一种用于血培养报阳样品预处理的试剂盒及方法
阅读说明：本技术 一种用于血培养报阳样品预处理的试剂盒及方法 (Kit and method for pretreatment of blood culture positive reporting sample ) 是由 徐健 韩霄 徐腾 朱鹏飞 籍月彤 于 2020-05-26 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种用于血培养报阳样品预处理的试剂盒及方法,所述试剂盒包括保护液、聚沉液；所述保护液含有蛋白胨,牛肉浸粉、牛心浸出粉或牛脑浸出粉中的一种,可溶性淀粉,氯化钠,水；所述聚沉液含有阳离子聚合物,水。所述试剂盒能够实现报阳血培养瓶内微生物与活性炭的有效分离,获得包含微生物的澄清菌液,继而进行培养或其他检测。该试剂盒操作方法简便、耗时短、微生物亲和性高,在临床上具有广泛的应用前景。(The invention provides a kit and a method for pretreating a blood culture newspaper positive sample, wherein the kit comprises a protective solution and a coagulation solution; the protective solution contains one of peptone, beef extract powder, beef heart extract powder or beef brain extract powder, soluble starch, sodium chloride and water; the coagulation liquid contains cationic polymer and water. The kit can realize effective separation of microorganisms and active carbon in the yang blood culture bottle, obtain clarified bacterial liquid containing the microorganisms, and then culture or other detection is carried out. The kit has the advantages of simple and convenient operation method, short time consumption and high microbial affinity, and has wide application prospect clinically.)
技术领域
本发明涉及临床病原微生物检测前处理技术领域，具体涉及一种用于血培养报阳样品预处理的试剂盒及方法。
背景技术
血流感染(Bloodstream Infection,BSIs)是各种病原微生物(包括细菌、真菌等)入侵血液所引起的感染，是一种严重的全身感染性疾病，包括菌血症和败血症。许多欧美发达国家血流感染的病死率高达12％～20％，是造成病人死亡的主要原因之一。其中超过50％的病例发生在≥65岁的老年人群中，老年病人因免疫力下降、常伴有基础性疾病、营养不良和血流感染症状不典型等原因，导致感染发生率增加。近年来，我国基础医疗建设获得长足发展，机械通气、静脉导管留置、内窥镜等侵入性、创伤性诊断和治疗手段得到广泛应用，然而却成为血流感染的常见感染途径。此外，广谱抗生素、皮质激素和免疫抑制剂等不合理使用的现象依然存在，这些因素导致我国血流感染的发病率和病死率呈逐年升高趋势且耐药性逐渐增强。
血培养是血流感染诊断的金标准，准确、快速的血培养结果可以更好的指导临床科学合理用药，提高患者生存率和治愈率。但是，抗生素的滥用严重影响了血培养的真实阳性检出率。为保证血培养真实阳性检出率，临床常选用含有中和剂或吸附剂的血培养瓶，目前较常用的吸附剂为活性炭和树脂。国内外有多篇关于两类血培养瓶在抗生素吸附性能、阳性报警时间、阳性检出率等方面相比较的报道，普遍结论为二者各有优劣，联合使用比单独使用一类血培养瓶更具优势。
血培养报阳后，需进行菌种鉴定和药敏检测等后续检测，目前临床采用的方法除传统培养鉴定方法外，还包括基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法、PCR扩增和探针杂交法、流式细胞术、单细胞拉曼光谱检测等新型检测方法。树脂吸附血培养瓶经简单处理后，即可与传统或上述新型检测方法联用。但活性炭吸附血培养瓶因报阳后微生物与活性炭难以分离，限制了其应用。
发明内容
为解决现有技术中活性炭吸附血培养瓶因报阳后微生物与活性炭难以分离而导致应用受限的关键问题。本发明提供了一种用于临床活性炭吸附血培养瓶血培养报阳样品预处理的试剂盒。所述试剂盒可通过改变报阳血培养瓶溶液环境，引起活性炭自发聚沉，从而实现微生物(包括革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、真菌等)与活性炭的分离，获得可用于血培养报阳样品菌种鉴定和药敏检测的微生物样品。
经该试剂盒处理的样品可进行培养、质谱检测、DNA提取和单细胞拉曼检测等后续操作。
为实现上述目的，本发明一方面提供了一种用于血培养报阳样品预处理的试剂盒，所述试剂盒包括保护液、聚沉液；
所述保护液含有蛋白胨，牛肉浸粉、牛心浸出粉或牛脑浸出粉中的一种，可溶性淀粉，氯化钠，水；
所述聚沉液含有阳离子聚合物，水。
所述蛋白胨为胰蛋白胨、蛋白胨或大豆蛋白胨中的一种。
在另一优选例中，所述保护液含有1.00–8.00％(质量分数)蛋白胨，4.00–10.00％(质量分数)牛肉浸粉、牛心浸出粉或牛脑浸出粉中的一种，0.50–0.80％(质量分数)可溶性淀粉，0.50–1.00％(质量分数)氯化钠，余量为水。
在另一优选例中，所述保护液含有1.00–8.00％(质量分数)蛋白胨，4.00–10.00％(质量分数)牛肉浸粉、牛心浸出粉或牛脑浸出粉中的一种，0.50–0.80％(质量分数)可溶性淀粉，0.50–1.00％(质量分数)氯化钠，0.25–0.50％(质量分数)磷酸氢二钠，余量为水。
所述聚沉液含有阳离子聚合物，水。
所述聚沉液含有0.67-300‰(体积分数)阳离子聚合物，余量为水。
在另一优选例中，所述聚沉液含有0.67-300‰(体积分数)阳离子聚合物，0.5-1.0％(质量分数)氯化钠，余量为水。
在另一优选例中，所述阳离子聚合物为聚溴化己二甲铵、聚羟乙基纤维素醚季铵盐、阳离子聚丙烯酰胺、聚二烯丙基二甲基氯化铵、阳离子淀粉或饱和硫酸铝钾溶液中的一种。
所述保护液各成分的含量为：
所述聚沉液各成分的含量为：
在另一优选例中，所述试剂盒还包括离心管。
在另一优选例中，所述离心管为1.5mL离心管。
在另一优选例中，所述试剂盒有效期至少为1年。
本发明又一方面提供了一种血培养报阳样品预处理方法，包括以下步骤：
S1：建立活性炭聚沉体系，包括将血培养报阳样品、保护液及聚沉液混匀；
S2：活性炭的聚沉与微生物样品的取出，具体包括将步骤S1中建立的活性炭聚沉体系离心处理，收集包含微生物样品的上清液。
在另一优选例中，所述步骤S2获得的微生物样品可继续培养，进行传统菌种鉴定与药敏检测，也可根据后续检测需要，进行DNA提取或孵育等操作。
在另一优选例中，所述步骤S2获得的微生物样品若不是立即使用，应按照微生物冻存操作，将其固定冻存。
在另一优选例中，所述步骤S1建立活性炭聚沉体系，具体包括：S11取占总体积70-95％的血培养报阳样品于洁净离心管中；S12加入占总体积5-30％的保护液；S13根据加入保护液的体积，按照5:1-50:1的体积比加入聚沉液。
所述活性炭聚沉体系各组成部分的体积含量为：
在另一优选例中，所述步骤S12中，加入保护液后进行颠倒混匀3次。
在另一优选例中，所述步骤S12中，加入聚沉液后涡旋混匀15s。
在另一优选例中，所述活性炭聚沉体系的总体积不超过2mL。
在另一优选例中，所述步骤S2中,离心处理时间为10秒，离心转速为1000-2000rpm。
在另一优选例中，所述步骤S2中，离心处理之前将活性炭聚沉体系在室温静置15分钟。
本发明的有益效果为：
(1)所述试剂盒能够实现报阳血培养瓶内微生物与活性炭的有效分离，获得包含微生物的澄清菌液，继而进行培养或其他检测。
(2)该试剂盒操作方法简便、耗时短、微生物亲和性高，在临床上具有广泛的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为大肠杆菌血培养报阳样品处理后拉曼光谱PCA分析结果；
图2为粪肠球菌血培养报阳样品处理后拉曼光谱PCA分析结果；
图3为白色念珠菌血培养报阳样品处理后拉曼光谱PCA分析结果。
具体实施方式
为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。
实施例1
表1为一种试剂盒组成部分是的示例，
表1.试剂盒的组成
其中保护液和聚沉液的成分如表2、表3所示：
表2保护液成分
聚沉液为：
表3聚沉液成分：
表4给出了在血培养报阳样品预处理方法中，制备活性炭聚沉体系各组分的体积分配。
表4.活性炭聚沉体系的制备
备注：该配制体系适合1样次预处理。
实施例2
利用本发明所述试剂盒，预处理使用活性炭吸附血培养瓶培养的以大肠杆菌为代表的革兰氏阴性菌血培养报阳样品，处理后进行细菌拉曼光谱检测，评价预处理效果，具体步骤如下：
1.准备大肠杆菌血培养报阳样品
将大肠杆菌血培养报阳的培养瓶从培养仪上取下，并颠倒混匀5次，用注射器抽取2mL报阳样品备用。
2.建立活性炭聚沉体系
本操作各组分添加体积见表5：
表5.以大肠杆菌为代表的革兰氏阴性菌血培养阳性样本活性炭聚沉体系的制备
具体操作步骤如下：
(1)取750μL大肠杆菌血培养报阳样品于1.5mL洁净离心管中；
(2)加入250μL保护液，颠倒混匀3次；
(3)加入8μL聚沉液，涡旋混匀15s。
3.活性炭的聚沉与微生物样品的取出
将步骤2获得的体系室温静置15min后，用掌式离心机离心(1000rpm，10s)，收集包含待测大肠杆菌的上清液。
4.拉曼检测取样及制片
取预处理后上清800μL至1.5mL离心管中作为实验组，另取同种利用大肠杆菌BHI培养基(为血培养瓶内培养基成分)纯培养的菌液800μL至1.5mL离心管中作为阳性对照组，取未进行预处理的同瓶大肠杆菌血培养报阳样品800μL至1.5mL离心管中作为阴性对照组。三组样品均离心(12000rpm，2min)去上清，再各加入500μL ddH2O重悬，继续离心去上清，重复洗涤三次，最后向离心管中各加入10μL ddH2O重悬混匀以稀释沉淀的样品。
取10μL稀释液点样于洁净的检测芯片(氟化钙玻片)上，每个样品进行三个平行点样，于生物安全柜中自然风干。
5.拉曼检测
采用单细胞拉曼快检仪进行样品检测，检测参数为：针孔直径125μm，光栅600，物镜镜头100x，曝光时间6s，激光波长532nm，激光强度180mW。
6.数据处理与结果分析
根据单细胞拉曼快检仪获得的细菌拉曼图谱，进行主成分分析，实验结果如图1所示：实验组样品与阳性对照组样品主成分分析无显著性差异，阴性对照组样品与阳性对照组样品主成分分析存在显著性差异。上述结果表明，对以大肠杆菌为代表的革兰氏阴性菌血培养报阳(活性炭培养瓶)样品进行预处理后，在保证了细菌正常状态下有效去除了活性炭和其他杂质的干扰。(菌株编号大肠杆菌组为阴性对照组，血培养_大肠杆菌组为阳性对照组，预处理_血培养_大肠杆菌组为实验组)
实施例3
利用本发明所述试剂盒，预处理使用活性炭吸附血培养瓶培养的以粪肠球菌为代表的革兰氏阳性菌血培养报阳样品，处理后进行细菌拉曼光谱检测，评价预处理效果，具体步骤如下：
1.准备粪肠球菌血培养报阳样品
将粪肠球菌血培养报阳的培养瓶从培养仪上取下，并颠倒混匀5次，用注射器抽取2mL报阳样品备用。
2.建立活性炭聚沉体系
本操作各组分添加体积见表6：
表6.以粪肠球菌为代表的革兰氏阳性菌血培养阳性样本活性炭聚沉体系的制备
具体操作步骤如下：
(1)取900μL粪肠球菌血培养报阳样品于1.5mL洁净离心管中；
(2)加入100μL保护液，颠倒混匀3次；
(3)加入12μL聚沉液，涡旋混匀15s。
3.活性炭的聚沉与微生物样品的取出
将步骤2获得的体系室温静置15min后，用掌式离心机离心(1000rpm，10s)，收集包含待测粪肠球菌的上清液。
4.拉曼检测取样及制片
取预处理后上清800μL至1.5mL离心管中作为实验组，另取同种利用粪肠球菌BHI培养基(为血培养瓶内培养基成分)纯培养的菌液800μL至1.5mL离心管中作为阳性对照组，取未进行预处理的同瓶粪肠球菌血培养报阳样品800μL至1.5mL离心管中作为阴性对照组。三组样品均离心(12000rpm，2min)去上清，再各加入500μL ddH2O重悬，继续离心去上清，重复洗涤三次，最后向离心管中各加入10μL ddH2O重悬混匀以稀释沉淀的样品。
取10μL稀释液点样于洁净的检测芯片(氟化钙玻片)上，每个样品进行三个平行点样，于生物安全柜中自然风干。
5.拉曼检测
采用单细胞拉曼快检仪进行样品检测，检测参数为：针孔直径125μm，光栅600，物镜镜头100x，曝光时间3s，激光波长532nm，激光强度100mW，EMCCD为150倍。
6.数据处理与结果分析
根据单细胞拉曼快检仪获得的细菌拉曼图谱，进行主成分分析，实验结果如图2所示：实验组样品与阳性对照组样品主成分分析无显著性差异，阴性对照组样品与阳性对照组样品主成分分析存在显著性差异。上述结果表明，对以粪肠球菌为代表的革兰氏阴性菌血培养报阳(活性炭培养瓶)样品进行预处理后，在保证了细菌正常状态下有效去除了活性炭和其他杂质的干扰。(菌株编号粪肠球菌组为阴性对照组，血培养_粪肠球菌组为阳性对照组，预处理_血培养_粪肠球菌组为实验组)。
实施例4
利用本发明所述试剂盒，预处理使用活性炭吸附血培养瓶培养的以白色念珠菌为代表的真菌血培养报阳样品，处理后进行细菌拉曼光谱检测，评价预处理效果，具体步骤如下：
1.准备白色念珠菌血培养报阳样品
将白色念珠菌血培养报阳的培养瓶从培养仪上取下，并颠倒混匀5次，用注射器抽取3mL报阳样品备用。
2.建立活性炭聚沉体系
本操作各组分添加体积见表7：
表7.以白色念珠菌为代表的的真菌血培养阳性样本活性炭聚沉体系的制备
具体操作步骤如下：
(1)取1.90mL白色念珠菌血培养报阳样品于1.5mL洁净离心管中；
(2)加入100μL保护液，颠倒混匀3次；
(3)加入24μL聚沉液，涡旋混匀15s。
3.活性炭的聚沉与微生物样品的取出
将步骤2获得的体系室温静置15min后，用掌式离心机离心(1000rpm，10s)，收集包含待测白色念珠菌的上清液。
4.拉曼检测取样及制片
取预处理后上清1.6mL至2.0mL离心管中作为实验组，另取同种利用白色念珠菌BHI培养基(为血培养瓶内培养基成分)纯培养的菌液1.6mL至2.0mL离心管中作为阳性对照组，取未进行预处理的同瓶白色念珠菌血培养报阳样品1.6mL至2.0mL离心管中作为阴性对照组。三组样品均离心(12000rpm，2min)去上清，再各加入800μL ddH2O重悬，继续离心去上清，重复洗涤三次，最后向离心管中各加入10μL ddH2O重悬混匀以稀释沉淀的样品。
取10μL稀释液点样于洁净的检测芯片(氟化钙玻片)上，每个样品进行三个平行点样，于生物安全柜中自然风干。
5.拉曼检测
采用单细胞拉曼快检仪进行样品检测，检测参数为：针孔直径125μm，光栅600，物镜镜头100x，曝光时间2s，激光波长532nm，激光强度100mW，EMCCD为50倍。
6.数据处理与结果分析
根据单细胞拉曼快检仪获得的细菌拉曼图谱，进行主成分分析，实验结果如图3所示：实验组样品与阳性对照组样品主成分分析无显著性差异，阴性对照组样品与阳性对照组样品主成分分析存在显著性差异。上述结果表明，对以白色念珠菌为代表的革兰氏阴性菌血培养报阳(活性炭培养瓶)样品进行预处理后，在保证了细菌正常状态下有效去除了活性炭和其他杂质的干扰。(菌株编号白色念珠菌组为阴性对照组，血培养_白色念珠菌组为阳性对照组，预处理_血培养_白色念珠菌组为实验组)。
以上三例实验结果表明该血培养报阳(活性炭吸附瓶)样品预处理试剂盒能够简便、快速、无损地实现微生物(包括革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、真菌)与活性炭的有效分离，获得可用于血培养报阳样品菌种鉴定和药敏检测的微生物样品。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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