白术内酯iii在制备抗肝纤维化药物中的应用
阅读说明：本技术 白术内酯iii在制备抗肝纤维化药物中的应用 (Application of atractylenolide III in preparation of anti-hepatic fibrosis drugs ) 是由 郑仕中 张峰 王飞虾 陈利 李章昊 杨婷 邵江娟 张自力 连娜琦 于 2021-10-29 设计创作，主要内容包括：本发明具体涉及白术内酯III在制备抗肝纤维化药物中的应用,本发明研究发现白术内酯III降低肝纤维化小鼠血清中ALT、AST、ALP的含量,降低肝纤维化小鼠血清中纤维化指标HA、LN、PCIII的含量,能够剂量依赖性地抑制HSC活化指标α-SMA和COL1α1表达,表明白术内酯III能用于制备抗肝纤维化药物。(The invention particularly relates to application of atractylenolide III in preparation of anti-hepatic fibrosis drugs, and researches show that atractylenolide III can reduce the content of ALT, AST and ALP in the serum of a hepatic fibrosis mouse, reduce the content of fibrosis indexes HA, LN and PCIII in the serum of the hepatic fibrosis mouse, and can inhibit the expression of HSC activation indexes alpha-SMA and COL1 alpha 1 in a dose-dependent manner, so that the atractylenolide III can be used for preparing the anti-hepatic fibrosis drugs.)
技术领域
本发明涉及一种化学成分-白术内酯III(Atractylenolide III)，尤其是涉及白术内酯III在制备抗肝纤维化药物中的应用。
背景技术
肝纤维化是各种慢性肝病发展中的共同病理过程，各种原因导致肝组织内细胞外基质成分过度增生与异常沉积，进而引起肝脏结构或功能异常改变，病情发展，可形成肝硬化导致肝脏功能障碍与衰竭，严重危害生命健康。延缓甚至逆转肝纤维化，对减少严重并发症的发生、改善病人生活质量具有重要意义。
肝纤维化的实质是肝组织内细胞外基质(ECM)的合成大于降解，导致大量ECM过度沉积在肝脏中。肝星状细胞(HSC)，又称储脂细胞、Ito细胞、维生素A储存细胞等，是肝脏间质细胞之一，位于肝细胞与肝窦内皮细胞之间的Disse间隙内，约占肝脏非实质细胞总数的1/3，与肝窦内皮细胞和肝细胞紧密接触。正常时呈静息状态，不合成或仅合成少量ECM，但在肝组织损伤时HSC活化并转变为肌成纤维细胞，大量增殖并获得迁移、收缩能力。活化的HSC形态和功能的改变奠定了HSC在肝纤维化形成中的关键作用。HSC的活化和增殖是肝纤维化发生、发展的中心环节。探讨抑制HSC活化的机制有效抗纤维化的药物至关重要，已引起国内外学者越来越多的关注。
近年来，国内外学者对肝纤维化的形成机制，提出了一系列抗肝纤维化治疗药物与方法，如应用肾上腺皮质素，干扰素等治疗，但这些药物的疗效不能肯定，虽然有秋水仙在抗肝纤维化方面的治疗得到了肯定，但其具有较大的毒副作用，不易长期服用。目前，我国已出现相关抗肝纤维化的复方，但其均为中药大复方粗制剂，具有服用量大，服用周期长，疗效不确切，治疗机理不明确等缺点。中药单体的研究近年来取得了较大成果，如姜黄素抗肝纤维化的机制已经明确，但胃肠道不易吸收。这就迫使我们需要寻求一种新的易吸收的、适合于临床应用的药物。
白术内酯III是中药白术根茎中的主要成分，目前研究显示，白术内酯III具有抗炎、胃保护和神经保护等多种作用。白术内酯III的抗肝纤维化活性，还未见任何报道。
发明内容
发明目的：提供白术内酯III在制备抗肝纤维化药物中的应用，所述疾病为肝纤维化。
本发明的技术方案如下：
本发明首次采用四氯化碳(CCl4)诱导的肝纤维化模型及活化型HSC细胞系HSC-LX2，评价了白术内酯III对肝功能及肝纤维化相关指标的影响；体外进一步明确白术内酯III对HSC活化的抑制作用，揭示白术内酯III的抗肝纤维化活性及分子机制，为将其制备为抗肝纤维化药物提供重要依据。
白术内酯III在制备抗肝纤维化药物中的应用，具体是通过研究白术内酯III作为制备抗肝纤维化药物中的药理作用及作用机制。
白术内酯III是中药白术根茎中的主要成分，分子式为C15H20O3，其结构式如下：
所述的白术内酯III主要通过体内观察白术内酯III对肝功能及肝纤维化相关指标的测定；体外对HSC活化等作用来研究白术内酯III的抗肝纤维化作用。实验结果表明，白术内酯III具有优良的抗肝纤维化活性，不管是在整体对肝纤维化模型，还是体外抑制HSC活化都有很强的作用。所述的白术内酯III是一种具有抗肝纤维化作用的新化合物，可以用于制备抗肝纤维化药物。
附图说明
图1为白术内酯III体内抗肝纤维化的作用。
图2为白术内酯III对HSC增殖的影响。
图3为白术内酯III对HSC的细胞毒性作用。
图4为白术内酯III对HSC活化指标α-SMA和COL1α1表达的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步地解释说明。
实施例1：观察白术内酯III对小鼠肝组织损伤及肝纤维化指标的影响。
雄性ICR小鼠48只，购自上海斯莱克实验动物有限公司，许可证号：SCXK(沪)2020-0025。动物自由进食、饮水，给予标准颗粒饲料，于标准光照周期(12小时光照、12小时黑夜)、室温22℃、恒湿环境中适应性饲养1周后开始实验。将四氯化碳(CCl4；分析纯，南京化学试剂有限公司)与橄榄油(山东鲁花集团有限公司)按体积比1:9制成10％橄榄油剂。白术内酯III购自成都植标化纯生物技术有限公司(批号：PCS0114，纯度99％以上，下同)，用橄榄油配置成溶液。动物随机分为六组：正常组、模型组、阳性药物秋水仙碱(colchicine)组(0.25mg/kg)、白术内酯III治疗低(20mg/kg)、中(30mg/kg)与高(40mg/kg)剂量组，每组8只。除正常组外的五组小鼠给予CCl4橄榄油溶液腹腔注射(0.5ml/kg)，每周3次，持续4周，从第5周开始口服给予秋水仙碱和白术内酯III不同剂量治疗4周，每天给药1次。实验结束后，每只小鼠称重并腹腔注射10％水合氯醛(0.2ml/20g)麻醉，眼眶取血后，剖开腹腔分离完整肝脏并称重，计算肝脏/体重比率。小鼠血液静置2h后，3000转/分钟下离心15min，取上清，-20℃冻存，备用。使用半自动生化仪检测小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)含量，使用ELISA试剂盒检测小鼠血清透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、III型前胶原(PCIII)的含量。
结果(1)：白术内酯III降低肝纤维化小鼠血清中ALT、AST、ALP的含量(表1)。在正常机体血清中这三种酶活性很低，当肝细胞损伤时，这些酶大量入血引起血液中这三种酶的活性升高，临床上也用ALT、AST、ALP作为比较敏感的肝功能检测指标，其升高标志着肝细胞膜和细胞器的损伤。
表1各组小鼠血清指标ALT、AST、ALP的检测结果(平均值±标准差)
注：与正常组相比#P<0.05，与模型组相比*P＜0.05，**P＜0.01
结果(2)：白术内酯III降低肝纤维化小鼠血清中纤维化指标HA、LN、PCIII的含量(表2)。HA是一种广泛存在于细胞外基质中的高分子多糖，由肝内间质细胞主要是HSC合成，HA可以反映肝脏的损伤程度和纤维化的发展变化。LN是一种大分子非胶原糖蛋白，由HSC合成后主要分布于基底膜的透明层中。PCIII是III型前胶原分泌至肝细胞外沉积前，PCIII升高反映的是肝脏纤维增生活跃。
表2各组小鼠血清肝纤维化指标HA、LN、PCIII的检测结果(平均值±标准差)
注：与正常组相比#P<0.05，##P<0.01，与模型组相比*P＜0.05，*P<0.01
以上结果表明：肝纤维化模型组动物ALT、AST、ALP、HA、LN、PCIII较正常组明显升高，具有显著意义；白术内酯III具有良好的抗肝纤维化作用，随着白术内酯III剂量的增加，ALT、AST、ALP、HA、LN、PCIII等肝损伤与纤维化指标下降明显，具有显著性差异。
结论：白术内酯III体内能够明显改善小鼠肝损伤及肝纤维化。
实施例2：实施例1小鼠肝脏组织，肝脏形态学拍照，肝脏组织4％多聚甲醛固定，包埋，切片做HE染色、天狼星红染色及Masson染色，观察肝纤维化肝脏病理及胶原沉积的影响。
模型组小鼠肝脏切片HE染色表示肝细胞变性、坏死，呈现大面积假小叶组织结构；Masson染色表示大量蓝色胶原纤维沉积，自汇管区周围向外延伸，纤维条索较粗且染色着色较深，表明胶原纤维较多；天狼星红染色表示各型胶原纤维自汇管区向外扩展，偏光镜下观察可见胶原沉积、扩展已形成假小叶，其中大量红色I型胶原纤维，少量疏网状II型胶原纤维和淡黄色IV型胶原纤维。
结果表明，四氯化碳诱导小鼠肝纤维化模型中肝脏结构紊乱，大量胶原沉积，肝纤维化病变明显。随着白术内酯III剂量的增加，肝脏的结构逐渐恢复，胶原沉积减少，肝纤维化病变减轻。
结论：白术内酯III缓解小鼠肝纤维化模型中肝纤维化进程。
实施例3：HSC体外培养，观察白术内酯III对HSC增殖的抑制作用(细胞增殖活性的检测)。
取对数生长期的HSC-LX2接种于96孔板，调整细胞悬液浓度使每孔1×104个细胞，以含10％胎牛血清的DMEM培养基，于37℃、5％CO2培养条件下培养24h使贴壁。细胞分为10组，除正常对照组外，其余9组细胞以白术内酯III(1、2、5、10、20、30、40、50、100μM)处理24h。每组设6个复孔。作用结束后，每孔加入5％浓度的噻唑蓝(MTT)溶液20μl，继续孵育4h。然后吸掉上清，每孔加入200μl DMSO，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶标仪490nm处测定各孔的吸光值。
实验结果显示，白术内酯III在30μM可显著抑制HSC的增殖，抑制作用随着剂量的增大而增强，呈现明显的剂量依赖性(图1)。
结论：白术内酯III能够显著抑制肝星状细胞的增殖。
实施例4：白术内酯III对肝星状细胞的细胞毒作用(细胞毒性测定)。
取对数生长期的HSC-LX2接种于96孔板，调整细胞悬液浓度使每孔1×104个细胞，以含有10％FBS的DMEM培养基，于37℃、5％CO2培养条件下培养24h使贴壁。细胞分为6组，除正常对照组外，其余5组细胞以白术内酯III(10、20、30、40、80μM)处理24h。每组设6个复孔。用乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒以微量酶标法检测细胞培养上清中LDH的活力，操作按照说明书方法进行。实验重复3次。
结果表明，白术内酯III在0至80μM剂量范围内与对照组相比，没有引起细胞上清中乳酸脱氢酶的活性的显著增高，提示在这一剂量范围内没有产生明显的细胞毒作用。
结论：白术内酯III在一定剂量范围内抑制肝星状细胞增殖的作用不是由于其直接细胞毒作用。
实施例5：白术内酯III对肝星状细胞中活化的关键蛋白α-SMA和COL1α1表达的影响。
HSC-LX2经药物白术内酯III处理(20、30、40μM)后，用冰冷的RIPA裂解缓冲液进行细胞裂解，收集细胞裂解物，-20℃储藏过夜。蛋白混合液融化，于4℃、12000rpm下离心15min，吸取上清以BCA法测定蛋白浓度。蛋白上样量为40μg，进行12％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，PVDF转膜，非特异性封闭；加入相应一抗，4℃过夜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗进行杂交。加入ECL发光液，以凝胶成像仪(Bio-Rad)进行成像与分析。
实验结果表明，白术内酯III能够剂量依赖性地抑制HSC活化指标α-SMA和COL1α1表达(图4)。
结论：白术内酯III通过抑制HSC活化发挥潜在的抗肝纤维化作用。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。