具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

<实施例1>

一种植物细菌性维管束病害的人工接种方法，包括以下步骤：

步骤1)、菌液的制备：将购买的桑肠杆菌接种于NA培养基上，30℃培养24h后再转接一次，用灭菌的0.2mol/L的PB缓冲液将平板上的菌苔洗下，并制备成菌体浓度为0.5×10⁸cfu/mL的菌悬液；

步骤2)、离体枝条的处理：从桑树上剪取顶部带有4片展开叶片的新生的枝条，放入75％的乙醇溶液中消毒1min后，用灭菌水冲洗3次；

步骤3)、接种：将枝条插入装有1/3体积菌悬液的三角瓶中，并用无菌棉花包住枝条封口固定，再置于人工气候箱中培养。

<实施例2>

一种植物细菌性维管束病害的人工接种方法，包括以下步骤：

步骤1)、菌液的制备：将购买的桑肠杆菌接种于NA培养基上，30℃培养24h后再转接一次，用灭菌的0.25mol/L的PB缓冲液将平板上的菌苔洗下，并制备成菌体浓度为1×10⁸cfu/mL的菌悬液；

步骤2)、离体枝条的处理：从桑树上剪取顶部带有4片展开叶片的新生的枝条，放入75％的乙醇溶液中消毒2min后，用灭菌水冲洗3次；

步骤3)、接种：将枝条插入装有1/3体积菌悬液的三角瓶中，并用无菌棉花包住枝条封口固定，再置于人工气候箱中培养。

<实施例3>

一种植物细菌性维管束病害的人工接种方法，包括以下步骤：

步骤1)、菌液的制备：将购买的桑肠杆菌接种于NA培养基上，30℃培养24h后再转接一次，用灭菌的0.3mol/L的PB缓冲液将平板上的菌苔洗下，并制备成菌体浓度为1.5×10⁸cfu/mL的菌悬液；

步骤2)、离体枝条的处理：从桑树上剪取顶部带有4片展开叶片的新生的枝条，放入75％的乙醇溶液中消毒3min后，用灭菌水冲洗3次；

步骤3)、接种：将枝条插入装有1/3体积菌悬液的三角瓶中，并用无菌棉花包住枝条封口固定，再置于人工气候箱中培养。

<实施例4>

与<实施例2>不同在于，一种植物细菌性维管束病害的人工接种方法，步骤2)中，枝条从桑树上剪取后，立即插入无菌水中，并避光放置24h，再选择长势一致且健康的枝条进行消毒；其他步骤及参数与实施例2相同。

<实施例5>

与<实施例2>不同在于，一种植物细菌性维管束病害的人工接种方法，步骤3)之前对枝条进行处理，首先用灭菌手术刀在枝条的中下部切开四个十字伤口，四个十字伤口沿竖直方向呈螺旋排布，再将浸泡有玉米素和赤霉素混合液的无菌脱脂棉包住四个十字伤口，并用保鲜膜包裹保湿，保持1h后，拆除保鲜膜和脱脂棉，即完成对枝条的处理；马上将处理后的枝条插入菌悬液中，任一十字伤口不插入菌悬液中；其中，玉米素和赤霉素混合液的浓度为100mg/kg，玉米素和赤霉素的质量比为1:3，任一十字伤口的长度为枝条的周长的1/3，深度为4mm；其他步骤及参数与实施例2相同。

<实施例6>

与<实施例2>不同在于，一种植物细菌性维管束病害的人工接种方法，步骤2)中，枝条从桑树上剪取后，立即插入无菌水中，并避光放置24h，再选择长势一致且健康的枝条进行消毒；步骤3)之前对枝条进行处理，首先用灭菌手术刀在枝条的中下部切开四个十字伤口，四个十字伤口沿竖直方向呈螺旋排布，再将浸泡有玉米素和赤霉素混合液的无菌脱脂棉包住四个十字伤口，并用保鲜膜包裹保湿，保持1h后，拆除保鲜膜和脱脂棉，即完成对枝条的处理；马上将处理后的枝条插入菌悬液中，任一十字伤口不插入菌悬液中；其中，玉米素和赤霉素混合液的浓度为100mg/kg，玉米素和赤霉素的质量比为1:3，任一十字伤口的长度为枝条的周长的1/3，深度为4mm；其他步骤及参数与实施例2相同。

<对比例1>

采用注射菌液法进行接种，与<实施例2>不同在于，步骤3)、接种：将枝条插入装有1/3体积0.25mol/L的PB缓冲液的三角瓶中，用无菌棉花包住枝条封口固定，用灭菌注射器抽取菌悬液，并在第2～4张叶片的叶腋处注射约0.02ml菌悬液；其他步骤及参数与实施例2相同。

<对比例2>

采用针刺法进行接种，与<实施例2>不同在于，步骤1)、菌苔的制备：将购买的桑肠杆菌划线或涂布于NA培养基上，30℃培养24h后再转接一次，待菌苔长出备用；

步骤3)、接种：将枝条插入装有1/3体积0.25mol/L的PB缓冲液的三角瓶中，用无菌棉花包住枝条封口固定，用灭菌的牙签蘸取菌苔，刺入第2～4张叶片的叶腋处，刺入深度约3mm，刺伤后将牙签拔出；其他步骤及参数与实施例2相同。

<对比例3>

采用菌液灌根法进行接种，与<实施例2>不同在于，步骤2)、桑苗的培育：将消毒后的桑种子于28℃的恒温箱中催芽，再将幼苗移栽于装有灭菌育苗土培养袋中，1个培养袋中移栽1株幼苗，直至桑苗长出5～6片真叶；

步骤3)、接种：在桑苗的一侧距根基部1cm处用无菌刀造成根部伤口，再在伤口部位灌注约50ml菌悬液，每隔1d灌注1次，共灌注3次；其他步骤及参数与实施例2相同。

<对比例4>

与<实施例2>不同在于，步骤1)中，用灭菌的0.25mol/L的PBS缓冲液将平板上的菌苔洗下，并制备成菌体浓度为1×10⁸cfu/mL的菌悬液；其他步骤及参数与实施例2相同。

<对比例5>

与<实施例2>不同在于，步骤1)中，用灭菌水将平板上的菌苔洗下，并制备成菌体浓度为1×10⁸cfu/mL的菌悬液；其他步骤及参数与实施例2相同。

<接种效果评价>

采用实施例1～6和对比例1～5的方法进行接种处理，桑树的品种为桂桑优12，每个处理20个重复，以接种0.25mol/L的PB缓冲液为对照组1，接种0.25mol/L的PBS缓冲液为对照组2，接种无菌水为对照组3；人工气候箱内的温度为32℃，湿度为95％，光照为第1天24h黑暗，第2天6h光照、18h黑暗，第3天后12h光照、12h黑暗；第2天后的光照强度为5000lx；

结果观察与病情调查：接种培养后每天观察发病情况，接种培养7天后进行病情调查，统计并计算发病率和病情指数，其中，病情调查采用的病害分级标准为：

0级，无症状；

1级，1张叶片萎蔫或枯萎坏死；

2级，2张叶片萎蔫或枯萎坏死；

3级，3张叶片萎蔫或枯萎坏死；

4级，4张叶片萎蔫或枯萎坏死；

发病率(％)＝(发病株数/接种总株数)×100％；

病情指数＝[∑(各级病级代表值×该级病株数)/(调查总株数×4)]×100。

表1桑树细菌性枯萎病病原菌采用不同人工接种方法的致病率的比较

从表1可知，相较于对比例1～3，实施例2的发病率和病情指数均显著提高，由此可见，本发明选用枝条作为接种材料置于菌悬液中进行接种，能够对木本植株进行植物细菌性维管束病害的人工接种，具有操作简单，实验周期短，接种效果高效且稳定的有益效果；而且，相较于对比例4～5，实施例2的发病率和病情指数均明显提高，使用PB缓冲液制备菌悬液，接种效果更好；

相较于实施例2，实施例4的发病率的标准差和病情指数的标准差均明显降低，且相较于实施例5，实施例6的发病率的标准差和病情指数的标准差也均明显降低，由此可见，枝条从木本植物上剪取后，立即插入无菌水中，并避光放置24h，再选择长势一致且健康的枝条进行消毒，能够进一步降低实验误差，提高接种效果的稳定性和可靠性；

相较于实施例2，实施例5的发病率和病情指数均显著提高，由此可见，枝条在接种前通过玉米素和赤霉素溶液对十字伤口进行处理，有利于促进枝条内有机物质的转运，维持枝条的生长活性，从而能够进一步提高接种效果的可靠性、稳定性和高效性；

另外，实施例1～4和对比例4～5的枝条在接种3天后，叶片开始出现明显的萎蔫症状，接种7天后，叶片卷曲、焦枯(图1)，剥开枝条表皮，枝条木质部变褐色；实施例5～6的枝条在接种2天后，叶片开始出现明显的萎蔫症状，接种7天后剥开表皮，枝条木质部呈褐色；对比例1～2的枝条在接种后4天，叶片开始出现萎蔫症状，接种7天后剥开表皮，枝条木质部变褐色，对比例3和对照组1～3均叶片均未出现明显的萎蔫症状，剥开表皮，枝条木质部未出现褐色；由此可见，本发明具有接种效果高效且稳定的有益效果。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。