用于处理生物样本的固相颗粒材料及生物样本处理方法
阅读说明：本技术 用于处理生物样本的固相颗粒材料及生物样本处理方法 (Solid phase particulate material for processing biological samples and biological sample processing method ) 是由 李明 黄海潮 申保晨 彭涛 孙晓亮 宋东亮 于 2021-07-29 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种用于处理生物样本的固相颗粒材料,所述固相颗粒材料以高分子聚合材料或凝胶材料为核,核内部或核表面可以包含磁性颗粒,磁性颗粒与核的复合结构外部包裹一层聚合物涂层,涂层表面修饰有弱阳离子交换基团,所述弱阳离子交换基团可螯合金属离子并吸附蛋白。本发明还公开了对应的生物样本处理方法,所涉及的原料包括固相颗粒材料以及核酸释放剂。本发明的固相颗粒材料为弱阳离子交换材料,所述的核酸释放剂具有裂解细胞及病毒,抑制核酸降解等作用。本发明提供的试剂和方法可以简单快速的对样本进行处理,释放核酸并去除部分杂质,无需再进行核酸提取纯化步骤,大大节省了时间和物料成本,具有较好的应用价值。(The invention provides a solid-phase particle material for processing a biological sample, which takes a high-molecular polymer material or a gel material as a core, wherein the interior or the surface of the core can contain magnetic particles, a polymer coating is wrapped outside a composite structure of the magnetic particles and the core, and the surface of the coating is modified with weak cation exchange groups which can chelate metal ions and adsorb proteins. The invention also discloses a corresponding biological sample processing method, and the related raw materials comprise a solid-phase particle material and a nucleic acid releasing agent. The solid phase particle material is a weak cation exchange material, and the nucleic acid releasing agent has the effects of cracking cells and viruses, inhibiting nucleic acid degradation and the like. The reagent and the method provided by the invention can simply and quickly process the sample, release the nucleic acid and remove part of impurities, do not need to perform a nucleic acid extraction and purification step, greatly save the time and material cost, and have better application value.)
技术领域
本发明专利涉及一种用于处理生物样本的固相颗粒材料及生物样本处理方法，属于生物技术领域。
背景技术
PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)是一种用于生物体外放大扩增目标DNA片段的分子生物学技术，其是一种高灵敏度、高特异性的快速检测方法，已广泛应用于临床检测和科研领域。核酸检测的前提是需要从待测样本中获得较为纯净的核酸，而传统的核酸提取步骤通常较为费时，虽然自动化核酸提取已经得到广泛使用，但仍要花费较长的时间，通常在30分钟以上，且步骤较为复杂，试剂成本也相对较高。快速释放生物样本中的核酸并直接用于PCR扩增是一种更为简便的方法，但该方法存在的问题是生物样本中含有多种抑制成分，导致PCR扩增效果变差，检测结果不准确，难以进行临床应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于处理生物样本的固相颗粒材料，可用于快速处理生物样本。
本发明采取的技术方案为：一种用于处理生物样本的固相颗粒材料，所述固相颗粒材料以高分子聚合材料或凝胶材料为核，核外部包裹聚合物涂层，涂层表面修饰有弱阳离子交换基团，所述弱阳离子交换基团可螯合金属离子并吸附蛋白。
优选的，所述核采用材料为聚苯乙烯材料、苯乙烯-二乙烯基苯共聚材料、聚甲基丙烯酸甲酯材料、甲基丙烯酸甲酯-二乙烯基苯共聚材料、交联琼脂糖材料、交联壳聚糖材料或交联葡聚糖材料。
优选的，所述固相材料还包括磁性颗粒，所述磁性颗粒吸附于核表面，或者镶嵌于核内部。
优选的，所述磁性颗粒为磁铁矿或赤铁矿，磁性颗粒的比重占固相颗粒材料总量的20％-50％wt。
优选的，磁性颗粒与核的复合结构外部包裹一层聚合物涂层，所述聚合物涂层为聚丙烯酸，聚甲基丙烯酸甲酯，聚甲基丙烯酸缩水甘油酯，苯乙烯-甲基丙烯酸共聚物，丙烯酸-二乙烯基苯共聚物，丙烯酸-丙烯酰胺共聚物，丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物，甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸-二乙烯基苯共聚物，丙烯酸-甲基丙烯酸缩水甘油酯共聚物的一种或多种的组合物，弱阳离子交换基团位于聚合物涂层表面。
优选的，所述弱阳离子交换基团为氮川三乙酸和/或亚氨基二乙酸。
本发明还提供了一种生物样本处理方法，其特征在于将生物样本与上述的固相颗粒材料以及核酸释放剂混合，振荡混匀，室温放置一段时间后离心或者磁吸分离固相，上清液即包含较为纯净的核酸。
优选的，所述核酸释放剂中含有表面活性剂。
优选的，所述表面活性剂为Triton X-100，NP-40，N-月桂酰肌氨酸钠，十二烷基硫酸钠，十二烷基磺酸钠，十二烷基苯磺酸钠，吐温-20，椰油基葡糖苷、月桂基葡糖苷、鲸蜡硬脂基葡糖苷或单硬脂酸甘油酯中的一种或数种。
本发明所提供的固相颗粒材料以及核酸释放剂与待处理样本混合后，可以放入自动化核酸提取仪器中进行核酸提取，实现自动化核酸提取。优选的，所述自动化核酸提取仪器为96通道自动核酸提取仪器。
本发明所提供的自动化生物样本处理方法，能够批量处理生物样本，并且可以极大的缩短获取生物样本核酸所需的时间。
本发明的有益效果为：
1、本发明的固相颗粒材料能够螯合Ca2+，Mg2+等金属阳离子，有效抑制核酸酶活性，保护核酸。
2、本发明的固相颗粒材料具有一定的硬度，可以帮助破碎细胞，释放细胞内容物。
3、本发明的固相颗粒材料可以包含磁性材料，能够被外加磁场吸附，可以方便的将其所吸附的抑制成分去除。
4、本发明的生物样本处理方法中固相颗粒材料能够广泛的结合处理液中的蛋白等杂质，固相颗粒材料对蛋白的吸附不具有特异性，因此可吸附并除去大部分杂质蛋白。经过离心或者外加磁场的方式，使得被吸附的蛋白等杂质很容易被分离，而释放的DNA、RNA则存在于上清液中，极大的提高了获得的核酸纯度。去除杂质后的核酸可直接进行qPCR等下游检测应用，并且有效增强了下游检测应用的效果。
5、本发明实现了自动化的样本处理，配合自动化提取仪器可实现高通量自动化样本处理，并且省去了传统自动化核酸提取过程中的清洗、洗脱等步骤，提取步骤显著少于普通核酸提取，在通常的96通道核酸提取仪器中运行时仅有一个处理步骤，大大节约了物料和操作时间。
6、本发明的生物样本处理方法能够处理多种样本类型，包括口腔拭子样本、唾液样本、尿液样本，血浆样本，分泌物样本等；能够在室温条件下处理样本,并释放样本中的DNA、RNA，无需高温加热处理，且处理时间短，仅需5-10分钟即可去除杂质并获得用于PCR扩增的核酸模板。
附图说明
图1是人工合成假病毒新冠ORF1ab基因荧光RT-PCR检测结果；
图2是人工合成假病毒新冠N基因荧光RT-PCR检测结果；
图3是猪蓝耳疫苗荧光RT-PCR检测结果；
图4是口腔拭子样本荧光PCR检测结果；
图5是口腔拭子样本荧光RT-PCR检测结果；
图6是唾液样本荧光PCR检测结果；
图7是唾液样本荧光RT-PCR检测结果；
图8是唾液样本荧光PCR检测结果。
具体实施方式
为了进一步描述使本发明的具体内容，以下结合实施例对本发明进行详细说明。实施例所涉及的操作方法及试剂为业内技术人员所熟知，应当理解，以下所描述的具体实施例仅仅用于对发明进行详细说明，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制。
本发明的生物样本处理方法为，将生物样本与含有10％固相颗粒材料的核酸释放剂等体积混合后，振荡混匀，室温静置5-10分钟，短暂离心或磁吸后，取上清液即可用于PCR扩增反应。本发明所述的室温具体温度范围为10-35℃。
实施例1琼脂糖固相颗粒材料的制备
取磁性琼脂糖羧基微珠(购自英芮诚生化科技有限公司)悬浮液100mL，吸除上清液，并加入100mL 50mM MES缓冲液(PH值5.0)，充分搅拌使微珠悬浮。继续向上述溶液中加入1g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和1g N-羟基琥珀酰亚胺，充分搅拌30min。搅拌结束后，磁吸去除反应液并用水清洗，继续向中微珠中加入100mL含有1g亚氨基二乙酸的MES缓冲液，充分搅拌5h。反应结束后用纯水清洗微珠即得到固相颗粒材料。
实施例2聚苯乙烯羧基微珠的制备
将5mL苯乙烯加入70mL乙醇和30mL水的混合溶液中，再加入0.1g偶氮二异丁腈，充分搅拌后升温至70℃，搅拌反应3h。反应结束后将高速离心得到聚苯乙烯微球，并用乙醇清洗数次。取2g制得的聚苯乙烯微球，分散在50mL四氢呋喃溶液中，加入1g丁二酸酐，0.05g三氯化铝，搅拌并加热至60℃反应9h。反应结束后高速离心得到聚苯乙烯羧基微珠，并用乙醇清洗数次。
实施例3聚苯乙烯固相颗粒材料的制备
取聚苯乙烯羧基微珠悬浮液100mL，吸除上清液，并加入100mL 50mM MES缓冲液(PH值5.0)，充分搅拌使微珠悬浮。继续向上述溶液中加入1g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和1g N-羟基琥珀酰亚胺，充分搅拌30min。搅拌结束后，离心去除反应液，向中微珠中加入100mL含有1g亚氨基二乙酸的MES缓冲液，充分搅拌5h。反应结束后用纯水清洗微珠即得到固相颗粒材料。
实施例4人工合成假病毒样本的处理
取20uL 106copies/mL COVID-19假病毒(Yeasen，11900ES03)，加入20uL核酸释放剂(或纯水)，加入实施例1制备的琼脂糖微球5uL，上下颠倒混匀，室温静置8min，短暂离心后取上清获得释放后的核酸，进行荧光RT-PCR检测。结果见附图1和附图2，附图1为COVID-19ORF1ab基因检测结果，附图2为COVID-19N基因检测结果。
实施例5猪蓝耳疫苗样本的处理
取10uL猪蓝耳疫苗原液(哈兽研)，加入10uL核酸释放剂(或纯水)，加入实施例1制备的琼脂糖微球5uL，上下颠倒混匀，室温静置10min，短暂离心后取上清获得释放后的核酸，进行荧光RT-PCR检测。结果见附图3。
实施例6口腔拭子样本的处理
取15uL口腔拭子样本(保存于拭子保存液中，取自实验人员)，加入15uL核酸释放剂(或纯水)，加入实施例1制备的琼脂糖微球5uL，上下颠倒混匀，室温静置5min，短暂离心后取上清获得释放后的核酸，对人基因进行荧光PCR检测和荧光RT-PCR检测。结果见附图4和附图5，附图4为荧光PCR检测结果，附图5为RT-PCR检测结果。
实施例7唾液样本的处理
取50uL新鲜唾液(取自实验人员)，加入50uL核酸释放剂(或纯水)，加入实施例3制备的聚合物微球10uL，上下颠倒混匀，室温静置5min，短暂离心后取上清获得释放后的核酸，对人基因进行荧光PCR检测和荧光RT-PCR检测。对照组使用50uL新鲜唾液(取自实验人员)，使用核酸提取试剂盒(天根,DP705)进行核酸提取
结果见附图6和附图7，附图6为荧光PCR检测结果，附图7为RT-PCR检测结果。
实施例8生物样本的自动化处理
将含有10％磁性琼脂糖材料的核酸释放剂加入至96孔板中，每孔100μL。加入完毕后将96孔板进行封膜处理，制作成预装板试剂。
将预装板试剂撕开封膜，向孔中加入100μL唾液样本(取自实验人员)，并将预装板放置于96通道核酸提取仪器(儒克，Purifier HT)的2号位，将空的96孔板和磁棒套放置于1号位，运行提取程序。程序运行结束后，吸取溶液部分作为扩增模板，对人基因进行荧光RT-PCR检测。另取相同来源的100μL唾液，使用核酸提取试剂盒(天根，DP705)进行核酸提取，所提取的核酸作为扩增模板进行荧光RT-PCR检测。
所述提取程序如下：
结果见附图8，附图8为荧光RT-PCR检测结果。
本发明制备的核酸释放剂，核酸释放效果显著，操作简易。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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