发明内容

本发明提供了一种银杏叶药材中微量成分咖啡因含量的测定方法，所述方法以BJS 201701方法(食品中西布曲明等化合物的测定(BJS 201701，简称文献1)为基础，对其检 测条件进行了改进，以适应银杏叶药材，同时，筛选得到特别优选的仪器，溶剂，流动相，温度，时间等条件，特别适合银杏叶药材的检测。

本发明的检测方法，采用超高效液相色谱-串联质谱测定方法，其中，采用特定仪器， Waters Acquity UPLC I-Class超高效液相色谱仪串联Xevo TQ-S micro三重四极杆质谱仪，进 行测定。

本发明所述的方法，包括以下步骤：

1)供试品溶液的制备：

2)对照品溶液的制备：

3)检测：取供试品溶液和对照品溶液，注入液质联用仪，以咖啡因对照品峰为参照峰， 记录峰面积，根据峰面积计算供试品溶液中的咖啡因含量。

优选的，本发明所述的方法，包括以下步骤：

1)供试品溶液的制备：取银杏叶样品加入甲醇提取，提取液过滤，取续滤液离心得到上 清液；

2)对照品溶液的制备：取咖啡因对照品用甲醇溶解并稀释至刻度；

3)检测取供试品溶液和对照品溶液，注入液质联用仪，以咖啡因对照品峰为参照峰，记 录峰面积，根据峰面积计算供试品溶液中的咖啡因含量，其中，液质联用仪的色谱、质谱条 件采用的仪器是Waters Acquity UPLC I-Class超高效液相色谱仪串联Xevo TQ-Smicro三重四 极杆质谱仪，

其中，所述液质联用仪的液相色谱条件如下：色谱柱：Waters CORTECS T3色谱柱(2.1×100 mm,2.7μm)；流动相：A为含0.1％甲酸水溶液，B为含0.1％甲酸乙腈溶液，梯度洗脱，0～5 min，95％A；5～22min，95％～2％A；22～27min，2％A；27～27.5min，2％～95％A；27.5～32min，95％A；流速：0.3mL/min；柱温30℃；进样量2μL；质谱参数条件：正离 子模式；毛细管电压：0.5kV；离子源温度：150℃；雾化温度：500℃；雾化器流速：1000 L/h；多反应监测模式(MRM)；离子对195.112→138.065(定量)、195.112→110.037(定性)； 驻留时间分别为0.165s、0.165s；锥孔电压分别为4.0V、4.0V；碰撞能量分别为18.0V、22.0 V。

具体的，本发明所述的方法，其中，

步骤1)供试品溶液的制备方法如下：取银杏叶样品适量，研成粉末，过四号筛，混匀, 称取粉末1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇8-12mL，密塞，称重，超声提取8-12min，放冷，再次称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.2μm针筒式过滤器过 滤，取续滤液，高速离心10-20min，转数10000-15000转/分钟，得上清液，即为供试品溶液。

其中，步骤2)对照品溶液的制备方法如下：取咖啡因对照品2.50mg，精密称定，置于 5mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为500μg/mL咖啡因对照品溶液。

更具体的，本发明所述的方法，其中1)供试品溶液的制备方法如下：取银杏叶样品适 量，研成粉末，过四号筛，混匀,称取粉末1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇 10mL，密塞，称重，超声提取10min，放冷，再次称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀， 用0.2μm针筒式过滤器过滤，取续滤液，高速离心15min，转数12000转/分钟，得上清液 即为供试品溶液。

其中，步骤2)对照品溶液的制备方法如下：取咖啡因对照品2.50mg，精密称定，置于 5mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为500μg/mL咖啡因对照品溶液。

其中步骤3)色谱、质谱条件采用的仪器是Waters Acquity UPLC I-Class超高效液相色谱 仪串联Xevo TQ-S micro三重四极杆质谱仪，具体参数如下：

液相色谱条件：色谱柱：Waters CORTECS T3色谱柱(2.1×100mm,2.7μm)；流动相：A 为含0.1％甲酸水溶液，B为含0.1％甲酸乙腈溶液，梯度洗脱，0～5min，95％A；5～22min，95％～2％A；22～27min，2％A；27～27.5min，2％～95％A；27.5～32min，95％A；流 速：0.3mL/min；柱温30℃；进样量2μL

质谱参数条件：正离子模式；毛细管电压：0.5kV；离子源温度：150℃；雾化温度：500℃；雾化器流速：1000L/h；多反应监测模式(MRM)；离子对195.112→138.065(定量)、195.112→110.037(定性)；驻留时间分别为0.165s、0.165s；锥孔电压分别为4.0V、4.0V；碰撞能量分别为18.0V、22.0V

特别优选的，本发明所述的方法，包括以下步骤：

1)供试品溶液的制备方法如下：取银杏叶样品适量，研成粉末，过四号筛，混匀,称取 粉末1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇8-12mL，密塞，称重，超声提取8-12min，放冷，再次称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.2μm针筒式过滤器过滤，取续 滤液，高速离心10-20min，转数10000-15000转/分钟，得上清液，即为供试品溶液；

2)对照品溶液的制备方法如下：取咖啡因对照品2.50mg，精密称定，置于5mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为500μg/mL咖啡因对照品溶液；

3)取供试品溶液和对照品溶液，注入液质联用仪，以咖啡因对照品峰为参照峰，记录峰 面积，根据峰面积计算供试品溶液中的咖啡因含量；

其中，液相色谱条件：色谱柱：Waters CORTECS T3色谱柱(2.1×100mm,2.7μm)；流动 相：A为含0.1％甲酸水溶液，B为含0.1％甲酸乙腈溶液，梯度洗脱，0～5min，95％A；5～22 min，95％～2％A；22～27min，2％A；27～27.5min，2％～95％A；27.5～32min，95％A； 流速：0.3mL/min；柱温30℃；进样量2μL；质谱参数条件：正离子模式；毛细管电压：0.5 kV；离子源温度：150℃；雾化温度：500℃；雾化器流速：1000L/h；多反应监测模式(MRM)； 离子对195.112→138.065(定量)、195.112→110.037(定性)；驻留时间分别为0.165s、0.165 s；锥孔电压分别为4.0V、4.0V；碰撞能量分别为18.0V、22.0V。

最优选的，本发明所述的方法，包括以下步骤：

1)供试品溶液的制备方法如下：取银杏叶样品适量，研成粉末，过四号筛，混匀,称取 粉末1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10mL，密塞，称重，超声提取10min，放冷，再次称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.2μm针筒式过滤器过滤，取续滤液， 高速离心15min，转数12000转/分钟，得上清液即为供试品溶液；

2)对照品溶液的制备方法如下：取咖啡因对照品2.50mg，精密称定，置于5mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为500μg/mL咖啡因对照品溶液；

3)取供试品溶液和对照品溶液，注入液质联用仪，以咖啡因对照品峰为参照峰，记录峰 面积，根据峰面积计算供试品溶液中的咖啡因含量；

其中3)色谱、质谱条件采用的仪器是Waters Acquity UPLC I-Class超高效液相色谱仪串 联Xevo TQ-S micro三重四极杆质谱仪，具体参数如下：

液相色谱条件：色谱柱：Waters CORTECS T3色谱柱(2.1×100mm,2.7μm)；流动相：A 为含0.1％甲酸水溶液，B为含0.1％甲酸乙腈溶液，梯度洗脱，0～5min，95％A；5～22min，95％～2％A；22～27min，2％A；27～27.5min，2％～95％A；27.5～32min，95％A；流 速：0.3mL/min；柱温30℃；进样量2μL

质谱参数条件：正离子模式；毛细管电压：0.5kV；离子源温度：150℃；雾化温度：500℃；雾化器流速：1000L/h；多反应监测模式(MRM)；离子对195.112→138.065(定量)、195.112→110.037(定性)；驻留时间分别为0.165s、0.165s；锥孔电压分别为4.0V、4.0V；碰撞能量分别为18.0V、22.0V。

本发明的的检测方法，是经过筛选获得的，筛选过程如下：

一、现有方法的改进

BJS 201701方法(食品中西布曲明等化合物的测定(BJS 201701，简称文献1)检测的 对象为食品(含保健食品)这一类物质，在对银杏叶中的咖啡因进行检测时，直接用文献1 方法检测结果较差，具体原因前面已经论述，今，发明人对BJS 201701方法进行改进，方法 检测的对象针对银杏叶生药样品。主要有：

1、进样量的改进

采用文献1中供试品溶液的制备、对照品溶液的制备、色谱质谱条件。

对进样量进行筛选，结果显示：0.1ng/mL咖啡因对照品进样量为1μL时峰面积为361， 信噪比为12.21，仅略超过定量限S/N＝10，由于信噪比的计算结果具有一定的波动幅度，导 致结果不准；当进样量为2μL时峰面积为618，信噪比为20.24，超过定量限2倍，用于定量 结果较为准确。进样量大于等于2μL，均能满足实验要求，且2μL更节省样品用量，对仪器 和色谱柱的污染程度更小。

2、提取容器的改变

文献1的容器为具塞试管，由于具塞试管形状狭长，银杏叶药材粉末堆积在试管底部， 超声提取时，粉末多在下部，溶剂多在上部，使得每批银杏叶粉末与溶剂接触充分程度不一 致，导致结果差异性较大。而用具塞锥形瓶，超声时药材粉末与提取溶剂接触充分，结果稳 定性较好。

用具塞试管为提取容器的数据(同一批银杏叶样品平行实验结果)结果分别为255、372、 2443。峰面积波动很大，RSD值为123.28％。

用具塞锥形瓶为提取容器的数据(同一批银杏叶样品平行实验结果)结果分别为3029、 3057、3003。峰面积RSD值为0.89％。

3、样品处理的改进

文献1中将食品(含保健食品)直接研细使用，无去除杂质、过筛等步骤。由于银杏叶 药材含有杂质，使用文献1中方法会因杂质的存在干扰检测结果，使检测结果不准确。本方 法中取银杏叶药材，除去非银杏叶药用部分的杂质后，取全叶用打粉机粉碎，过四号筛，备 用。

文献1方法中使用“用微孔滤膜过滤，取续滤液，根据实际浓度适当稀释至线性范围内， 备用”，本发明方法中“用0.2μm针筒式过滤器过滤，取续滤液，高速离心15min，转数12000转/分钟，取上清液，备用”，本方法增加离心、取上清液步骤，进一步去除银杏叶样 品中的杂质，使检测结果更准确，同时也减少样品对色谱柱、仪器的污染程度。

二、银杏叶提取工艺条件的确定

以甲醇浓度、提取时间、料液比为因素条件进行单因素试验，分别考察各因素对银杏叶 中咖啡因提取率的影响，见表1。

表1：单因素试验因素和水平

1、甲醇浓度对银杏叶中咖啡因提取率的影响

称取1g银杏叶粉末，提取时间为10min，料液比(g:mL)为1:10，超声温度为30℃时，采用100％、70％、30％体积分数的甲醇溶液提取银杏叶中咖啡因，以甲醇浓度为横坐标，咖啡因提取率(ng/g)为纵坐标作图，见图1-1。

由图1-1可知，甲醇浓度为100％、70％时提取率较高，提取时选择二者皆可，又考虑到 溶剂回收的方便性，选用100％甲醇则更有利于甲醇溶剂的回收，因此本实验选用100％甲醇 作为提取溶剂。

2、不同提取时间对银杏叶中咖啡因提取率的影响

称取1g银杏叶粉末，甲醇浓度为100％，料液比(g:mL)为1:10，超声温度为30℃时，分别超声10min、35min、60min提取银杏叶中咖啡因，以提取时间为横坐标，咖啡因提取 率(ng/g)为纵坐标作图，见图1-2。

由图1-2可知，提取时间为10min时提取率最高，且超声10min具有节约时间、成本的 优点，因此本实验选择提取时间为超声10min。

3、不同料液比对银杏叶中咖啡因提取率的影响

称取1g银杏叶粉末，甲醇浓度为100％，提取时间为10min，超声温度为30℃时，分别采用料液比(g:mL)为1:10、1:30、1:50、1:100的溶剂量提取银杏叶中咖啡因，以料液比(g:mL)为横坐标，咖啡因提取率(ng/g)为纵坐标作图，见图1-3。

由图1-3可知，料液比在1:10～1:100的范围内，随着料液比的增大，提取率越高，且提 取率均较好，由此可知料液比在1:10～1:100的范围内皆可，在料液比为1:10时，峰面积的响 应值最高，且更节省溶剂，因此本实验选用的料液比为1:10(即称1g样品，溶剂用量为10mL)。

综上，因此本实验采用100％甲醇超声提取10min，料液比为1：10。

三、现有方法改进二

本发明的方法与现有文献“超高效液相-串联质谱法研究银杏叶提取物提取过程咖啡因的 转移规律(张苹苹等，食品工业科技，2019年22期，34-49，下面简称文献2)”方法的比较

1、提取溶剂单一，溶剂用量少，提取时间短，提取方法简单。

(1)现有文献2中银杏叶的提取方法：准确称取1.0g(精确到0.0001)银杏叶，置于250mL锥形瓶中，加入100mL 30％甲醇溶液超声1h，超声温度为30℃±0.5℃，根据实 际浓度适当稀释至线性范围内，用0.22μm滤膜过滤，装小瓶，供高效液相色谱－串联质谱 仪测定。

(2)本发明方法：取银杏叶样品适量，研成粉末，过四号筛，混匀。称取粉末1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10mL，密塞，称重，超声提取10min，放冷， 再次称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.2μm针筒式过滤器过滤，取续滤液，高速离 心15min，转数12000转/分钟，取上清液，备用。

(3)对比：

a文献2需甲醇30mL(提取溶剂为30％甲醇溶液，100mL溶液中含有30mL甲醇)， 本发明方法仅需甲醇10mL，节省了2倍的甲醇用量。

b文献2提取的溶剂为30％甲醇水溶液，本发明方法提取溶剂为纯甲醇。

c同样为超声提取，文献2提取时间为1h，而本发明方法仅需超声10min，节约时间50 min。

优势：本方法与现有文献2的方法在都能检测出银杏叶中咖啡因的基础上，具有节省溶 剂、溶剂单一、节省时间、回收便捷的优点，可用于快速、简便地检测银杏叶中的咖啡因等 成分。

四、总结

1、用本方法检测银杏叶中的咖啡因，检测限、定量限均低于现有方法。

(1)现有文献2方法检测限为5μg/kg，定量限为15μg/kg。

(2)本发明方法分别以信噪比S/N＝3、S/N＝10定义检测限和定量限，检测限、定量限 均在0.1ng/ml(即1μg/kg)以下。

2、本发明方法得到的咖啡因色谱峰峰形较好，目标峰与杂质峰分离效果明显。

采用文献2的方法得到的图见图2-1

本发明方法得到的图，见图2-2、2-3、2-4分别为甲醇空白溶剂、咖啡因对照品溶液、银 杏叶供试品溶液在测定条件下的多反应监测模式色谱图。该图表明在选用离子对195.11→138.065(定量)、195.112→110.037(定性)的测定条件下溶剂中无杂峰影响咖啡因 的测定，咖啡因对照品溶液中咖啡因的色谱峰不受杂质干扰、峰形优美，银杏叶供试品溶液 中咖啡因对应的峰与对照品峰保留时间一致，峰形也一致。该图充分说明该方法的有效、可 靠与成熟性。

本发明提供的方法具有以下优点：

1、方法比较

本发明提供的方法较为成熟，是以《食品中西布曲明等化合物的测定(BJS201701)》这 一标准方法为基础来建立的方法，相对来说，银杏叶中的咖啡因的检测比较难，原因：1)含 量极少(约1.5260×10^-6g/kg～61.1070×10^-6g/kg)；2)银杏叶粉末在具塞试管中容易聚集、不 易在溶剂中分散的性质；3)银杏叶中的咖啡因属于内源性物质。

基于上述原因，为了能够检测出银杏叶中的咖啡因，发明人进行了如下处理：

1)供试品处理方面：

因为咖啡因的含量太少，因此在银杏叶的处理上，就需要除去银杏叶上及内含的杂质， 本发明增加了两个处理：A研成粉末，过四号筛；B、0.2μm针筒式过滤器过滤，取续滤液， 高速离心15min，转数12000转/分钟，取上清液；

2)用纯甲醇溶解银杏叶，超声时间为10min，节省了时间，且溶出效果最佳；使用更合 适的具塞锥形瓶，常规方法中银杏叶药材粉末堆积在试管底部，超声提取时，粉末多在下部， 溶剂多在上部，使得每批银杏叶样品与溶剂接触充分程度不一致，导致结果差异性较大。而 用具塞锥形瓶，超声时药材粉末与提取容器接触充分，结果稳定性较好；

3)改变进样量与银杏叶中咖啡因含量太少有关，因此需适当增加进样量以达到定量标准。

2、本发明提供的方法，结果更加准确、稳定、可靠。