一种金花清感颗粒中14种成分的高效液相检测方法
阅读说明：本技术 一种金花清感颗粒中14种成分的高效液相检测方法 (High performance liquid detection method for 14 components in golden flower refreshing granules ) 是由 朱艳慧 刘富岗 李沛霖 刘雅琳 贾永艳 陈俭双 祝侠丽 于 2021-08-13 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种同时测定金花清感颗粒中14种成分的高效液相检测方法,该方法采用高效液相色谱法同时对金花清感颗粒中新绿原酸、马钱苷酸、绿原酸、咖啡酸、獐牙菜苷、连翘酯苷A、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、黄芩苷、连翘苷、牛蒡子苷、汉黄芩苷、黄芩素、白杨素、千层纸素共14中成分进行含量测定,以多组分为指标综合评价金花清感颗粒的质量,具体包括以下步骤：①供试品溶液制备,②混合对照品溶液制备,③高效液相色谱检测条件。该方法简便快速,检测结果稳定可靠,能够应用于金花清感颗粒质量控制评价。(The invention provides a high performance liquid detection method for simultaneously determining 14 components in Jinhuaqinggan granules, which adopts high performance liquid chromatography to simultaneously determine the content of 14 components in the Xinjiang chlorogenic acid, loganin, caffeic acid, swertiamarin, forsythoside A, apigenin-7-O-beta-D-glucopyranoside, baicalin, phillyrin, arctiin, wogonoside, baicalein, chrysin and oroxylin in the Jinhuaqinggan granules, and comprehensively evaluates the quality of the Jinhuaqinggan granules by taking multiple components as indexes, and specifically comprises the following steps: preparing a test solution, preparing a mixed reference solution and detecting conditions by high performance liquid chromatography. The method is simple, convenient and quick, has stable and reliable detection results, and can be applied to quality control evaluation of the golden flower refreshing particles.)
一、
技术领域
本发明涉及一种高效液相色谱法同时测定金花清感颗粒中14种成分的检测方法，属于中药质量控制检测方法技术领域。
二、
背景技术
金花清感方是在2009年中国出现甲流确诊病例后，北京市中医药管理局迅速成立防治甲型H1N1流感专家委员会，并根据我国甲流特点，通过“专家经验、活性筛选、临床反馈”实践结果确定了抗流感活性中药复方金花清感方，其源自麻杏石甘汤和银翘散，并在2010年转让于北京御生堂中医药博物馆。金花清感颗粒即金花清感方，于2016年获得国家新药证书和上市许可，目前由聚协昌(北京)药业有限公司生产，由炙麻黄、知母、青蒿、石膏、金银花、黄芩、炒苦杏仁、连翘、薄荷、浙贝母、牛蒡子、甘草共12味中药组成。金花清感颗粒具有疏风宣肺，清热解毒功效，用于外感时邪引起的发热，恶寒轻或不恶寒，咽红咽痛，鼻塞流涕，口渴，舌质红，苔薄黄，脉数，临床上用于各类流感包括甲型H1N1流感所引起上述症候者，并在新冠肺炎诊疗方案中被推荐用于医学观察期患者。
目前，金花清感颗粒相关研究主要集中于其用于治疗流行性感冒和新冠肺炎的临床评价以及通过网络药理学分析其发挥药效的主要化学成分及相关机制，对于质量控制的研究鲜有报道。药品质量直接关系到药品的安全性和有效性，有必要对金花清感颗粒质量控制检测方法技术进行研究。
三、
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种金花清感颗粒中14种成分同时测定的高效液相检测方法，克服现有技术不足之处使检测结果更全面、准确可靠。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种金花清感颗粒中14种成分同时测定的高效液相检测方法，所述方法为通过高效液相色谱法对金花清感颗粒中的新绿原酸、马钱苷酸、绿原酸、咖啡酸、獐牙菜苷、连翘酯苷A、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、黄芩苷、连翘苷、牛蒡子苷、汉黄芩苷、黄芩素、白杨素、千层纸素14种成分同时进行含量测定。
优选地，所述金花清感颗粒中14种成分同时测定的高效液相检测方法包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：取金花清感颗粒，粉碎，精密称取金花清感颗粒粉末，置于具塞锥形瓶中，精密加入醇溶液，称取具塞锥形瓶加入金花清感颗粒和醇溶液后的总重量，超声提取30～60min，冷却至25℃，再次称重，加醇溶液补足其损失量，摇匀，取上清液过0.22μm微孔滤膜，取续滤液置棕色液相进样瓶中，即得金花清感颗粒供试品溶液；其中，所述金花清感颗粒粉末的质量和醇溶液的体积比为1g：100ml-900ml；
(2)14种混合对照品溶液的制备：分别精密称取新绿原酸、马钱苷酸、绿原酸、咖啡酸、獐牙菜苷、连翘酯苷A、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、黄芩苷、连翘苷、牛蒡子苷、汉黄芩苷、黄芩素、白杨素、千层纸素对照品，分别加甲醇制成14种成分的单一对照品储备液；依次精密吸取上述14种储备液置同一50mL的容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，制得新绿原酸、马钱苷酸、绿原酸、咖啡酸、獐牙菜苷、连翘酯苷A、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、黄芩苷、连翘苷、牛蒡子苷、汉黄芩苷、黄芩素、白杨素、千层纸素对照品质量浓度分别为20.50、14.76、34.66、10.01、50.15、50.11、28.09、194.45、20.17、178.13、64.79、10.14、10.45和10.45μg·mL-1的混合对照品溶液；
(3)色谱条件与系统适用性试验：色谱柱采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C18柱；流动相A为乙腈，流动相B为磷酸水溶液，采用梯度洗脱，流速为1.0mL/min，柱温为25～35℃，进样量为10μL，检测波长为220～240nm，色谱分析时间为95min，理论板数按各自对照品峰计算均应不低于3000，所述梯度洗脱程序为：
0～5min，流动相A为8％→8％，流动相B为92％→92％；
5～30min，流动相A为8％→18％，流动相B为92％→82％；
30～40min，流动相A为18％→20％，流动相B为82％→80％；
40～60min，流动相A为20％→22％，流动相B为80％→78％；
60～75min，流动相A为22％→35％，流动相B为78％→65％；
75～90min，流动相A为35％→45％，流动相B为65％→55％；
90～95min，流动相A为45％→47％，流动相B为55％→53％；
其中，所述流动相A和B的比例均为体积百分比；
(4)测定：分别吸取步骤(1)所述的金花清感颗粒供试品溶液10μL和步骤(2)所述的混合对照品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，按所述步骤(3)所述的色谱条件操作，测得各自的色谱图，并计算峰面积，按照外标一点法测定金花清感颗粒供试品溶液中新绿原酸、马钱苷酸、绿原酸、咖啡酸、獐牙菜苷、连翘酯苷A、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、黄芩苷、连翘苷、牛蒡子苷、汉黄芩苷、黄芩素、白杨素、千层纸素14种成分的含量，计算金花清感颗粒中新绿原酸、马钱苷酸、绿原酸、咖啡酸、獐牙菜苷、连翘酯苷A、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、黄芩苷、连翘苷、牛蒡子苷、汉黄芩苷、黄芩素、白杨素、千层纸素14种成分的含量。
优选地，所述步骤(1)中金花清感颗粒超声提取所用的醇溶液为体积百分比浓度50～70％甲醇溶液，所述金花清感颗粒提取超声提取时间为30min。
优选地，所述步骤(1)中金花清感颗粒粉末的质量和醇溶液的体积比为1g：200ml
优选地，所述步骤(3)中流动相B磷酸水溶液的体积百分比浓度为0.05～0.3％。
优选地，所述步骤(3)中流动相B磷酸水溶液的体积百分比浓度为0.1％。
优选地，所述步骤(3)中检测柱温为30℃，检测波长为230nm。
本发明的有益效果至少包括：
1.本发明所述的金花清感颗粒中14种成分的高效液相检测方法，采用高效液相色谱法对金花清感颗粒中的3个有机酸类成分：新绿原酸、绿原酸、咖啡酸；2个环烯醚萜类成分：马钱苷酸、獐牙菜苷；3个木脂素类成分：连翘酯苷A、连翘苷、牛蒡子苷；6个黄酮类成分：芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、白杨素、千层纸素，共4大类成分的14种成分同时进行含量测定，以多组分为指标能够从整体上全面评价金花清感颗粒的内在质量；
2.本发明所述的高效液相色谱法测定金花清感颗粒中14种成分含量的方法操作简便，灵敏度高且稳定可靠，可作为金花清感颗粒质量检测的常规方法；
3.本发明所述的对金花清感颗粒的质量检测方法可以用于评价终产品或中间体的质量，对生产过程的监控和管理具有重要意义。
附图说明
图1为实施例1中新绿原酸、马钱苷酸、绿原酸、咖啡酸、獐牙菜苷、连翘酯苷A、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、黄芩苷、连翘苷、牛蒡子苷、汉黄芩苷、黄芩素、白杨素和千层纸素共14种成分的混合对照品高效液相色谱图；
图2为实施例1中金花清感颗粒供试品溶液高效液相色谱图；
图3为实施例1中空白溶剂高效液相色谱图；
图4为实施例3中混合对照品检测波长筛选的高效液相色谱图；
图5为实施例4中测试组1的60min梯度洗脱程序测得的高效液相色谱图；
图6为实施例4中测试组2的65min梯度洗脱程序测得的高效液相色谱图；
图7为实施例4中测试组3的70min梯度洗脱程序测得的高效液相色谱图；
图8为实施例4中测试组4的75min梯度洗脱程序测得的高效液相色谱图；
图9为实施例4中测试组5的80min梯度洗脱程序测得的高效液相色谱图；
图10为实施例4中测试组6的85min梯度洗脱程序测得的高效液相色谱图；
图11为实施例4中测试组7的90min梯度洗脱程序测得的高效液相色谱图；
图12为实施例4中测试组8的110min梯度洗脱程序测得的高效液相色谱图；
图13为盐酸麻黄碱对照品检测波长为207nm测得的高效液相色谱图；
图14为盐酸伪麻黄碱对照品检测波长为207nm测得的高效液相色谱图；
图15为实施例1中金花清感颗粒供试品检测波长为207nm测得的高效液相色谱图；
图16为盐酸麻黄碱对照品检测波长为257nm测得的高效液相色谱图；
图17为盐酸伪麻黄碱对照品检测波长为257nm测得的高效液相色谱图；
图18为实施例1中金花清感颗粒供试品检测波长为257nm测得的高效液相色谱图。
四、
具体实施方式
下面结合具体实施例，详细说明本发明金花清感颗粒的质量检测方法，但本发明的保护范围不局限于此。
一、检测方法分析
实施例1
本发明的金花清感颗粒的质量检测方法的一种实施例，其具体步骤如下：
实验材料与试剂：金花清感颗粒(规格：5g/袋)10批，批号依次为20200106、20200114、20200239、20200601、20200909、20201005、20201008、20201101，均购自聚协昌(北京)药业有限公司(生产企业)；批号依次为200501、200504，均购自天士力医药集团股份有限公司(生产企业)，将10批金花清感颗粒编号分别为J1～J10。马钱苷酸对照品(纯度97.5％，批号111865-202005)、绿原酸对照品(纯度96.1％，批号110753-202018)、咖啡酸对照品(纯度99.7％，批号110885-201703)、连翘酯苷A(纯度97.2％，批号111810-201707)、连翘苷对照品(纯度94.9％，批号110821-202117)、汉黄芩苷对照品(纯度98.5％，批号112002-201702)、黄芩素对照品(纯度97.9％，批号111595-201808)、白杨素对照品(纯度98％，批号111701-200501)、盐酸麻黄碱(纯度100％，批号171241-201809)、盐酸伪麻黄碱(纯度99.80％，批号171237-201510)均购自中国食品药品检定研究院。新绿原酸(纯度≥98％，批号M07GB140938)、獐牙菜苷(纯度≥98％，批号P25O10F101344)、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(纯度≥98％，批号Y29M10H84489)、黄芩苷(纯度≥98％，批号P20A9F59353)、牛蒡子苷(纯度≥98％，批号R12O8F45507)、千层纸素(纯度≥98％，批号Y03M11H109208)均购自上海源叶生物科技有限公司。甲醇、乙腈(色谱级，美国Fisher公司)；磷酸(优级纯GR，国药集团化学试剂有限公司)；异丙醇(色谱纯，山东禹王和天下新材料有限公司)；超纯水为实验室自制(优普系列超纯水机)。
供试品溶液制备：取金花清感颗粒，粉碎，取金花清感颗粒粉末约0.10g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入50％甲醇20mL，称重，超声30min使其溶解后，放冷，再称重，加50％甲醇补足其损失量，摇匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，置棕色液相进样瓶中，即得。
14种混合对照品溶液的制备：分别精密称取新绿原酸、马钱苷酸、绿原酸、咖啡酸、獐牙菜苷、连翘酯苷A、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、黄芩苷、连翘苷、牛蒡子苷、汉黄芩苷、黄芩素、白杨素、千层纸素对照品，分别加甲醇溶解制成14种成分的单一对照品储备液；依次精密吸取上述14种储备液置同一50mL的容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，制得新绿原酸、马钱苷酸、绿原酸、咖啡酸、獐牙菜苷、连翘酯苷A、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、黄芩苷、连翘苷、牛蒡子苷、汉黄芩苷、黄芩素、白杨素、千层纸素对照品质量浓度分别为20.50、14.76、34.66、10.01、50.15、50.11、28.09、194.45、20.17、178.13、64.79、10.14、10.45和10.45μg·mL-1的混合对照品溶液。
色谱条件与系统适用性试验：色谱柱采用Agilent-Eclipse XDB-C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)；以乙腈(A)-0.1％的磷酸水(B)为流动相，梯度洗脱，流速为1.0mL/min，柱温为30℃，进样量为10μL，检测波长为230nm，色谱分析时间为95min，理论板数按各自对照品峰计算均应不低于3000。
测定：分别精密吸取供试品溶液与混合对照品溶液各10μL，分别注入液相色谱仪按表1梯度洗脱条件进行检测，得到如图1～3所示的色谱图，图1为新绿原酸、马钱苷酸、绿原酸、咖啡酸、獐牙菜苷、连翘酯苷A、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、黄芩苷、连翘苷、牛蒡子苷、汉黄芩苷、黄芩素、白杨素和千层纸素共14种成分的混合对照品高效液相色谱图，图2为金花清感颗粒供试品高效液相色谱图，图3为空白溶剂高效液相色谱图。
表1梯度洗脱时间表
实施例2
本发明的金花清感颗粒提取方法采用超声提取法，考察了溶剂种类、溶剂体积以及超声时间三个因素对14种化学成分提取效率的影响，按实施例1色谱条件进行测定，记录峰面积。
①五种提取溶剂的考察：分别精密称取金花清感颗粒0.0989g、0.1051g、0.1080g、0.0989g、0.0995g共五份，分别加入纯水、30％、50％、70％甲醇以及纯甲醇各50mL，超声30min使其溶解后，0.22μm微孔滤膜滤过后，分别取10μL注入液相色谱仪按表1梯度洗脱条件进行检测，求得14种成分总含量，结果见表2。
表2五种提取溶剂试验结果(mg·g-1)
②七种提取溶剂体积的考察：分别精密称取金花清感颗粒0.1018g、0.1009g、0.1028g、0.1022g、0.1022g、0.1024g、0.1023g共七份，分别加入50％甲醇10mL、15mL、20mL、30mL、50mL、70mL以及90mL，超声30min使其溶解后，0.22μm微孔滤膜滤过后，分别取10μL注入液相色谱仪按表1梯度洗脱条件进行检测，求得14种成分总含量，结果见表3。
表3七种提取溶剂体积试验结果(mg·g-1)
③五种不同超声时间的考察：分别精密称取金花清感颗粒0.1002g、0.1009g、0.1008g、0.1009g、0.1003g共五份，加入50％甲醇30mL，分别超声20min、30min、45min、60min以及90min，0.22μm微孔滤膜滤过后，分别取10μL注入液相色谱仪按表1梯度洗脱条件进行检测，求得14种成分总含量，结果见表4。
表4五种超声时间试验结果(mg·g-1)
综上所述，根据对影响金花清感颗粒提取效率的不同因素的考察结果，最后确定的供试品提取方法为0.10g金花清感颗粒加入50％甲醇20mL，超声提取30min，滤过即得。
实施例3
在紫外检测器全波长下对对照品溶液进行扫描，综合考虑新绿原酸、马钱苷酸、绿原酸、咖啡酸、獐牙菜苷、连翘酯苷A、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、黄芩苷、连翘苷、牛蒡子苷、汉黄芩苷、黄芩素、白杨素、千层纸素的紫外吸收波长，分别比较了其在230nm、246nm、280nm、330nm处，色谱峰个数及峰面积，结果显示在230nm处均有良好吸收，基线较平稳，故选择230nm为检测波长，对应的色谱图如图4所示。
实施例4
测试对象：金花清感颗粒供试品溶液(作为对照组)注入液相色谱仪后采用不同梯度洗脱程序，其他步骤和具体参数都与实施例1相同：
与实施例1相比，测试组1的区别在于：供试品金花清感颗粒0.30g，梯度洗脱程序见表5，对应的色谱图如图5所示；
表5测试组1梯度洗脱时间表
与实施例1相比，测试组2的区别在于：供试品金花清感颗粒0.30g，梯度洗脱程序见表6，对应的色谱图如图6所示；
表6测试组2梯度洗脱时间表
与实施例1相比，测试组3的区别在于：供试品金花清感颗粒0.30g，梯度洗脱程序见表7，对应的色谱图如图7所示；
表7测试组3梯度洗脱时间表
与实施例1相比，测试组4的区别在于：供试品金花清感颗粒0.30g，梯度洗脱程序见表8，对应的色谱图如图8所示；
表8测试组4梯度洗脱时间表
与实施例1相比，测试组5的区别在于：供试品金花清感颗粒0.30g，梯度洗脱程序见表9，对应的色谱图如图9所示；
表9测试组5梯度洗脱时间表
与实施例1相比，测试组6的区别在于：供试品金花清感颗粒0.30g，梯度洗脱程序见表10，对应的色谱图如图10所示；
表10测试组6梯度洗脱时间表
与实施例1相比，测试组7的区别在于：供试品金花清感颗粒0.30g，梯度洗脱程序见表11，对应的色谱图如图11所示；
表11测试组7梯度洗脱时间表
与实施例1相比，测试组8的区别在于：供试品金花清感颗粒0.10g，梯度洗脱程序见表12，对应的色谱图如图12所示；
表12测试组8梯度洗脱时间表
其中，所述A和B的比例均为体积百分比。
测试方法：按照实施例1的检测方法进行测试；
测试结果：与图2相比，图6、图7、图8、图10和图11中牛蒡子苷峰面积均高于同一图中黄芩苷峰面积，可能是由于其分离效果差，多峰重合引起峰面积增加。总之，图5～图12各测试组中相应指标成分的色谱峰分离度均达不到要求。因此，通过大量试验表明，实施例1的检测方法为金花清感颗粒的最佳质量检测方法。
二、方法学验证
(一)专属性试验
按照实施例1检测方法，分别精密吸取供试品溶液与混合对照品溶液各10μL，注入液相色谱仪按表1梯度洗脱条件进行检测，得到如图1～3所示的色谱图，图1为新绿原酸、马钱苷酸、绿原酸、咖啡酸、獐牙菜苷、连翘酯苷A、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、黄芩苷、连翘苷、牛蒡子苷、汉黄芩苷、黄芩素、白杨素和千层纸素共14种成分的混合对照品高效液相色谱图，图2为金花清感颗粒供试品高效液相色谱图，图3为空白溶剂高效液相色谱图。由图可知，对照品色谱图与供试品色谱图相同保留时间处都有相应色谱峰，各待测成分与相邻成分均能达到基线分离，阴性样品溶液无干扰，说明本方法专属性好，符合含量测定要求。
(二)线性关系考察
按照实施例1检测方法，精密吸取混合对照品适量，加甲醇稀释得系列梯度浓度的混合对照品溶液，测得色谱图，记录峰面积。以对照品溶液的质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归，得到14种成分的线性回归方程，见表13。结果可知各成分在相应浓度范围内线性关系良好。
(三)检测限和定量限考察
按照实施例1检测方法，精密吸取混合对照品溶液适量，加甲醇等倍逐步稀释，在不同稀释倍数下，分别进行6次进样检测，根据信噪比S/N＝3计算得到各成分的检测限，根据S/N＝10计算得到各成分定量限。结果见表13。
表13 14种成分的线性关系考察、检测限及定量限
(四)精密度试验
按照实施例1检测方法，精密吸取混合对照品溶液10μL，连续进样测定6次，记录峰面积。计算得到新绿原酸、马钱苷酸、绿原酸、咖啡酸、獐牙菜苷、连翘酯苷A、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、黄芩苷、连翘苷、牛蒡子苷、汉黄芩苷、黄芩素、白杨素、千层纸素峰面积的RSD值分别为0.43％、0.38％、0.42％、0.31％、0.31％、0.52％、0.21％、0.20％、0.30％、0.24％、0.20％、0.22％、0.29％、0.48％，均小于3％，表明仪器精密度良好。
(五)稳定性试验
按照实施例1检测方法，取金花清感颗粒(批号：20200106)粉末约0.10g，精密称定，制备供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24h进行进样测定，记录峰面积。结果显示新绿原酸、马钱苷酸、绿原酸、咖啡酸、獐牙菜苷、连翘酯苷A、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、黄芩苷、连翘苷、牛蒡子苷、汉黄芩苷、黄芩素、白杨素、千层纸素峰面积的RSD值分别为0.87％、1.69％、0.08％、2.26％、0.40％、0.21％、0.42％、0.10％、2.18％、0.05％、0.19％、2.57％、2.09％、2.74％，RSD值均小于3％，表明供试品溶液在室温24h内稳定性良好。
(六)重复性试验
按照实施例1检测方法，取金花清感颗粒(批号：20200106)粉末约0.10g，精密称定，平行制备供试品溶液6份，进样测定，记录峰面积。结果显示新绿原酸、马钱苷酸、绿原酸、咖啡酸、獐牙菜苷、连翘酯苷A、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、黄芩苷、连翘苷、牛蒡子苷、汉黄芩苷、黄芩素、白杨素、千层纸素含量的RSD值分别为0.48％、1.65％、0.13％、2.28％、0.59％、0.48％、0.50％、0.26％、1.99％、0.15％、0.36％、1.72％、1.95％、2.15％，表明该方法重复性良好。
(七)加样回收率试验
按照实施例1检测方法，取已知含量的金花清感颗粒(批号：20200106)粉末约0.05g，精密称定，平行制备供试品溶液9份，分别加入新绿原酸16.40μg·mL-1、马钱苷酸3.41μg·mL-1、绿原酸8.52μg·mL-1、咖啡酸2.34μg·mL-1、獐牙菜苷22.36μg·mL-1、连翘酯苷A25.01μg·mL-1、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷12.72μg·mL-1、黄芩苷152.10μg·mL-1、连翘苷4.18μg·mL-1、牛蒡子苷202.00μg·mL-1、汉黄芩苷29.68μg·mL-1、黄芩素3.90μg·mL-1、白杨素2.20μg·mL-1、千层纸素2.09μg·mL-1的混合对照品溶液0.125mL、0.25mL、0.5mL各三份，制备供试品溶液，进样测定，记录峰面积，计算加样回收率及RSD值，计算结果见表14。
表14金花清感颗粒中14种成分的加样回收试验(n＝9)
(八)样品含量测定
金花清感颗粒(规格：5g/袋)10批，批号依次为20200106、20200114、20200239、20200601、20200909、20201005、20201008、20201101，均购自聚协昌(北京)药业有限公司(生产企业)；批号依次为200501、200504，均购自天士力医药集团股份有限公司(生产企业)，将10批金花清感颗粒编号分别为J1～J10。按照实施例1检测方法对购买的10批金花清感颗粒进行14种成分含量测定，结果见表15。
表15金花清感颗粒中14种成分含量测定结果(mg·g-1，n＝3)
10批金花清感颗粒中新绿原酸、马钱苷酸、绿原酸、咖啡酸、獐牙菜苷、连翘酯苷A、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、黄芩苷、连翘苷、牛蒡子苷、汉黄芩苷、黄芩素、白杨素、千层纸素的含量范围分别在1.19～1.42、0.20～0.37、6.51～7.72、0.20～0.25、2.12～2.80、1.75～2.46、0.89～1.14、14.41～16.58、0.41～0.64、15.85～20.01、2.80～3.44、0.38～0.53、0.02～0.03、0.07～0.11mg·g-1之间，10批次样品的HPLC色谱图相似度较高，新绿原酸、马钱苷酸等14种成分为不同批次金花清感颗粒的共有成分，各批次样品间待测成分含量有较小差异，可能与药材来源和生产工艺稳定性有关。
金花清感颗粒化学成分主要有黄酮类、皂苷类、环烯醚萜类、木脂素类、有机酸类、挥发油类，这些成分相互作用共同发挥发汗解热、抗菌、抗病毒等活性。前期研究拟以金花清感颗粒处方药物中具有抗病毒、抗炎和调节免疫的作用的主要有效成分盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、新绿原酸、马钱苷酸、绿原酸、咖啡酸、獐牙菜苷、连翘酯苷A、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、木犀草苷、黄芩苷、连翘脂素、连翘苷、牛蒡子苷、汉黄芩苷、黄芩素、白杨素和千层纸素等成分共同作为测定指标，进行金花清感颗粒的含量测定研究。图13～18结果显示样品中盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱含量较低；木犀草苷含量较低以及连翘脂素在此检测方法下分离度达不到《中国药典》要求，供试品色谱中无法检出或由于含量较低可能导致测定结果误差较大，不宜作为定量指标，木犀草苷和连翘脂素高效液相色谱图未显示。因此，通过方法学考察，建立了同时测定新绿原酸、马钱苷酸、绿原酸、咖啡酸、獐牙菜苷、连翘酯苷A、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、黄芩苷、连翘苷、牛蒡子苷、汉黄芩苷、黄芩素、白杨素和千层纸素共14种成分的高效液相检测方法，选择多组分为指标进行定量质控可以全面、科学地评价金花清感颗粒的内在质量。
金花清感颗粒中化学成分复杂，14种成分有较宽的的极性范围，通过文献分析和反复试验，选择了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1％磷酸水、乙腈-0.1％磷酸水溶液以及流动相B酸性水溶液所用磷酸、甲酸、乙酸，三氟乙酸四种不同浓度的酸，作为流动相进行考察，结果表明，以乙腈-0.1％磷酸水溶液作为流动相进行梯度洗脱，可在95min完成14种成分的同时测定，其色谱峰峰形较好，分离度较高，均大于1.5。根据14种成分200～400nm全波长扫描的结果，新绿原酸、绿原酸在330nm处有最大吸收，黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素在278nm处有最大吸收，连翘苷、牛蒡子苷在230nm处有较大吸收，综合考虑，在230nm处均有良好吸收，基线较平稳，故确定230nm为检测波长。考察了不同柱温(30℃、35℃、40℃、45℃)、流动相及流动相比例和检测波长等色谱条件，得到最佳色谱条件。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管已参照实施例对本发明作了详细说明，但本领域的技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。