一种高哌嗪中残留物的检测方法
阅读说明：本技术 一种高哌嗪中残留物的检测方法 (Detection method of residues in homopiperazine ) 是由 尤梅 陈云建 彭劭 杨建玲 于 2020-05-13 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种高哌嗪中残留物的检测方法,包括以下步骤：(1)称量高哌嗪产品,加入稀释剂溶解,定容,混匀,作为供试品溶液；(2)分别称取对照品N,N′-二对甲苯磺酰基乙二胺、N,N′-1,4-二对甲苯磺酰基高哌嗪、苯酚,置于同一容器内,加入稀释剂溶解,定容,混匀,稀释,作为对照品溶液；(3)采用高效液相色谱法进行测定,测定条件包括：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱,以乙酸铵缓冲液为流动相A,乙腈为流动相B,进行梯度洗脱,检测波长为225nm,取对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱仪,记录色谱图。本发明的残留物中苯酚和两个中间体的检测方法,能够避免溶剂峰的干扰,基线稳定,分离度良好。(The invention discloses a detection method of residues in homopiperazine, which comprises the following steps: (1) weighing a high piperazine product, adding a diluent to dissolve, fixing the volume, and uniformly mixing to obtain a test solution; (2) respectively weighing reference substances of N, N '-di-p-toluenesulfonyl ethylenediamine, N' -1, 4-di-p-toluenesulfonyl homopiperazine and phenol, placing in the same container, adding a diluent for dissolving, fixing the volume, uniformly mixing, and diluting to obtain a reference substance solution; (3) the determination is carried out by adopting high performance liquid chromatography, and the determination conditions comprise: performing gradient elution by using an ammonium acetate buffer solution as a mobile phase A and acetonitrile as a mobile phase B through a chromatographic column using octadecylsilane chemically bonded silica as a filler, wherein the detection wavelength is 225nm, injecting a reference solution and a test solution into a liquid chromatograph, and recording a chromatogram. The method for detecting phenol and two intermediates in residues can avoid the interference of solvent peaks, and has stable baseline and good separation degree.)
技术领域
本发明属于药品质量控制领域，具体地说，涉及一种高哌嗪中残留物的检测方法，更具体的，涉及高哌嗪中残留物苯酚、N，N′-二对甲苯磺酰基乙二胺、N，N′-1,4-二对甲苯磺酰基高哌嗪及其它未知杂质的检测方法。
背景技术
高哌嗪是由乙二胺为起始原料，经磺酰化、环化、脱磺酰化三步反应合成而来，试剂苯酚、N，N′-二对甲苯磺酰基乙二胺(中间体1)、N，N′-1,4-二对甲苯磺酰基高哌嗪(中间体2)及其它未知杂质可能残留，高哌嗪作为药物合成的起始物料，因此需要在质量控制中对苯酚、N，N′-二对甲苯磺酰基乙二胺(中间体1)、N，N′-1,4-二对甲苯磺酰基高哌嗪(中间体2)及其它未知杂质的残留进行检测控制。
申请号为2015100770097的中国专利公开了一种高哌嗪的制备方法，是以乙二胺为原料，在正丁醇溶剂中与对甲苯磺酰氯酰化反应得到N,N’-二对甲苯磺酰基乙二胺，产物无需从反应液中分离，直接在氢氧化钠作用下，与溴氯丙烷环合反应得到N,N’-二对甲苯磺酰基高哌嗪，然后在氢溴酸和苯酚作用下脱磺酰基得到高哌嗪氢溴酸盐，最后经氢氧化钠游离、甲苯带水得到高纯度的高哌嗪。该技术方案中没有公开如何检测高哌嗪中残留物的方法。
有鉴于此特提出本发明。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供一种高哌嗪中残留物的检测方法，尤其是高哌嗪中残留物苯酚、N，N′-二对甲苯磺酰基乙二胺、N，N′-1,4-二对甲苯磺酰基高哌嗪及其它未知杂质的检测方法。
为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是：
本申请提供一种高哌嗪中残留物的检测方法，包括以下步骤：
(1)称量高哌嗪产品，加入稀释剂溶解，定容，混匀，作为供试品溶液；
(2)分别称取对照品N，N′-二对甲苯磺酰基乙二胺、N，N′-1,4-二对甲苯磺酰基高哌嗪、苯酚，置于同一容器内，加入稀释剂溶解，定容，混匀，稀释，作为对照品溶液；
(3)采用高效液相色谱法进行测定，测定条件包括：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以乙酸铵缓冲液为流动相A，乙腈为流动相B，进行梯度洗脱，检测波长为225nm，取对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图。
进一步的方案，步骤(3)中，梯度洗脱的时间及流动相比例为：0-8min，流动相A的体积百分含量由95％降到25％，流动相B的体积百分含量由5％升到75％，8-13min，流动相A的体积百分含量保持25％，流动相B的体积百分含量保持75％，13-13.1min，流动相A的体积百分含量由25％升到95％，流动相B的体积百分含量由75％降到5％，13.1-15min，流动相A的体积百分含量保持95％，流动相B的体积百分含量保持5％。
步骤(3)中，乙酸铵缓冲液的浓度为5mmol/L，采用乙酸调节pH值至5.0。
进一步的方案，对照品溶液中，N，N′-二对甲苯磺酰基乙二胺、N，N′-1,4-二对甲苯磺酰基高哌嗪和苯酚的浓度均为0.01mg/mL；供试品溶液中高哌嗪的浓度为10mg/mL。
进一步的方案，对照品溶液和供试品溶液的进样体积为5μl。
进一步的方案，步骤(1)和(2)中所述稀释剂为乙腈。
进一步的方案，步骤(3)所述色谱柱为Waters XBridgeTM C18，4.6mm×150mm，3.5μm，或者等效柱。
进一步的方案，步骤(3)的测定条件中，柱温为30℃，流速为每分钟1.0ml。
进一步的方案，步骤(3)的测定条件中，采集时间为15min，平衡时间为5min。
进一步的方案，供试品溶液的色谱图中具有苯酚、N，N′-二对甲苯磺酰基乙二胺、N，N′-1,4-二对甲苯磺酰基高哌嗪的色谱峰时，按外标法以峰面积计算，苯酚、N，N′-二对甲苯磺酰基乙二胺、N，N′-1,4-二对甲苯磺酰基高哌嗪的含量均不大于0.10％；其它单个杂质不大于0.10％，杂质总量不大于1.0％。
作为一种具体的方案，一种高哌嗪中残留物苯酚、N，N′-二对甲苯磺酰基乙二胺(中间体1)、N，N′-1,4-二对甲苯磺酰基高哌嗪(中间体2)及其它未知杂质的检测方法，包括以下步骤：
(1)取高哌嗪产品0.5g，精密称定，置50ml量瓶中，加入乙腈约30ml，超声(如有必要)至溶解，用乙腈定容至刻度，混匀，作为供试品溶液。
(2)精密称取中间体1、中间体2、苯酚对照品各20mg，置同一100ml量瓶中，加入乙腈约60ml，超声(如有必要)至溶解，并用乙腈定容至刻度，混匀，作为对照品储备液；精密量取5ml，置100ml量瓶中，用乙腈定容至刻度，混匀，作为对照品溶液。
(3)照高效液相色谱法测定，采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以5mmol/L乙酸铵缓冲液(乙酸调节pH值至5.0)为流动相A，乙腈为流动相B，按下表1进行梯度洗脱；检测波长为225nm，柱温为30℃，流速为每分钟1.0ml。精密量取对照品溶液和供试品溶液各5μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液的色谱图中如有苯酚、中间体1、中间体2峰，按外标法以峰面积计算，均不得过0.10％。其它单个杂质不得过0.10％，杂质总量不得过1.0％。优选的，色谱柱为Waters XBridgeTM C18，4.6mm×150mm，3.5μm或其等效柱。
表1
采用上述技术方案后，本发明与现有技术相比具有以下有益效果：
本发明提供的高哌嗪中残留物苯酚、N，N′-二对甲苯磺酰基乙二胺(中间体1)、N，N′-1,4-二对甲苯磺酰基高哌嗪(中间体2)及其它未知杂质的检测方法，能够避免溶剂峰的干扰，基线稳定，中间体I、II和苯酚分离度良好，色谱峰的峰型好，时间短，效率高，能够为高哌嗪的质量控制提供保障。
下面结合附图对本发明的
具体实施方式
作进一步详细的描述。
附图说明
附图作为本发明的一部分，用来提供对本发明的进一步的理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但不构成对本发明的不当限定。显然，下面描述中的附图仅仅是一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。在附图中：
图1是本发明实施例2的2.1中混合对照品的色谱图；
图2是本发明实施例2的2.1中间体I定位溶液的色谱图；
图3是本发明实施例2的2.1中间体II定位溶液的色谱图；
图4是本发明实施例2的2.1苯酚定位溶液的色谱图；
图5是本发明实施例2的2.2中混合对照品的色谱图；
图6是本发明实施例2的2.3中混合对照品的色谱图；
图7是本发明实施例3的3.1中混合对照品的色谱图；
图8是本发明实施例3的3.2中混合对照品的色谱图；
图9是本发明实施例3的3.3中实际样品的色谱图；
图10是本发明实施例3的3.4中混合对照品的色谱图；
图11是本发明实施例3的3.5中0.002％水平回收率测试溶液的色谱图；
图12是本发明实施例4的4.1中混合对照品的色谱图；
图13是本发明实施例4的4.2中混合对照品的色谱图；
图14是本发明实施例4的4.3中混合对照品的色谱图；
图15是本发明实施例4的4.4中混合对照品的色谱图；
图16是本发明实施例4的4.5中混合对照品的色谱图；
图17是本发明实施例4的4.6中混合对照品的色谱图；
图18是本发明实施例4的4.7中混合对照品的色谱图；
图19是本发明实施例5的5.1中混合对照品的色谱图；
图20是本发明实施例5的5.2中混合对照品的色谱图；
图21是本发明实施例5的5.3中混合对照品的色谱图；
图22是本发明实施例6中0.001％水平、0.002％水平、0.1％水平、0.2％水平回收率溶液色谱图；
图23是本发明比较例1的1.1中混合对照品的色谱图；
图24是本发明比较例1的1.2中混合对照品的色谱图；
图25是本发明比较例1的1.3中混合对照品的色谱图；
图26是本发明试验例1中空白溶液、混合对照品、定量限溶液的色谱图；
图27是本发明试验例1中间体I定位溶液的色谱图；
图28是本发明试验例1中间体II定位溶液的色谱图；
图29是本发明试验例1苯酚定位溶液的色谱图；
图30是本发明试验例1中0.1％水平加标回收率溶液的色谱图。
需要说明的是，这些附图和文字描述并不旨在以任何方式限制本发明的构思范围，而是通过参考特定实施例为本领域技术人员说明本发明的概念。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
样品信息
中间体I(N,N’-二对甲苯磺酰基乙二胺)，批号为201710Z07；中间体Ⅱ(N,N’-1,4-二对甲苯磺酰基高哌嗪)，批号为XS180329-15；苯酚，批号为G171215-06；高哌嗪产品，批号为160201。
取高哌嗪产品0.5g，精密称定，置50ml量瓶中，加入乙腈约30ml，超声(如有必要)至溶解，用乙腈定容至刻度，混匀，作为供试品溶液。
精密称取中间体I、中间体II、苯酚对照品各20mg，置同一100ml量瓶中，加入乙腈约60ml，超声(如有必要)至溶解，并用乙腈定容至刻度，混匀，作为对照品储备液；精密量取5ml，置100ml量瓶中，用乙腈定容至刻度，混匀，作为对照品溶液。
实施例1初始检测方法
1.1初始液相参数
表2
实施例2初步优化液相参数以及定位溶液、混合对照品溶液色谱图
2.1将流动相A“0.5％乙酸铵缓冲液(氨水调节pH值至5.0)”更改为“5mM乙酸铵缓冲液(乙酸调节pH值至5.0)”。具体配制过程如下：准确称量385.4mg无水乙酸铵于1000mL纯水中，溶解；用乙酸调节pH值至5.0±0.05。选择Waters XBridge TM C18,150*4.6mm,3.5μm色谱柱进行检测。优化后液相参数如下表所示：
表3
流动相
A:5mM乙酸铵缓冲液(乙酸调节pH值至5.0)B:乙腈A:B＝40:60
色谱柱
Waters XBridge<sup>TM</sup> C18,150×4.6mm,3.5μm
柱温
30℃
流速
1.0mL/min
波长
225nm
进样量
10μL
采集时间
10min
稀释剂和洗针溶液
乙腈
配置的混合对照品溶液中，中间体I、中间体Ⅱ和苯酚浓度均为0.01mg/mL。采用上述检测条件，检测混合对照品溶液，得到的色谱图如图1所示。各样品的保留时间为：苯酚为2.151min，中间体I为2.991min，中间体Ⅱ为5.444min。
中间体I定位溶液(浓度：1.0mg/mL)的色谱图如图2所示，中间体II定位溶液(浓度：1.0mg/mL)的色谱图如图3所示，苯酚定位溶液(浓度：1.0mg/mL)的色谱图如图4所示。
2.2检测限溶液色谱图及系统适应性结果
液相参数按照表3中进行测定。
0.02％水平混合对照品溶液色谱图及信噪比、分离度、拖尾因子结果
0.02％水平(中间体I、中间体Ⅱ和苯酚浓度均为0.002mg/mL)混合对照品溶液色谱图如图5所示。
0.02％水平(中间体I、中间体Ⅱ和苯酚浓度均为0.002mg/mL)混合对照品溶液信噪比、分离度、拖尾因子结果分析如表4中所示。
表4
样品名称
信噪比
分离度
拖尾因子
苯酚
253
N/A
1.1
中间体I
374
8.3
1.1
中间体Ⅱ
183
17.4
1.0
结论：
表3中所列液相参数能够满足中间体I、中间体II及苯酚检测对分离度、拖尾因子的要求。分离度大于1.5，拖尾因子均在0.8～2.0之间。但是，苯酚的出峰时间在2.1min左右，为彻底避免溶剂峰对苯酚检测的干扰，需要进一步优化液相参数，延长苯酚出峰时间。
该方法对三个化合物的检测能力较强，0.02％水平(中间体I、中间体Ⅱ和苯酚浓度均为0.002mg/mL)的信噪比均大于180，该浓度已经失去检测能力评估的意义，需要减小进样量或降低样品浓度，并测试该分析方法对三个化合物的实际检测限水平。
2.3 0.05％水平至0.3％水平测定
液相参数按照表3中进行测定。
0.05％水平(中间体I、中间体Ⅱ和苯酚浓度均为0.005mg/mL)至0.3％水平(中间体I、中间体Ⅱ和苯酚浓度均为0.03mg/mL)溶液色谱图如图6所示。
从图6中可以看出，由0.05％，0.2％至0.3％，随着进样浓度的增大，中间体I和II的峰型逐渐变差，尤其是中间体II发生了明显的展宽。需要减小进样浓度或优化液相参数。
实施例3优化液相参数及相应色谱图
3.1液相参数按照表5进行。本方法中，将进样量由10μL降低至5μL。流动相B的比例由60％减少至55％，如此可以延迟苯酚的出峰时间，使苯酚与溶剂峰完全分离。
表5
流动相
A:5mM乙酸铵缓冲液(乙酸调节pH值至5.0)B:乙腈A:B＝45:55
色谱柱
Waters XBridge<sup>TM</sup> C18,150×4.6mm,3.5μm
柱温
30℃
流速
1.0mL/min
波长
225nm
进样量
5μL
采集时间
15min
稀释剂和洗针溶液
乙腈
按照以上方法测定，混合对照品溶液的色谱图如图7所示。
3.2液相参数按照表6进行。本方法中，流动相B的比例由55％减少至50％。
表6
流动相
A:5mM乙酸铵缓冲液(乙酸调节pH值至5.0)B:乙腈A:B＝50:50
色谱柱
Waters XBridge<sup>TM</sup> C18,150×4.6mm,3.5μm
柱温
30℃
流速
1.0mL/min
波长
225nm
进样量
5μL
采集时间
15min
稀释剂和洗针溶液
乙腈
按照以上方法测定，混合对照品溶液的色谱图如图8所示。
结论：流动相B的比例由55％减少至50％时，苯酚出锋时间由2.1min增加至2.5min，能够避免溶剂峰的干扰，并且中间体I、II和苯酚均可达到基线分离。将表6中液相条件暂定为最优参数。
3.3实际样品测试
液相参数按照表6中条件检测实际样品，得到的色谱图如9所示。由色谱图中可以看出，实际样品溶液中(样品溶液浓度为10mg/mL)，中间体I、II、苯酚均未检测出。
3.4实际检测限水平测试
降低混合对照品溶液浓度，以得到该分析方法对中间体I、II和苯酚的实际检测能力，即方法的检测限水平。将0.05％水平混合对照品溶液稀释50倍，测试该溶液信噪比。
检测限溶液浓度如下：
表7
液相参数按照表6中条件进行检测，混合对照品溶液的色谱图如图10所示。结论：中间体I和苯酚信噪比均大于10，而中间体II由于色谱峰变宽，信噪比无法达到10。中间体Ⅱ稀释至0.002％水平(浓度为0.0002mg/mL)，信噪比可满足大于10的要求。
3.5回收率测试
3.5.1配制回收率测试溶液，主化合物高哌嗪浓度为10mg/mL。具体配制过程如下：
表8
液相参数按照表6中条件进行检测，0.002％水平回收率测试溶液色谱图如图11所示。
结论：回收率测试溶液中2.0min溶剂峰明显，对苯酚产生干扰，导致苯酚定量不准确，尤其是低浓度回收率溶液。液相参数需进一步优化。
实施例4更进一步优化液相参数及相应色谱图
采用以下几种液相条件，筛选较佳的方案，样品配置方式同上。
4.1采用如下表9所示液相参数进行测定
表9
按照以上方法测定，混合对照品溶液的色谱图如图12所示。从中可以看出：中间体I、II和苯酚分离度良好，继续优化液相参数。发明人通过提高流动相B的比例，发现可以加快中间体I、II的出峰，提高分析效率。
4.2采用如下表10所示液相参数进行测定
表10
按照以上方法测定，混合对照品溶液的色谱图如图13所示。
4.3采用如下表11所示液相参数进行测定
表11
按照以上方法测定，混合对照品溶液的色谱图如图14所示。从中可以看出：中间体I、II和苯酚分离度良好，但是在8min处有明显的基线波动，需要继续优化液相参数，减小中间体I、II的出峰时间，优化基线。
4.4采用如下表12所示液相参数进行测定
表12
按照以上方法测定，混合对照品溶液的色谱图如图15所示。从中可以看出：中间体I、II和苯酚分离度良好，但是中间体I色谱峰较宽。
4.5采用如下表13所示液相参数进行测定
表13
按照以上方法测定，混合对照品溶液的色谱图如图16所示。从中可以看出：中间体I、II和苯酚分离度良好，但是中间体I色谱峰较宽。
4.6采用如下表14所示液相参数进行测定
表14
按照以上方法测定，混合对照品溶液的色谱图如图17所示。
4.7采用如下表15所示液相参数进行测定
表15
按照以上方法测定，混合对照品溶液的色谱图如图18所示。
以上结果中，4.6和4.7方案的液相参数(表14和表15)下的色谱图(图17和图18)接近，基线与分析时间均优于4.5方案下获得的色谱图。比较以上4.1-4.8方案下的液相参数与相应的色谱图可知，梯度变化对苯酚的色谱峰峰型有明显改善，但是会造成基线波动，需要继续优化以得到最优的色谱峰峰型和基线。
实施例5再进一步优化液相参数和色谱图
5.1采用如下表16所示液相参数进行测定
表16
按照以上方法测定，混合对照品溶液的色谱图如图19所示。
5.2采用如下表17所示液相参数进行测定
表17
按照以上方法测定，混合对照品溶液的色谱图如图20所示。
5.3采用如下表18所示液相参数进行测定
表18
按照以上方法测定，混合对照品溶液的色谱图如图21所示。
由以上5.1-5.3方案中可以看出，5.2和5.3方案中液相参数(表17和表18)下的色谱图(图20和21)接近。5.3方案中液相参数整体分析时间比5.2快，并能够满足分离度要求。为减少不必要的色谱采集时间并保证系统充分平衡的状态下，将采集时间设为15min，平衡时间设为5min。
实施例6最优的液相参数
6.1通过筛选优化，最优的液相参数如下表19中所示。
表19
6.2使用最终液相方法进行回收率及线性测试
6.2.1配制回收率测试溶液，主化合物高哌嗪浓度为10mg/mL。具体配制过程如下：
表20
6.2.2对照品溶液
以0.05％水平混合对照品溶液(中间体I、中间体Ⅱ和苯酚浓度均为0.005mg/mL)作为外标法定量的对照品溶液。具体配制过程如下：
表21
6.2.3采用表19中的液相参数进行测定。
6.2.4结果
(1)0.001％水平、0.002％水平、0.1％水平、0.2％水平回收率溶液色谱图如图22所示。
(2)系统适应性结果如下表22所示。
表22
(3)信噪比结果如下表23所示。
表23
(4)回收率结果如下表24所示。
表24
(5)线性结果如下表25所示。
表25
6.3结论
(1)空白溶液色谱图中在目标峰处无干扰；0.05％水平混合对照品溶液(中间体I、中间体Ⅱ和苯酚浓度均为0.005mg/mL)中三种化合物的分离度满足大于1.5的要求，拖尾因子均满足0.8～2.0的要求。
(2)实际检测限浓度的确定：0.001％水平混合对照品溶液(中间体I、中间体Ⅱ和苯酚浓度均为0.0001mg/mL)，三种化合物的信噪比均大于3，满足检测限溶液信噪比大于等于3的要求。将0.001％水平混合对照品溶液(中间体I、中间体Ⅱ和苯酚浓度均为0.0001mg/mL)确定为检测限溶液(LOD)。
(3)实际定量限浓度的确定：0.002％水平混合对照品溶液(中间体I、中间体Ⅱ和苯酚浓度均为0.0002mg/mL)，三种化合物的信噪比均大于10，满足定量限溶液信噪比大于等于10的要求。将0.002％水平混合对照品溶液(中间体I、中间体Ⅱ和苯酚浓度均为0.0002mg/mL)确定为定量限溶液(LOQ)。
(4)线性接受标准的确定：预验证实验中0.001％水平(中间体I、中间体Ⅱ和苯酚浓度均为0.0001mg/mL)至0.2％水平(中间体I、中间体Ⅱ和苯酚浓度均为0.02mg/mL)浓度范围内，三种化合物的线性相关系数均满足大于0.999的要求。根据我们SOP AD-VAL-001要求，杂质水平线性相关系数应大于0.995，因此建议在正式验证方案中接受标准为：定量限0.02％水平(中间体I、中间体Ⅱ和苯酚浓度均为0.0002mg/mL)至0.2％水平(中间体I、中间体Ⅱ和苯酚浓度均为0.02mg/mL)浓度范围内线性相关系数大于0.995。具体线性浓度与相应接受标准如下：
表26
(5)回收率接受标准的确定：在定量限浓度水平，即0.02％水平(中间体I、中间体Ⅱ和苯酚浓度均为0.0002mg/mL)，预验证实验中回收率结果为102％～118％，此原因是0.02％水平三种化合物峰面积较小，积分参数的差别对回收率结果影响较大。根据我们SOPAD-VAL-001要求，杂质含量＜0.15％时，理论含量与实测含量相差应在±0.04％之内，杂质含量≥0.15％时，理论含量与实测含量的比值应在±30％之内。结合预验证的回收率结果，建议在正式验证方案中接受标准为：定量限0.02％水平(中间体I、中间体Ⅱ和苯酚浓度均为0.0002mg/mL)至0.1％水平(中间体I、中间体Ⅱ和苯酚浓度均为0.01mg/mL)水平回收率应满足60％-140％之间。0.1％水平至0.2％水平回收率接受标准为80％-120％。具体回收率浓度与相应接受标准如下：
表27
比较例1不同色谱柱测试0.1％水平回收率溶液
1.1使用ACE 5 C18，25cm色谱柱测试0.1％水平回收率溶液
参照实施例2中表3的液相参数，区别在于：采用色谱柱ACE 5 C18,250×4.6mm,5μm，进样量5ul，采集时间15min，将混合对照溶液进行检测。
得到的色谱图如图23所示。可以看出，使用ACE 5 C18,250×4.6mm,5μm色谱柱，中间体I、中间体Ⅱ和苯酚均不能被很好地定量和检测，并且整体基线较差，说明该色谱柱不适合用来测定高哌嗪中中间体I、中间体Ⅱ和苯酚的含量。
1.2使用Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C8，25cm色谱柱测试0.1％水平回收率溶液
参照实施例2中表3的液相参数，区别在于：采用色谱柱Agilent ZORBAX EclipseXDB-C8,250×4.6mm,5μm，进样量5ul，采集时间15min，将混合对照溶液进行检测。
得到的色谱图如图24所示。可以看出，使用Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C8,250×4.6mm,5μm色谱柱，主化合物产生的2.5min左右色谱峰对苯酚产生干扰，并且0min-4.5min之间整体基线较差。
1.3使用Waters Symmetry C18，25cm色谱柱测试0.1％水平回收率溶液
参照实施例2中表3的液相参数，区别在于：采用色谱柱Waters Symmetry C18,250×4.6mm,5μm，进样量5ul，采集时间15min，将混合对照溶液进行检测。
得到的色谱图如图25所示。可以看出，使用Waters Symmetry C18,250×4.6mm,5μm色谱柱，主化合物产生的2.5min左右色谱峰对苯酚产生干扰，基线在变化，对后续苯酚定量测试存在风险，该条件下方法的耐用性不符合目标要求。
结论，采用色谱柱Waters XBridgeTM C18,150×4.6mm,3.5μm为最佳方案。
试验例1专属性
样品：空白溶液(稀释剂乙腈)，0.002％定量限溶液(LOQ)，对照品溶液。按照分析方法配制空白溶液(稀释剂乙腈)，0.002％定量限溶液(LOQ)和对照品溶液各一份。
中间体I定位溶液、中间体II定位溶液和苯酚定位溶液。
配制0.05mg/mL的中间体I定位溶液、中间体Ⅱ定位溶液和苯酚定位溶液各一份，配制过程如下：
例如：准确称取10mg的中间体I对照品至200mL的容量瓶中，加入150mL的稀释剂，超声(如有必要)至溶解，并用稀释剂定容，混匀。命名为I-ID。
准确称取10mg的中间体Ⅱ对照品至200mL的容量瓶中，加入150mL的稀释剂，超声(如有必要)至溶解，并用稀释剂定容，混匀。命名为PhenoⅡ-ID。
准确称取10mg的苯酚对照品至200mL的容量瓶中，加入150mL的稀释剂，超声(如有必要)至溶解，并用稀释剂定容，混匀。命名为Phenol-ID。
接受标准
空白溶液色谱图中在目标峰中间体I，中间体II，苯酚处无明显干扰；若有干扰，干扰峰的峰面积不得大于LOQ的峰面积。
对照品溶液和0.1％水平加标回收率溶液的色谱图中中间体I、中间体II及苯酚之间能够完全分离，分离度≥1.5。
结果：空白溶液色谱图中在目标峰中间体I，中间体II，苯酚处均无明显干扰。对照品溶液的色谱图中中间体I、中间体II及苯酚之间分离度详见表28，0.1％水平加标回收率溶液的色谱图中中间体I、中间体II及苯酚之间分离度详见表29。结果详见图26，中间体I定位溶液、中间体II定位溶液和苯酚定位溶液结果见图27～29。0.1％水平加标回收率溶液详见图30。结果符合接受标准。
表28
名称
分离度
Phenol-ID(苯酚)
28.3
I-ID(中间体I)
28.3,15.7
II-ID(中间体II)
15.7
表29
名称
分离度
Phenol-ID(苯酚)
27.9
I-ID(中间体I)
27.9,15.6
II-ID(中间体II)
15.6
试验例2定量限(LOQ)，检测限(LOD)
(1)定量限溶液(LOQ)：配制一份0.002％定量限溶液(LOQ)，进样6针定量限溶液(LOQ)，分别计算定量限溶液中中间体I、中间体II及苯酚的信噪比、峰面积的相对标准偏差(RSD)以及保留时间相对标准偏差(RSD)。
检测限溶液(LOD)：配制一份0.001％检测限溶液(LOD)，由0.002％定量限溶液(LOQ)进行二步稀释得到检测限溶液(LOD)。具体过程如下：定量限溶液(LOQ)稀释两倍(5mL→10mL)既得检测限溶液(LOD)。进样3针检测限溶液(LOD)，分别计算定量限溶液中中间体I、中间体II及苯酚各自信噪比的平均值。
(2)接受标准
检测限，LOD LOD溶液中中间体I、中间体II及苯酚各自信噪比的平均值均不小于3。
定量限，LOQ LOQ溶液中中间体I、中间体II及苯酚各自信噪比的平均值均不小于10。连续6针LOQ中中间体I、中间体II及苯酚各自峰面积的RSD≤15％，保留时间的RSD≤2.0％。
(3)结果：检测限(LOD)和定量限(LOQ)结果见表30～31。结果均符合接受标准。
表30检测限(LOD)
名称
中间体I
中间体II
苯酚
第一针信噪比
5
4
1
第二针信噪比
13
10
6
第三针信噪比
3
2
1
信噪比平均值(n＝3)
7
5
3
表31定量限溶液(LOQ)
名称
中间体I
中间体II
苯酚
第一针信噪比
37
27
15
第二针信噪比
51
40
21
第三针信噪比
13
10
5
第四针信噪比
5
4
2
第五针信噪比
11
7
4
第六针信噪比
28
21
11
信噪比平均值(n＝6)
24
18
10
峰面积RSD(n＝6)
2％
9％
8％
保留时间RSD(n＝6)
0.1％
0.1％
0.0％
试验例3线性
分别配制一系列的线性溶液，中间体I，中间体II，苯酚浓度水平分别为目标浓度的0.002％，0.01％，0.05％，0.1％和0.2％，每份溶液进样1针，计算中间体I、中间体II及苯酚各自的线性相关系数(r)、斜率、截距以及残差平方和。
配制一份0.05mg/mL的混合对照品溶液，配制过程如下：例如：准确称取10mg的中间体I、中间体Ⅱ、苯酚对照品至同一200mL的容量瓶中，加入约150mL的稀释剂，超声(如有必要)至溶解，并用稀释剂定容，混匀，命名为：储备液#1。
线性溶液的配制：配制0.002％，0.01％，0.05％，0.1％和0.2％水平线性溶液各一份。配制过程如下：
表32
线性溶液名称
储备液名称
二步稀释
理论浓度(mg/mL)
0.002％
0.1％水平线性溶液
2mL→100mL
0.0002
0.01％
储备液#1
2mL→100mL
0.001
0.05％
储备液#1
5mL→50mL
0.005
0.1％
储备液#1
5mL→25mL
0.01
0.2％
储备液#1
10mL→25mL
0.02
接受标准：
中间体I、中间体II及苯酚的各自相关系数(r)均不低于0.995。
报告斜率、截距以及残差平方和。
结果线性结果详见表33。结果符合接受标准。
表33
名称
中间体I
中间体II
苯酚
线性系数(r)
1.000
1.000
1.000
斜率
17596727.097
13872713.910
8798348.199
截距
67.311
220.604
-142.773
残差平方和
195637.496
255476.251
24577.779
试验例4准确度
高哌嗪原料药样品控制溶液：平行配制3份样品控制溶液。
混合对照品溶液的配制：配制一份0.05mg/mL的混合对照品溶液(储备液#2)，配制过程如下：
例如：准确称取10mg的中间体I、中间体Ⅱ、苯酚对照品至同一200mL的容量瓶中，加入约150mL的稀释剂，超声(如有必要)至溶解，并用稀释剂定容，混匀，命名为：储备液#2。
配制一份0.005mg/mL的混合对照品溶液(储备液#3)，配制过程如下：取10ml储备液#2，加入100mL的容量瓶中，加入稀释剂，定容，混匀，命名为：储备液#3。
加标回收率溶液的配制：分别配制一系列的加标回收率溶液，加标浓度为目标浓度的0.002％，0.05％,0.1％和0.2％，0.002％、0.05％水平和0.2％水平加标回收率溶液分别配制3份，0.1％水平加标回收率溶液配制6份，具体的配制过程如下：
表34
每份溶液进样1针，分别计算每个水平中间体I、中间体II及苯酚的单个回收率结果及平均值。
接受标准
对于0.002％和0.05％水平加标回收率，中间体I、中间体II及苯酚的各自的回收率平均值应在60％至140％之间。对于0.1％、0.2％水平加标回收率，中间体I、中间体II及苯酚的各自回收率平均值应在80％至120％之间。
结果，苯酚加标溶液的实际配置浓度：
表35
中间体I加标溶液的实际配置浓度：
表36
中间体II加标溶液的实际配置浓度：
表37
准确度结果见表38。结果符合接受标准。注释：验证方案中实测浓度公式中没有提及对照品中间体I、中间体II及苯酚的效价，实际计算过程中各自的效价参与了准确度的计算，这是符合准确度计算结果需求的，对于验证的结果没有影响。
表38：准确度结果
名称
中间体I
中间体II
苯酚
0.002％水平加标回收率平均值
100％
102％
110％
0.05％水平加标回收率平均值
101％
99％
102％
0.1％水平加标回收率平均值
101％
99％
102％
0.2％水平加标回收率平均值
101％
99％
101％
试验例5精密度
仪器精密度
配制一份对照品溶液(STD#1)，进样6针对照品溶液(STD#1)，分别计算中间体I、中间体II及苯酚峰面积的相对标准偏差(RSD)。
方法精密度
按照验证方案平行配制0.1％水平加标回收率溶液6份，每份溶液进1针，计算中间体I、中间体II及苯酚回收率结果的相对标准偏差(RSD)。
接受标准：对照品溶液中中间体I、中间体II及苯酚各自峰面积的RSD 5.0％。
0.1％水平加标回收率溶液中中间体I、中间体II及苯酚回收率结果的RSD 15％。
结果：仪器精密度和方法精密度结果见表39，40。结果满足接受标准。
表39
名称
中间体I
中间体II
苯酚
01
175819.596
138874.837
88990.123
02
175625.691
139229.992
89170.853
03
175173.269
139281.870
88672.074
04
175612.341
139330.697
88984.977
05
175704.569
139404.501
89018.064
06
175671.088
141203.432
88871.857
峰面
0.1％
0.6％
0.2％
表40
名称
中间体I回收率(％)
中间体II回收率(％)
苯酚回收率(％)
01
101
99
101
02
102
100
102
03
101
99
101
04
102
100
102
05
101
100
102
06
101
99
101
0.1％水平加标回收率的RSD
0％
0％
0％
试验例6工作范围
工作范围将根据适当水平的准确度，精密度和线性建立。
接受标准 报告工作范围
结果 工作范围结果见表41。结果满足接受标准。
表41
试验例7耐受性
溶液配制：配制如下代表性溶液进行耐受性评估：空白溶液(稀释剂)，0.002％定量限溶液(LOQ)，对照品溶液(STD#1)，0.1％水平加标回收率溶液。
改变以下液相参数，每次测试仅改变一个参数，评估耐受性结果。
1.流动相初始比例，B％：7％(5％+2％)，流动相梯度程序如表42所示，其他液相参数参照表19：
表42
2.流动相初始比例，B％：7％(5％-2％)，流动相梯度程序如表43所示，其他液相参数参照表19：
表43
3.流动相pH 5.2(5.0+0.2)，液相参数中乙酸调节pH值至5.2±0.05，其他液相参数参照表19；
4.流动相pH 4.8(5.0-0.2)，液相参数中乙酸调节pH值至4.8±0.05，其他液相参数参照表19；
5.柱温33℃(30℃+3℃)，液相参数中柱温为33℃，其他液相参数参照表19；
6.柱温27℃(30℃-3℃)，液相参数中柱温为27℃，其他液相参数参照表19；
7.流速1.2mL/min(1.0mL/min+20％)，液相参数中流速1.2mL/min，其他液相参数参照表19；
8.流速0.8mL/min(1.0mL/min-20％)，液相参数中流速0.8mL/min，其他液相参数参照表19。
接受标准
空白溶液色谱图中在目标峰处无明显干扰；若有干扰，干扰峰的峰面积不得大于LOQ的峰面积。
第一针对照品溶液和0.1％水平加标回收率溶液的色谱图中中间体I、中间体II及苯酚之间能够完全分离，分离度≥1.5。
备注：如果某一条件液相参数下不能满足上述两点要求，实际测试时应控制该变量，严格与方法保持一致。
结果
1.流动相pH 4.8(5.0-0.2)测试结果：
空白溶液色谱图中在目标峰中间体I，中间体II，苯酚处均无明显干扰(未提供色谱图，对色谱图进行了描述)。第一针对照品溶液和0.1％水平加标回收率溶液的色谱图中中间体I、中间体II及苯酚之间能够完全分离，分离度>1.5。空白溶液，0.002％定量限溶液(LOQ)，对照品溶液和0.1％水平加标回收率溶液用于耐受性测试，在pH4.8流动相下的测试结果均满足接受标准。
2.流动相pH 5.2(5.0+0.2)测试结果：
空白溶液色谱图中在目标峰中间体I，中间体II，苯酚处均无明显干扰。第一针对照品溶液和0.1％水平加标回收率溶液的色谱图中中间体I、中间体II及苯酚之间能够完全分离，分离度≥1.5。空白溶液,0.002％定量限溶液(LOQ)，对照品溶液和0.1％水平加标回收率溶液用于耐受性测试，在pH 5.2流动相下，其余参数的测试结果均满足接受标准。
3.流动相初始比例，B％：7％(5％+2％)，测试结果如下：
空白溶液色谱图中在目标峰中间体I，中间体II，苯酚处均无明显干扰。第一针对照品溶液和0.1％水平加标回收率溶液的色谱图中中间体I、中间体II及苯酚之间能够完全分离，分离度>1.5。空白溶液,0.002％定量限溶液(LOQ)，对照品溶液和0.1％水平加标回收率溶液用于耐受性测试，在改变流动相B(B％：7％(5％+2％)参数下的测试结果均满足接受标准。
4.流动相初始比例，B％：3％(5％-2％)，测试结果如下：
空白溶液色谱图中在目标峰中间体I，中间体II，苯酚处均无明显干扰。第一针对照品溶液和0.1％水平加标回收率溶液的色谱图中中间体I、中间体II及苯酚之间能够完全分离，分离度≥1.5。空白溶液,0.002％定量限溶液(LOQ)，对照品溶液和0.1％水平加标回收率溶液用于耐受性测试，在改变流动相B(B％：3％(5％-2％)参数下的测试结果均满足接受标准。
5.柱温33℃(30℃+3℃)
空白溶液色谱图中在目标峰中间体I，中间体II，苯酚处均无明显干扰。第一针对照品溶液和0.1％水平加标回收率溶液的色谱图中中间体I、中间体II及苯酚之间能够完全分离，分离度≥1.5。空白溶液,0.002％定量限溶液(LOQ)，对照品溶液和0.1％水平加标回收率溶液用于耐受性测试，在柱温33℃(30℃+3℃)参数下的测试结果均满足接受标准。
6.柱温27℃(30℃-3℃)
空白溶液色谱图中在目标峰中间体I，中间体II，苯酚处均无明显干扰。第一针对照品溶液和0.1％水平加标回收率溶液的色谱图中中间体I、中间体II及苯酚之间能够完全分离，分离度>1.5。空白溶液,0.002％定量限溶液(LOQ)，对照品溶液和0.1％水平加标回收率溶液用于耐受性测试，在柱温27℃(30℃-3℃)参数下的测试结果均满足接受标准。
7.流速1.2mL/min(1.0mL/min+20％)
空白溶液色谱图中在目标峰中间体I，中间体II，苯酚处均无明显干扰。第一针对照品溶液和0.1％水平加标回收率溶液的色谱图中中间体I、中间体II及苯酚之间能够完全分离，分离度>1.5。空白溶液,0.002％定量限溶液(LOQ)，对照品溶液和0.1％水平加标回收率溶液用于耐受性测试，在流速1.2mL/min(1.0mL/min+20％)参数下的测试结果均满足接受标准。
8.流速0.8mL/min(1.0mL/min-20％)
空白溶液色谱图中在目标峰中间体I，中间体II，苯酚处均无明显干扰。第一针对照品溶液和0.1％水平加标回收率溶液的色谱图中中间体I、中间体II及苯酚之间能够完全分离，分离度>1.5。空白溶液,0.002％定量限溶液(LOQ)，对照品溶液和0.1％水平加标回收率溶液用于耐受性测试，在流速0.8mL/min(1.0mL/min-20％)参数下的测试结果均满足接受标准。
试验例8溶液稳定性
对照品溶液的稳定性
配制一份对照品溶液。放置在合适的条件下储存(如常温条件、2-8℃条件)。新鲜配制对照品溶液，分析放置指定时间(如24小时，48小时和72小时)后的对照品溶液。计算放置指定时间后对照品溶液相对于新鲜配制对照品溶液的回收率，并与初始时间的回收率相比。
加标回收率溶液的稳定性
按照验证方案配制0.1％加标水平的回收率溶液1份，将0.1％水平回收率溶液，放置在合适的条件下储存(如常温条件、2-8℃条件)。
新鲜配制对照品溶液，分析放置指定时间(如24小时，48小时和72小时)后0.1％水平回收率溶液的回收率。比较放置指定时间后0.1％水平回收率溶液的回收率结果，与初始时间的回收率结果的比值。
接受标准
放置指定时间后对照品溶液中中间体I、中间体II及苯酚峰面积的回收率结果相对于初始值相比在95.0-105.0％之间。
放置指定时间后溶液中中间体I、中间体II及苯酚的回收率结果相对于初始值相比在95.0-105.0％之间。
结果
对照品溶液的稳定性结果详见表44，加标回收率溶液的稳定性结果详见表45。结果均满足接受标准。
表44
名称
中间体I
中间体II
苯酚
对照品溶液室温1天(31h)稳定性
100％
101％
99％
对照品溶液室温5天(129.5h)稳定性
99％
100％
99％
表45
名称
中间体I
中间体II
苯酚
0.1％水平加标回收率溶液室温1天(20.5h)稳定性
100％
101％
99％
0.1％水平加标回收率溶液室温5天(119h)稳定性
99％
100％
99％
以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。