苯并二呋喃酮类化合物在治疗难治性癫痫中的应用
阅读说明：本技术 苯并二呋喃酮类化合物在治疗难治性癫痫中的应用 (Application of benzodifuranone compound in treating intractable epilepsy ) 是由 邢春叶 孙鹏 范欣 于 2021-10-12 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种苯并二呋喃酮类化合物在制备治疗难治性癫痫药物中的应用,属于医药技术领域。本发明首次提出将苯并二呋喃酮类化合物用于治疗癫痫,尤其为难治性癫痫的治疗提供了新的候选药物。另外,本发明还提供了苯并二呋喃酮类化合物与丙戊酸钠联用的复方药物,二者在治疗难治性癫痫疾病中具有明显的协同效果。(The invention discloses an application of a benzodifuranone compound in preparation of a drug for treating intractable epilepsy, and belongs to the technical field of medicines. The invention firstly provides the application of the benzodifuranone compound in treating epilepsy, and particularly provides a new candidate drug for treating intractable epilepsy. In addition, the invention also provides a compound medicine combining the benzodifuranone compound and sodium valproate, and the compound medicine and the sodium valproate have obvious synergistic effect in treating intractable epilepsy.)
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体而言，涉及一种苯并二呋喃酮类化合物在制备治疗难治性癫痫药物中的应用。
背景技术
癫痫是一类常见的神经系统疾病，为慢性反复发作性短暂脑功能失调综合征，以脑神经元异常放电引起的痫性发作为特征。大部分患者应用抗癫痫药物(Anti-EpilepticDrugs)可得到很好控制，但仍有30％以上的患者对现有抗癫痫药物治疗无效，被称为难治性癫痫(Refractory Epilepsy,RE)。国际抗癫痫联盟定义RE为选择≥2种可耐受的抗癫痫药物经足够剂量及疗程治疗，在体内达到有效浓度后，仍不能控制发作的癫痫。而国内对RE的诊断是指无中枢神经系统占位病变或其他中枢神经系统疾病，频繁癫痫发作，每月发作≥4次，观察2年，应用合适的一线抗癫痫药物正规治疗且药物血药浓度在有效范围内，仍不能控制其发作，并影响日常生活。
癫痫的发病机制非常复杂，其全部机制至今也未能完全明了，不过越来越多学者认为，癫痫是一种以反复发作为特征的神经网络疾病。神经网络假说认为，神经网络中信号分子可诱导癫痫患者轴突的异常生长，包括轴突发芽、突触重组、神经发生和胶质增生等，以上改变可促进异常神经网络的形成，这不仅抑制内源性抗癫痫系统，同时还阻碍传统抗癫痫药物进入神经元兴奋靶点，最终导致RE发生[Tang,F,Hartz,AMS,Bauer,B.Drug-resistant epilepsy:multiple hypotheses,few answers.Front Neurol 2017；8:301.]。另外，癫痫频繁发作可引起进行性脑可塑性改变，形成异常神经网络，从而导致难治性癫痫形成。Jiang等[Jiang LW,Qian RB,Fu XM,Zhang D,Peng N,Niu CS,WangYH.Alteredattention networks and DMN in refractory epilepsy:A resting-state functionaland causal connectivity study.Epilepsy Behav 2018Nov；88:81-86PMID:30243110]收集RE患者和健康人在静息状态下功能性MRI数据分析发现，RE患者神经网络连接功能有所下降，癫痫发作可能干扰大脑神经网络的相互作用，并进一步影响神经元的信息交流。尽管神经网络假说不能解释所有RE的发病机制，但为深入发掘RE发病机制打开一个新的方向。未来深入研究异常神经网络在RE中的作用，对攻克RE和改善RE患者生活质量具有重要意义。
目前，癫痫的治疗主要以药物为主，然而对于难治性癫痫患者，现有的抗癫痫药物疗无效，虽然适当的手术治疗也被用来减轻患者的发作，但手术适应症、高风险、高费用等问题使其受到很大限制。因此，针对于不同作用机制研发靶向抗癫痫药物显得非常有必要。CN111499649A报道了一种从曲霉属真菌Aspergillus terreus CC-S06-18代谢产物中提取分离的苯并二呋喃酮类化合物Aspeterreurone A，并发现该化合物对胃癌细胞系有细胞毒性作用，并能诱导细胞周期停滞和凋亡。
发明内容
本发明人在多年来的临床工作中总结发现，反应性胶质细胞增生是癫痫的病理形态学特征之一，而发明人进一步的研究中发现苯并二呋喃酮类化合物Aspeterreurone A可通过抑制中性粒细胞浸润、微胶质细胞活化、反应性胶质增生减轻大鼠脊髓缺血再灌注损伤。因此，本发明人大胆地将Aspeterreurone A作为治疗难治性癫痫的潜在药物进行了前期研究，结果发现该化合物对氯化锂-盐酸匹罗卡品难治性癫痫模型大鼠具有明显的抗癫痫作用，可望开发成治疗难治性癫痫的药物。
为了进一步拓展苯并二呋喃酮类化合物更多的应用领域，本发明的目的是提供苯并二呋喃酮类化合物AspeterreuroneA在制备治疗哺乳动物癫痫(难治性癫痫)药物中的应用，其中AspeterreuroneA的化学结构式如下：
进一步优选地，所述哺乳动物选自大鼠、猴、犬或人。
另外，本发明还提供了一种治疗难治性癫痫的药物组合物，该药物组合物中活性成分由苯并二呋喃酮类化合物和丙戊酸钠组成，从而协同性治疗难治性癫痫。
进一步优选地，如上所述的治疗难治性癫痫的药物组合物，其中苯并二呋喃酮类化合物和丙戊酸钠的用量比为1：10～40。再进一步优选地，所述苯并二呋喃酮类化合物和丙戊酸钠的用量比为1：20。
进一步优选地，如上所述的治疗难治性癫痫的药物组合物，其通过加入药剂学上可接受的辅料后制备成胃肠道给予的制剂。
进一步优选地，如上所述的治疗难治性癫痫的药物组合物，每一单位制剂含有所述苯并二呋喃酮类化合物3.2～12.5mg及丙戊酸钠125mg。再进一步优选地，每一单位制剂含有所述苯并二呋喃酮类化合物5～8mg及丙戊酸钠125mg。
与现有技术相比，本发明首次提出将苯并二呋喃酮类化合物Aspeterreurone A用于治疗癫痫，尤其为难治性癫痫的治疗提供了新的候选药物。另外，本发明还提供了Aspeterreurone A与丙戊酸钠联用的复方药物，二者在治疗难治性癫痫疾病中具有明显的协同效果。
具体实施方式
为使本领域技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合具体试验例进一步描述，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的保护范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神下可以对技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。另外，以下实施例中采用英文缩写AtrA代替苯并二呋喃酮类化合物AspeterreuroneA，VPA代替丙戊酸钠。
实施例1 AspeterreuroneA对难治性癫痫细胞模型的影响试验
将培养至第7天的海马神经元随机分组为正常对照组(C组)、模型组(M组)、模型+0.1μMAtrA组(AtrA1组)、模型+1μMAtrA组(AtrA2组)、模型+10μMAtrA组(AtrA3组)，模型+100μMAtrA组(AtrA4组)。正常对照组换液为正常细胞外液培养3h后恢复为2mL维持培养基培养，模型组换液为无镁细胞外液培养3h后恢复为2mL维持培养基培养，各浓度AtrA组换液为无镁细胞外液培养3h后分别恢复为含终浓度为0.1μM、1μM、10μM、100μMAspeterreuroneA的维持培养基，将六孔板放回培养箱继续培养24h。
维持培养基组成和配制：神经元专用Neurabasal培养基98％(V/V)+B27补充剂2％(V/V)+0.2mol/L的L-谷氨酰胺。封口膜封住瓶口，置于4℃冰箱保存待用。
无镁细胞外液组成和配制：1L量杯放入转子接800mL双蒸水置于磁力搅拌上，电子天平精确称量下述药品：145mM NaCl，2.5mM KCl，10mM HEPES，2mM CaCl2，10mM葡萄糖，0.002mM甘氨酸，充分搅拌至溶解，用NaOH调节pH至7.2，双蒸水定容到1000mL，滤器加上0.22μm滤膜并用锡箔纸包好，洗净的玻璃瓶封口膜封口，二者高温高压灭菌，封口膜封住瓶口，置于4℃冰箱保存待用。正常细胞外液是在无镁细胞外液基础上添加1mM MgCl。
刚分离种植的海马神经元为圆形，透亮，无突起，呈单细胞悬浮状态。培养第3天，贴壁的海马神经元伸长出粗细不均的数个突起，胞体透亮，呈梭形、三角形等，相邻的神经元之间可有稀疏网络连接。培养至第5天的海马神经元，生长状态良好，立体感和折光性明显，胞体增大，突起延长交织成网。培养第7天的海马神经元，胞体增大饱满，有明显的光晕；神经元突起变多，轴突细长，神经元之间突起相互交织，形成稠密复杂但分布均匀的神经网络。
建模24h后(即培养的第8天)，正常对照组(C)神经元胞体饱满，交织成复杂但分布均匀有序的神经网络。在建模24h后，模型组(M)的海马神经元出现迁移、融合，有死亡的神经元漂浮，神经网格变得杂乱且分布不均。建模3h换液为正常维持培养基后，加入终浓度分别为0.1μM、1μM、10μM、100μM的AtrA，培养24h后神经元状态有不同程度的好转，融合的神经元不同程度减少，神经网格分布比较均匀，10、100μMAtrA组(AtrA3组、AtrA4组)即可见明显效果。加入终浓度为0.5g/L的MTT20μL，4h后终止培养，吸去孔内培养液，每孔加入150μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min。在酶联免疫检测仪于490nm处测量各孔的吸光度(A)值，测出A值后按下列公式计算加入Aspeterreurone A保护后细胞的相对活力：细胞相对活力(％)＝(AtrA组A值－M组A值)/(C组A值－M组A值)。
由于各孔的A值与细胞的活力成正比，因此经过测定A值并计算显示，AtrA1、AtrA2、AtrA3、AtrA4组的细胞相对活力分别是4.1％、62.9％、94.4％、95.0％。这说明1-100μM Aspeterreurone A对神经元细胞具有明显的保护作用，尤其是10-100μMAspeterreurone A可显著抑制难治性癫痫细胞模型中的神经元损伤。
实施例2：AspeterreuroneA对锂-匹罗卡品难治性癫痫大鼠的疗效研究
匹罗卡品是一种毒蕈碱的受体激动剂，它能够激活胆碱能神经元，破坏谷氨酸与γ-氨基丁酸的平衡。而氯化锂能增强匹罗卡品的功能。颞叶癫痫是最常见的难治性癫痫，而锂-匹罗卡品模型经常用于研究颞叶癫痫。锂-匹罗卡品模型的病理特点有炎症的产生、胶质细胞的增生、神经元大量丢失和苔藓纤维发芽，这与颞叶癫痫的神经病理特征相似。因此，本发明选用锂-匹罗卡品大鼠模型进行药效学实验研究。
健康雄性SD大鼠，体质量在180-220g范围内。实验开始后，首先建立氯化锂-盐酸匹罗卡品难治性癫痫模型，方法如下：腹腔注射氯化锂120mg/kg，20h后注射阿托品1mg/kg，30min后腹腔注射匹罗卡品50mg/kg。如未出现癫痫持续状态，则每隔30min继续腹腔注射匹罗卡品10mg/kg，直至大鼠出现4-5级癫痫并持续状态出现60min，腹腔注射水合氯醛300mg/kg终止发作。
癫痫发作急性期维持24h，然后开始为期两周左右的潜伏期，期间每天给予5％葡萄糖氯化钠注射液腹腔注射，2次/d，5ml/次，以补充营养。两周后进入慢性期，将造模成功的大鼠(执行Racine标准，4级以上发作为成功的癫痫模型)，随机分为模型对照组(M)、AspeterreuroneA组(AtrA)、丙戊酸钠组(VPA)、联合用药组(AtrA-VPA)，每组8只。另取8只未造模的正常大鼠作为空白对照组(C)。然后开始灌胃给药，具体给药剂量如表1所示，共给药6周。自药物治疗开始，记录治疗后6周内大鼠癫痫发作的总次数及总时间，各组的统计结果如表2所示。
表1：实验动物分组及给药
表2：各组大鼠癫痫发作总次数和总时间比较
与M组比较，*P＜0.05；与AtrA组比较，#P＜0.05；与VPA组比较，￥P＜0.05。
试验显示，空白对照组大鼠未发现有癫痫发作的现象，而造模大鼠癫痫发作总次数显著增加，癫痫发作持续总时间显著延长。根据表2的试验统计结果可以看出，与模型对照组比较，各给药组在一定程度上均能减少大鼠癫痫的发作总次数，同时缩短癫痫发作的总时间。尤其值得注意的是，与AtrA组、VPA组比较，AtrA-VPA组联合用药后大鼠癫痫发作总次数更低(P＜0.05)，癫痫发作持续总时间更短(P＜0.05)，其差异均具有统计学意义。具体分析上述实验结果可以得出，Aspeterreurone A联用丙戊酸钠的抗癫痫作用明显增强，其抗癫痫疗效大于二者之和，具有显著的协同增效作用。
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