漆黄素在联合吉西他滨治疗胰腺癌中的应用
阅读说明：本技术 漆黄素在联合吉西他滨治疗胰腺癌中的应用 (Application of fisetin in combination with gemcitabine in treatment of pancreatic cancer ) 是由 曹利平 贾盛楠 赵冰冰 徐晓冬 丁国平 于 2021-09-26 设计创作，主要内容包括：本发明提供漆黄素的一种新的用途,是在联合吉西他滨来制备用于治疗胰腺癌的制品中的应用；所述的制品,为癌症化疗用制品。本发明发现漆黄素能增加胰腺癌吉西他滨化疗疗效,可用于抗胰腺癌吉西他滨化疗耐药制品的制备。本发明所提供的技术方案在胰腺癌临床治疗及更新化疗方案的研发等方面具有重要意义,也具有极好的临床转化和应用前景。(The invention provides a new application of fisetin, namely the application of fisetin in combination with gemcitabine in preparing a preparation for treating pancreatic cancer; the product is a product for cancer chemotherapy. The invention finds that fisetin can increase the curative effect of chemotherapy of gemcitabine for pancreatic cancer, and can be used for preparing a drug-resistant product for chemotherapy of gemcitabine for pancreatic cancer. The technical scheme provided by the invention has important significance in the aspects of clinical treatment of pancreatic cancer, research and development of updating chemotherapy schemes and the like, and also has excellent clinical transformation and application prospects.)
技术领域
本发明属于癌症治疗药品制备技术领域，具体涉及一种中药小分子化合物漆黄素(Fisetin)在联合吉西他滨(Gemcitabine，Gem)治疗胰腺癌中的应用。
背景技术
胰腺癌(PDAC)是临床常见的消化系统恶性肿瘤，由于其特殊的解剖位置和肿瘤生物学行为，胰腺癌恶性程度极高，预后极差，5年生存率仅为10％左右。
吉西他滨作为进展期胰腺癌的首选化疗药物及放疗增敏剂，可以在一定程度上提高患者的生存期和生活质量，但是部分胰腺癌患者由于存在吉西他滨获得性耐药，从而引发肿瘤进展导致化疗失败。但是治疗效果十分有限。因此，迫切需要新的治疗方法。
发明内容
本发明的目的是提供漆黄素在联合吉西他滨治疗胰腺癌中的应用，即利用漆黄素来增加胰腺癌吉西他滨化疗疗效的应用，从而弥补现有胰腺癌化疗耐药的不足。
本发明首先提供了漆黄素的一种新的用途，是在联合吉西他滨来制备用于治疗胰腺癌的制品中的应用；
所述的制品，为癌症化疗用制品；
本发明还提供一种用于胰腺癌化疗治疗的制品，所述的制品中包含有药理有效浓度的吉西他滨和漆黄素。
作为实施例的一种具体记载，其中漆黄素的浓度为50-100μM，吉西他滨的浓度为20μM。
本发明发现漆黄素能增加胰腺癌吉西他滨化疗疗效，可用于抗胰腺癌吉西他滨化疗耐药制品的制备。本发明所提供的技术方案在胰腺癌临床治疗及更新化疗方案的研发等方面具有重要意义，也具有极好的临床转化和应用前景。
附图说明
图1：漆黄素与吉西他滨联用对胰腺癌细胞的影响图，其中图A为不同浓度和时间的漆黄素与吉西他滨联用，对PANC-1细胞杀伤效果，在450nm处测量吸光度。数据表示为平均值±SD，图B为漆黄素和吉西他滨联用的药效。
图2：漆黄素与吉西他滨联用对小鼠皮下移植瘤的影响图，其中Con为对照组；Gem为吉西他滨。
图3：漆黄素与吉西他滨对胰腺癌细胞干性的影响图，其中Con为对照组；Gem为吉西他滨。
具体实施方式
申请人在研究中发现，漆黄素能增加吉西他滨对胰腺癌细胞的杀伤作用，能增加吉西他滨对皮下荷瘤小鼠肿瘤的抑制作用，并且漆黄素还能抑制胰腺癌细胞的干性，从而促成了本发明。
下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述：
实施例1：漆黄素能增强吉西他滨对胰腺癌细胞的杀伤作用
1、CCK8实验
将PANC-1细胞接种在96孔细胞培养板中，选择合适的铺板细胞数，每孔100μL细胞悬液，5个重复孔，37℃培养箱中培养，待细胞贴壁后，分别用漆黄素(50μM和100μM)、吉西他滨(20μM)以及二者联用(漆黄素50μM、100μM分别与吉西他滨20μM联用)处理24和48小时，无血清培养基加入10％CCK8的培养基，以换液的形式加入，37℃培养箱中培养2h，在波长450nm处，检测吸光度。
结果如图1所示，漆黄素和吉西他滨二者联用能明显抑制PANC-1细胞的活力，漆黄素可以显著增强吉西他滨效果。
实施例2：漆黄素能增强吉西他滨对小鼠皮下移植瘤的抑制作用
1、异种移植小鼠模型及小动物活体成像
动物实验按照实验动物护理和使用的机构指南进行。10只4周龄雌性BALB/c裸鼠获自中国科学院上海实验动物中心。通过在3％异氟醚麻醉下通过右肋下切口在肩部注射1×106PANC-1-荧光素酶细胞，在4至6周龄小鼠中建立皮下异种移植小鼠模型。将小鼠分成两组，每组五只小鼠。通过腹膜内注射用0.1mL DMSO处理对照组，漆黄素治疗组小鼠每隔一天用0.1mL漆黄素(0.559mmol/kg体重)治疗，吉西他滨治疗组小鼠每隔一天用0.1mL吉西他滨(0.19mmol/kg体重)治疗，二者联用治疗组小鼠每隔一天用漆黄素(0.559mmol/kg体重)和吉西他滨(0.19mmol/kg体重)共0.1mL治疗。使用3％异氟醚麻醉小鼠。然后给小鼠腹膜内注射200μL(15mg/mL)D-荧光素。15分钟后，使用IVIS Lumina Series III(Perkin Elmer，美国)对肿瘤进行成像。相同ROI应用于所有生物发光肿瘤。数据表示为平均辐射率(光子/秒/平方厘米/球面度)，这是光子发射的校准测量值。
结果如图2显示，与对照组相比，漆黄素和吉西他滨单独治疗的小鼠大小显著降低，与二者单独治疗组相比，漆黄素和吉西他滨联用治疗的小鼠肿瘤大小显著减少。
实施例3：漆黄素能增强吉西他滨对胰腺癌细胞干性的抑制作用
1、成球实验
将生长状态良好的细胞(PANC-1和HPC-Y5)消化后离心，去掉含血清培养基，用PBS清洗2次，使用干细胞培养基重悬细胞，计数，选择超低吸附细胞培养24孔板，每孔约5000个，补加4ml培养基，对照组使用DMSO处理，漆黄素处理组使用漆黄素(100μM)处理，吉西他滨处理组使用吉西他滨(20μM)处理，二者联合处理组使用漆黄素(100μM)和吉西他滨(20μM)处理，观察成球状态。
2、Western blot
按照细胞系的培养条件完成细胞培养，刮刀收取细胞，6000rpm，离心3分钟，弃上清。加入裂解液，冰上裂解30min，4℃，12000rpm，离心20min，留上清，BCA试剂盒检测蛋白浓度后，调整浓度一致后，上清加入4×SDS-PAGE loading buffer混匀。
根据蛋白的分子大小，配置10％SDS-PAGE分离凝胶，去离子水压齐，配置5％浓缩胶，插入梳子，凝固后，上样，电泳(恒压：浓缩胶80V、分离胶120V)分离蛋白。湿转法(恒流：300mA)将蛋白转移到甲醇激活的PVDF膜上，5％脱脂牛奶溶液封闭1h。TBST洗膜3次，孵育一抗稀释液过夜4℃，吸出一抗，TBST洗膜3次，室温下孵育二抗稀释液1h，化学发光仪显色。
实验结果如图3显示，与DMSO处理组相比，漆黄素能抑制两种细胞系的成球能力，而吉西他滨不能，与吉西他滨处理组相比，二联用可以抑制胰腺癌的成球能力。与对照组相比，漆黄素处理的细胞中CD44、CD24、Nanog、Sox2等干性指标均下降，表明漆黄素可以抑制肿瘤细胞干性。
在本发明的技术思路下，本领域的技术人员可以通过常规实验来确定漆黄素和吉西他滨的其它使用量关系。