雌性哺乳动物的生殖系统培养体系及其应用
阅读说明：本技术 雌性哺乳动物的生殖系统培养体系及其应用 (Reproductive system culture system of female mammal and application thereof ) 是由 张华� 牟璐 杨雪冰 许学强 张焱 于 2021-07-07 设计创作，主要内容包括：本发明涉及药物筛选技术领域,尤其涉及雌性哺乳动物的生殖系统培养体系及其应用。本发明提供了卵泡在体外培养,并将其作为血管新生相关药物筛选的受试对象的方法。该方法在体外维持卵泡血管的良好发育的基础上,构建了血管新生相关药物筛选的系统,能够实现血管新生相关药物的快速、准确筛选。(The invention relates to the technical field of drug screening, in particular to a reproductive system culture system of female mammals and application thereof. The invention provides a method for culturing follicles in vitro and using the follicles as subjects for screening angiogenesis-related drugs. The method constructs a system for screening the angiogenesis-related drugs on the basis of maintaining good development of follicular vessels in vitro, and can realize rapid and accurate screening of the angiogenesis-related drugs.)
技术领域
本发明涉及药物筛选技术领域，尤其涉及雌性哺乳动物的生殖系统培养体系及其应用。
背景技术
生理条件下，成年机体发生血管新生并不常见，而病理条件下，可发生活跃的血管新生，例如：肿瘤发生。为供给快速增殖的肿瘤细胞营养，肿瘤会发生快速、活跃且多样式的血管新生，其中以出芽式血管新生最为常见，目前的机制研究也最为清晰。
众所周知，恶性肿瘤治疗通常采用手术、化疗及放疗的方式，然而多数情况下治疗效果并不理想，其主要原因在于这些方式虽然可以减少肿瘤细胞却不能有效抑制肿瘤的转移，同时对于放化疗不敏感的肿瘤，此方法并不奏效。肿瘤细胞转移存在两种渠道：淋巴管和血管。通过淋巴管进行的肿瘤转移通常只转移到邻近组织，被侵袭的脏器并不多，而通过血管进行的肿瘤转移即可到达全身各处，严重威胁病人生命。令人兴奋地是，近年来，通过对血管新生的广泛研究，尤其针对肿瘤血管新生的特性，科学家们提出了阻断肿瘤血管新生联合放化疗的治疗新策略。此方式在降低肿瘤细胞转移几率的基础上，还具有药物剂量小、副作用小、抗药性小等优点。但是，由于体外血管新生模型的限制，目前对于调控血管新生药物的有效筛选，依然存在着巨大的局限。因而，建立有效的接近于体内水平的高通量血管新生相关药物的有效筛选体系，为包括临床肿瘤治疗等血管新生相关疾病提供有效用药依据具有巨大的应用价值，并且对临床诊疗也是至关重要的。
近年来，临床药物的开发以井喷的方式在全球开展，而包括化学药剂及生物类药剂等多种新药的开发数量呈指数增加。而药物有效性的鉴定，则成为了药物整体研发中的关键且限速的步骤。目前，药物药效的临床前鉴定主要使用整体动物水平模型、组织器官水平模型和细胞分子水平模型。其中整体动物水平可以直观反应出药物的治疗效果，但存在着成本高，通量低的弊端；而体外培养细胞等方式，虽能实现较高通量的筛选，但由于细胞培养失去了体内的细胞互作以及组织立体结构，因而往往难以达到生理水平下药物作用真实性的体现；离体组织器官培养，虽然一定程度上兼具了动物水平检测和细胞水平检测的优点，但由于器官整体培养普遍存在较大的困难，同时获取器官往往与动物实验需要同等水平的动物消耗，因而难以广泛开展。特别是血管新生相关药物的开发，由于成年动物普遍缺乏生理性的血管新生现象，而细胞及组织水平的体外模型，则有着多种的局限性，因而市场上目前依然缺乏有效的高通量低成本血管新生相关药物的有效筛选体系。
不同于大多数成年器官的血管系统以稳态的方式存在，雌性哺乳动物的生殖系统，特别是卵巢，是少数在成年后依然存在剧烈血管新生的器官。以小鼠为例，雌性小鼠卵巢内存在的大量生长卵泡，是活跃血管新生的主要发生结构。与一些种类的肿瘤相似，生长卵泡其周围存在着活跃的血管新生，并且与卵泡内部的颗粒细胞、卵母细胞构成有机的功能复合体，在体内形成相对独立的功能性结构。如果能够将生长的卵泡与其周围血管同步进行分离，以类器官的模型进行成熟的体外培养，则该体系便能够作为血管新生体外类器官模型。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供雌性哺乳动物的卵泡-血管复合培养体系的建立及其应用，通过构建可视化的以卵泡为类器官载体的体外血管三维快速新生培养体系以及其在筛选抑制血管新生药物中的应用。本发明提供的培养体系，可快速、高通量地区别多种药物，特别是调控血管新生药物的药效。
本发明提供了卵泡在制备血管新生相关的药物筛选的试剂中的应用。
本发明通过体外培养，构建了可视化的体外血管三维快速新生培养体系，该体系能够维持卵泡，特别是卵泡的血管正常生长。利用该体系培养卵泡细胞并添加待测药物，能够实现对血管新生相关药物药效快速、准确的筛选。一些实施例中，所述卵泡采用小鼠卵泡。
本发明提供的血管新生相关药物的筛选体系，其包括：卵泡和培养液。
本发明所述筛选体系中的卵泡直径大于200μm。
所述筛选试剂中的培养液包括：
溶液I：包括MEMα液体培养基、0.01～0.05mol/L碳酸氢钠、1wt.％～10wt.％胎牛血清和双抗；
溶液II：leibovitz’s L-15培养液；
溶液III：包括水和0.1wt.％～2wt.％ITS和5～15μg/L促性腺激素。
一些实施例中，所述培养液中：
溶液I：由MEMα液体培养基、0.025mol/L碳酸氢钠、5wt.％胎牛血清、10mg/L链霉素和10U/mL青霉素；
溶液II：leibovitz’s L-15培养液；
溶液III：由水和1wt.％ITS和10μg/L促性腺激素组成。
本发明提供的培养液组合能够保证哺乳动物的卵泡在体外健康生长，特别是保证其血管的发育。相对于其他培养基或者缺少部分组分的培养液，本发明所述的培养液组合在卵泡的体外排样以及卵泡血管发育方面具有更良好的培养效果。
一些具体实施例中，所述溶液I、溶液II和溶液III的体积比为100：2：1。
本发明所述的筛选体系中，还包括待测药物，所述待测药物包括VEGF受体抑制剂。所述筛选体系中，还包括药物筛选所需的其他试剂。
本发明还提供了所述一种血管新生相关药物筛选体系的构建方法，其包括：构建体外-卵泡血管复合体系。
所述体外-卵泡血管复合体系的构建方法如下：1)选取直径大于200μm的卵泡；2)沿卵泡边缘整齐切割，获得卵泡-血管复合体。
所述体外-卵泡血管符合体系的构建方法具体包括：以培养液组合对卵泡-血管复合体进行培养，具体为：
在预热的溶液II中将卵巢中的卵泡分离，然后于37℃，5％CO2培养15min；
然后将卵泡转移至预热的混合液，37℃，5％CO2培养24hr；
所述混合液中包括溶液I和溶液III，所述溶液I与溶液III的体积比为100:1；
溶液I：包括MEMα液体培养基、0.01～0.05mol/L碳酸氢钠、1wt.％～10wt.％胎牛血清和双抗；
溶液II：leibovitz’s L-15培养液；
溶液III：包括水和0.1wt.％～2wt.％ITS和5～15μg/L促性腺激素。
由于本发明提供的培养液组合能够在体外维持卵泡血管的良好发育，因此，以该培养液培养的卵泡可以作为血管新生相关药物筛选系统的受试对象。本发明以阿西替尼(Axitinib)及舒尼替尼(Sunitinib)两种药物进行药筛实验，证明以本发明提供的培养液培养的卵泡能够作为药筛的受试对象，筛选结果准确可靠。
所述混合液中包括溶液I和溶液III，所述溶液I与溶液III的体积比为100:1。
本发明所述血管新生相关药物筛选方法，包括：以卵泡为受试对象，培养并对待测药物进行筛选。
具体的，所述筛选的方法是以本发明所述培养液组合进行培养并筛选。
所述的培养具体包括：
在预热的溶液II中将卵巢中的卵泡分离，然后于37℃，5％CO2培养15min；
然后将卵泡转移至预热混合液，37℃，5％CO2培养24hr；
所述混合液中包括溶液I、溶液III和待测药物，其中，待测药物的浓度为10～50nmol/L，所述溶液I与溶液III的体积比为100:1。
本发明提供了卵泡在体外培养，并将其作为血管新生相关药物筛选的受试对象的方法。该方法在体外维持卵泡血管的良好发育的基础上，构建了血管新生相关药物筛选的系统，能够实现血管新生相关药物的快速、准确筛选。
附图说明
图1所示为Tek-Cre；mTmG小鼠卵泡血管在体外新生过程；其中A图为不同分离方式以及不同培养液条件下48hr内卵泡及血管生长形态变化，Control 1(培养液为溶液I+溶液III)为撕扯式而非本发明所述切割式卵泡分离方式下48hr内卵泡及血管生长形态变化，其中黄色箭头为分离初始卵泡周围所携带的血管；Control 2(培养液仅为溶液I)为缺少本发明所述卵泡血管营养液条件下48hr内卵泡及血管生长形态变化，Experiment(培养液为溶液I+溶液III)为本发明所述方法下48hr内卵泡及血管生长形态变化；B图为三种方法48hr内卵泡生长直径变化对比，C图为三种方法48hr内卵泡血管密度变化对比；
图2所示为Axitinib处理后卵泡血管新生变化；其中，A图为不同浓度Axitinib处理后48hr内卵泡及血管生长形态变化，DMSO为对照；B图为不同浓度Axitinib处理后48hr内卵泡生长直径变化，C图为不同浓度Axitinib处理后48hr内卵泡血管密度变化；
图3所示为Sunitinib处理后卵泡血管新生变化；其中，A图为不同浓度Sunitinib处理后48hr内卵泡及血管生长形态变化，DMSO为对照；B图为不同浓度Sunitinib处理后48hr内卵泡生长直径变化，C图为不同浓度Sunitinib处理后48hr内卵泡血管密度变化；
图4所示为最适浓度Axitinib和Sunitinib处理野生型卵泡24hr后血管(PODXL)免疫荧光结果，DMSO为对照。
具体实施方式
本发明提供了雌性哺乳动物的生殖系统培养体系及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明利用血管特异性荧光标记小鼠，即Tek-Cre；mTmG，采用相关培养试剂，进行了可有效支持卵泡血管新生的相关培养。24hr后通过荧光显微镜检测血管生长变化，结果显示本发明相关培养体系可有效地支持卵泡血管在24hr内发生快速大量的新生。
基于上述类器官血管新生培养体系的构建，本发明提供了本体系在临床血管新生相关药物筛选中的应用。
由于大量血管新生相关信号通路如血管内皮生长因子VEGF信号通路在调控血管新生特别是肿瘤血管新生中作用的确立，则所有本领域已知的血管新生相关通路抑制剂如VEGF受体抑制剂都可能进行快速抑制血管新生，而在本发明具体实施方式中，本发明通过阿西替尼(Axitinib)及舒尼替尼(Sunitinib)两种具体的抑制剂进行了验证实验，并对二者的药效进行了比较。
应用血管新生抑制剂阿西替尼及舒尼替尼在体外处理Tek-Cre；mTmG小鼠卵泡，发现培养24hr后卵泡血管密度相比于对照组显著下降，且卵泡生长速度相比于对照组无明显变化，表明血管新生被特异性抑制。此外，本发明也可通过野生型小鼠结合免疫荧光的方法实现。
根据上述技术效果，应用本发明对多种血管新生药物药效进行比较。结果发现，50nM Axitinib在处理48hr后，可以完全抑制血管新生，使血管密度接近为零，而Sunitinib需使用1000nM才可以达到相同处理效果，由此说明，Axitinib的药效强于Sunitinib。
由以上技术方案可知，本发明采用血管新生抑制剂的代表性药物阿西替尼和舒尼替尼证实了小鼠卵泡体外培养体系可快速、特异观察到多种药物对血管新生的影响，为血管新生相关药物筛选提供了一种全新的、高通量的、经济的体系，可将其应用于临床血管新生相关药物筛选。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
配制血管新生相关药物筛试剂，包括以下组分：
溶液I(基本卵泡培养液)：配制方法如下：
在10mg/mL的MEMα(Gibco Minimum Essential Medium(MEM)Alpha Medium)母液中，加入碳酸氢钠至终浓度为0.025M，加入胎牛血清蛋白至终浓度为5wt.％(Gibco)，再加入双抗(10mg/L链霉素和10U/mL青霉素(Invitiogen))；
溶液II:leibovitz’s L-15培养液可以直接使用；
溶液III(卵泡血管营养液)：其中含有1％ITS(Sigma)和促性腺激素10μg/L(Biolead)。
将这三种液体分别包装，再统一包装，其中溶液I、溶液II与溶液III的体积比为100：2：1。使用时按照如下说明书中描述的血管新生相关药物筛选试剂盒使用方法进行操作。
1)在无菌条件下，将溶液Ⅰ和溶液Ⅲ按试剂盒内提供的分装剂量均匀混合；
2)溶液Ⅱ仅在分离卵泡过程中，剂量依据实际操作中所需用量即可；
实施例2
建立血管新生药物筛选体系：
1)取2mL实施例1配制的溶液Ⅱ，37℃预热5min；
2)取育龄雌性Tek-Cre；mTmG小鼠卵巢于预热好的所述溶液Ⅱ中，使用分离针将卵巢切割成4小块；
3)使用分离针将250-300μm的卵泡沿卵泡边缘切割成边缘光滑且完整的单卵泡(避免撕扯)，然后将其放入37℃培养箱；
4)在步骤3)结束后，按不同分组，分别取1mL实施例1配制的溶液I或者取溶液I+溶液III(100:1)，分别在其中加入cell culture inserts(Merck),避免气泡，37℃预热5min；
5)使用移液器，将分离好的卵泡转移到cell culture inserts上，卵泡上方不需要多加额外的液体，培养24hr，培养条件为37℃，5％CO2；
6)24hr后使用荧光显微镜观察血管新生变化。
7)实验结果见图1，从图1可以看出，使用本发明所述卵泡血管分离方法以及含有溶液III的培养基培养48hr内卵泡血管密度显著增加，而使用撕扯式卵泡血管分离方法，如图1中A中的Control 1以及缺乏卵泡血管营养液，如Control 2进行培养，48hr内卵泡几乎无血管或者血管密度增加不显著，说明本发明中血管新生培养体系是成功的。
实施例3：血管新生抑制试验
1.阿西替尼抑制试验
1)取2mL溶液Ⅱ，37℃预热5min；
2)取育龄雌性Tek-Cre；mTmG卵巢至于预热好的溶液Ⅱ中，使用分离针将卵巢切割成4小块；
3)使用分离针将250-300μm的卵泡沿卵泡边缘切割成边缘光滑且完整的单卵泡，然后将其放入37℃培养箱；
4)在步骤3)结束后，分别取1mL溶液I+溶液III(100:1)与10nM和50nM Axitinib混匀，并在其中加入cell culture insert,避免气泡，37℃预热5min；
5)使用移液器，将分离好的卵泡转移到cell culture inserts上，卵泡上方不需要多加额外的液体，培养48hr，培养条件为37℃，5％CO2；
6)间隔24hr使用荧光显微镜观察血管新生变化。
7)实验结果见图2，从图2可以看出Axitinib处理24hr后，血管新生受到显著抑制，血管密度显著下降，48hr后血管新生被完全抑制，血管密度几乎为零，其中50nM为最佳处理浓度。
2.舒尼替尼抑制试验
1)取2mL溶液Ⅱ，37℃预热5min；
2)取育龄雌性Tek-Cre；mTmG卵巢至于预热好的溶液Ⅱ中，使用分离针将卵巢切割成4小块；
3)使用分离针将250-300μm的卵泡沿卵泡边缘切割成边缘光滑且完整的单卵泡，然后将其放入37℃培养箱；
4)在步骤3)结束后，分别取1mL溶液I+溶液III(100:1)与500nM和1000nMSunitinib混匀，并在其中加入cell culture insert,避免气泡，37℃预热5min；
5)使用口吸管移液器，将分离好的卵泡转移到cell culture insert上，卵泡上方不需要多加额外的液体，培养48hr，培养条件为37℃，5％CO2；
6)间隔24hr使用荧光显微镜观察血管新生变化。
7)实验结果见图2，从图2可以看出Sunitinib处理24hr后，血管新生受到显著抑制，血管密度显著下降，48hr后血管新生被完全抑制，血管密度几乎为零，其中1000nM为最佳处理浓度。
8)对Axitinib和Sunitinib的处理结果进行比对，发现如图2和图3所示，50nMAxitinib可以完全抑制血管新生，而Sunitinib需要1000nM达到相同处理效果，因此，相比之下Axitinib的药效更好。
实施例4：培养后卵泡免疫荧光染色
本发明考虑到荧光报告小鼠资源的局限性，因而提供一种利用野生型小鼠使用本体系的操作方法。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。
野生型小鼠由于不具有内源性荧光，因而仅在最后血管新生的观察中与荧光报告小鼠具有操作上的不同，具体实施方式如下：
1)使用移液器，将培养后的卵泡从cell culture inserts上取下，放入4％PFA中，室温固定30min；
2)0.1％Triton处理卵泡30min，然后PBS清洗3次，10min/次；
3)3％BSA(Sigma)室温封闭1hr(此处可以将BSA做成小液滴)；
4)孵育PODXL(山羊源，abcam)，1:100，室温，2hr，然后用PBST清洗3次，10min/次；
5)孵育荧光二抗(Invitiogen)，1:100，室温，避光，1.5hr，然后PBST清洗3次，10min/次，PBS清洗1次；
6)将卵泡转移到PBS液滴中,此处可在液滴中加入抗荧光衰减封片剂1:20；
7)荧光显微镜下观察。结果见图4。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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