型免疫应答。

9、ELISPOT测脾淋巴细胞分泌IFN-γ的水平

参照3.3中已调好浓度的淋巴细胞悬液100μL/孔加入预包被IFN-γ抗体的ELISPOT板中；再加入100μL空白完全培养基，或20μg/mL OVA_257-264或OVA_323-339的完全培养基溶液，细胞培养箱中孵育72小时；扣除板内细胞并用PBS洗板，100μL加入1：1000稀释的检测抗体(BVD6-24G2-生物素)，室温静置2小时后洗板；100μL加入1：1000稀释的链霉亲和素-辣根过氧化物酶，室温静置1小时后洗板；100μL加入TMB显色15分钟，扣除TMB，纯水洗板，晾干后使用读板机读板并对斑点计数。

ELISpot检测经OVA_257-264或OVA_323-339表位肽刺激后的脾淋巴细胞分泌IFN-γ水平，atRA-NE组显著高于铝佐剂组，铝佐剂组显著高于空白纳米乳佐剂组(图11，a，b，c)，提示与铝佐剂相比，atRA-NE可以诱导更显著的细胞免疫应答。

实施例5、以金黄色葡萄球重组蛋白抗原HI为模型，维甲酸纳米乳佐剂增强免疫应答作用

1、动物分组与免疫

实验分为5组，依次为PBS组、HI组、HI+氢氧化铝组、HI+空白纳米乳佐剂(BNE) 组、HI+atRA组和HI+atRA-NE组，每组8只BALB/c小鼠(6-8周龄，雌性，购自北京维通利华公司)。采用肌肉注射的方式于0天、7天和14天三次免疫。抗原HI为10μg/只；氢氧化铝为100μg/只，空白及其维甲酸纳米乳佐剂为100μg/只。

2、血清中HI特异性IgG的检测

末次免疫后14天，处死经HI抗原处理的小鼠，眼眶取血，血清在室温放置至分层，用抗体稀释液稀释至所需倍数，ELISA法测其中抗体含量。结果如图12所示，atRA-NE在血清中引发了与铝佐剂相当的高水平HI特异性IgG，证明其可有效激活系统体液免疫应答。

3、阴道灌洗液中HI特异性sIgA抗体水平的检测

末次免疫后14天，用75μl PBST冲洗经HI抗原处理的小鼠的阴道4次，得300μl阴道灌洗液，14800rpm，4℃，10min离心，ELISA测上清中抗体含量。结果如图13所示，表明 atRA-NE能显著增强阴道HI特异性抗体IgA的分泌。

实施例6以新冠病毒重组蛋白抗原RBD为模型，维甲酸纳米乳佐剂增强免疫应答作用

1、动物分组与免疫

实验分为5组，依次为PBS组、RBD+空白纳米乳佐剂(BNE)组和RBD+atRA-NE组，每组8只BALB/c小鼠(6-8周龄，雌性，购自北京维通利华公司)。采用肌肉注射的方式于 0天、14天和28天三次免疫。抗原RBD为20μg/只；氢氧化铝为100μg/只，空白及其维甲酸纳米乳佐剂为100μg/只。

2、血清中RBD特异性抗体的检测

末次免疫后14天处死经RBD抗原处理的小鼠，眼眶取血，血清在室温放置至分层，用抗体稀释液稀释至所需倍数，ELISA法测其中抗体含量。atRA-NE在血清中引发了高水平RBD 特异性IgG(图14，A)，IgA(图14，B)，证明其可有效激活系统体液免疫应答。

3、阴道灌洗液中RBD特异性sIgA抗体水平的检测

末次免疫后14天，75μl PBST冲洗经RBD抗原处理的小鼠的阴道4次，得300μl阴道灌洗液，14800rpm，4℃，10min离心，ELISA测上清中抗体含量。结果如图15所示，表明 atRA-NE能显著增强阴道RBD特异性抗体IgA的分泌。

4、肺泡灌洗液中RBD特异性sIgA抗体水平的检测

末次免疫后14天处死小鼠，用500μl灭菌PBS灌洗经RBD抗原处理的小鼠肺部3次，得肺泡灌洗液(BALF)，ELISA法测其中抗体含量。结果如图16所示，表明atRA-NE能显著增强肺粘膜RBD特异性抗体sIgA的分泌。

5、鼻腔灌洗液中RBD特异性sIgA抗体水平的检测

末次免疫后14天处死经RBD抗原处理的小鼠，用500μl灭菌PBS灌洗小鼠上呼吸道及鼻腔，得鼻腔灌洗液，ELISA法测其中抗体含量。结果如图17所示，表明atRA-NE能显著增强鼻粘膜RBD特异性抗体IgA的分泌，说明atRA-NE能有效诱导鼻粘膜的免疫效应。

6、ELISPOT测脾淋巴细胞IgA ASC和IgG ASC的水平检测

取小鼠脾脏，研磨、过滤等步骤后得小鼠脾淋巴细胞，用培养基调整细胞浓度至10⁶个 /mL。在包被有RBD的ELISPOT板上孵育24h，之后按ELISPOT试剂盒(Mabtech)说明书操作显色。

结果如图所示，表明atRA-NE能显著增强脾淋巴细胞RBD特异性抗体IgG ASC(图18)、 IgA ASC(图19)的分泌，说明atRA-NE能有效诱导脾淋巴细胞中抗体分泌细胞的表达。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。