一种快速转化胞嘧啶的方法及所用试剂盒
阅读说明：本技术 一种快速转化胞嘧啶的方法及所用试剂盒 (Method for rapidly transforming cytosine and kit used in same ) 是由 张帆 贾泽川 于 2021-08-25 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种快速转化胞嘧啶的方法及所用试剂盒。所述转化试剂盒由DNA修饰液、M-结合液、M-洗涤液、L-脱硫缓冲液、M-洗脱液、I号柱或磁珠、收集管组成。各溶液按比例配制好后,可以更快速的对DNA胞嘧啶进行转化；所述洗涤液有利于清洗修饰过程中引入的其它成分,达到修饰DNA、纯化修饰DNA的目的。(The invention provides a method for quickly converting cytosine and a kit used by the method. The transformation kit consists of DNA modification liquid, M-binding liquid, M-washing liquid, L-desulfurization buffer solution, M-eluent, I-column or magnetic bead and collection tube. After the solutions are prepared in proportion, DNA cytosine can be converted more quickly; the washing solution is beneficial to cleaning other components introduced in the modification process, and the purposes of modifying DNA and purifying the modified DNA are achieved.)
技术领域
本发明涉及一种快速转化胞嘧啶的方法及所用试剂盒，属于表观遗传学领域。
背景技术
胞嘧啶甲基化是一种自然发生的碱基修饰，在原核生物和真核生物中都存在，在原核生物中，DNA甲基化提供了一种保护宿主DNA不被内切酶消化的方法，这种内切酶的目的是消除外来DNA。高等真核生物的DNA甲基化在基因表达调控中发挥作用。哺乳动物的大多数DNA甲基化发生在5'-CpG-3'二核苷酸中，尽管也存在其他模式。哺乳动物基因组中80％的5'-CpG-3'二核苷酸被发现是甲基化的，而其余20％未甲基化的大部分位于启动子或基因的第一个外显子中。已经证明，异常的DNA甲基化是癌症中普遍存在的现象，可能是肿瘤发生过程中最早发生的变化之一。DNA甲基化也被证明在基因印迹、胚胎发育、X染色体基因沉默和细胞周期调控中起着核心作用。有效和准确地检测和量化DNA甲基化的能力已经成为癌症、基因表达、遗传疾病和生物学许多其他重要方面的研究必不可少的。到目前为止，已经开发了许多方法来检测与量化DNA甲基化，包括：毛细管电泳(Fraga MF,etal.Electrophoresis.2000；21(14):2990-2994)和甲基化敏感的引物PCR(GonzalgoML.Cancer Res.1997；57(4):594-599.)等。然而，目前最常用的技术仍然依赖于亚硫酸氢盐转化。用亚硫酸氢盐化学处理DNA将非甲基化的胞嘧啶修饰成尿嘧啶，甲基化的胞嘧啶保持不变。
发明内容
本发明目的是为了解决现有技术中转化试剂盒在使用过程中转化不充分、转化时间长的问题，而提出基于亚硫酸氢钠的转化试剂盒。
为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
本发明一方面提供一种转化试剂盒。
本发明所提供的转化试剂盒由DNA修饰液、M-结合液、M-洗涤液、L-脱硫缓冲液、M-洗脱液、I号柱或磁珠、收集管组成。
其中，所述DNA修饰液用于将非甲基化的胞嘧啶修饰成尿嘧啶，M-结合液、M-洗涤液、L-脱硫缓冲液、M-洗脱液、I号柱或磁珠和收集管用于纯化修饰后的DNA。
所述DNA修饰液由亚硫酸氢钠、三(羟甲基)氨基甲烷组成，具体地，所述DNA修饰液的组成成分为：亚硫酸氢钠50g-80g/L，具体可为60g/L；三(羟甲基)氨基甲烷2g-10g/L，具体可为5.5g/L或8g/L。
所述M-结合液为吐温20水溶液，其中，吐温20的浓度可为3～15％(即，100ml水中含有3-15ml吐温20)；
所述M-洗涤液为体积浓度为80％的无水乙醇(即，100mlM-洗涤液中，无水乙醇80ml，水20ml)。
所述L-脱硫缓冲液为浓度为1-10mM三(羟甲基)氨基甲烷。
所述M-洗脱液为无DNase/RNase水；
所述I号柱的吸附膜的孔径为20～30um。
本发明另一方面提供一种如上所述的转化试剂盒的使用方法。
本发明所提供的含1号柱的转化试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
1)添加DNA修饰液到含有DNA样本的PCR管中，混匀，置于PCR仪上反应；
2)添加M-结合液到1号柱，并放到收集管上；
3)将步骤1)反应好的样本修饰液加入到步骤2)得到的装有M-结合液的1号柱上，混匀，离心，弃去收集管中的液体；
4)向步骤3)的1号柱上添加M-洗涤液，离心，弃去收集管中的液体；
5)向步骤4)的1号柱上添加L-脱硫缓冲液，常温放置15-20分钟，离心，弃去收集管中的液体；
6)向步骤5)的1号柱上添加M-洗涤液，离心，弃去收集管中的液体；重复操作一次；
7)将步骤6)的1号柱放到新的收集管上，加M-洗脱液，离心，收集洗脱液，得到纯化DNA修饰液。
上述方法步骤1)中，DNA修饰液与DNA样本的体积比可为110-150ul：20ul，具体可为130ul：20ul；
所述反应按以下程序进行：98℃反应8分钟，54℃反应60分钟；
步骤2)中，M-结合液与DNA样本的体积比可为200-800ul：20ul，具体可为600ul：
20ul；
步骤3)中，所述离心的条件可为：1000rpm离心30秒；
步骤4)中，所述M-洗涤液与DNA样本的体积比可为80-120ul：20ul，具体可为100ul：20ul；所述离心的条件可为：1000rpm离心30秒；
步骤5)中，所述L-脱硫缓冲液与DNA样本的体积比可为150-300ul：20ul，具体可为200ul：20ul；
所述离心的条件可为：1000rpm离心30秒；
步骤6)中，所述M-洗涤液与DNA样本的体积比可为150-300ul：20ul，具体可为200ul：20ul；所述离心的条件可为：1000rpm离心30秒；
步骤7)中，所述M-洗脱液与DNA样本的体积比可为5-20ul：20ul，具体可为10ul：20ul；
所述离心的条件可为：1200rpm离心30秒。
得到的纯化DNA修饰液可进行后续的甲基化检测或保存于-80℃冰箱。
本发明所提供的含磁珠的转化试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
1)添加DNA修饰液到含有DNA样本的PCR管中，混匀，置于PCR仪上反应；
2)添加M-结合液、磁珠到收集管中，加入步骤1)反应好的样本修饰液，混匀，振荡；
3)静置3-10(具体可为5分钟)分钟后，转到磁力架上再静置直到磁珠与悬液分离，去上清；
4)把收集管从磁力架上取下，加M-洗涤液，混匀，振荡，置于磁力架上直到磁珠与悬液分离，去上清；
5)添加L-脱硫缓冲液，混匀并振荡30，放置15-20分钟，置于磁力架上直到磁珠与悬液分离，去上清；
6)添加M-洗涤液，混匀并振荡，放置15-20分钟，置于磁力架上直到磁珠与悬液分离，去上清；
7)转移收集管到温浴加热，加入M-洗脱液，振荡混匀，55℃放置4分钟，置于磁力架上直到磁珠与悬液分离，收集悬液，得到纯化DNA修饰液。
上述方法步骤1)中，DNA修饰液与DNA样本的体积比可为110-150ul：20ul，具体可为130ul：20ul；
所述反应按以下程序进行：98℃反应8分钟，54℃反应60分钟；
步骤2)中，M-结合液、磁珠与DNA样本的体积比可为350-800ul：5-20ul：20ul，具体可为600ul：10ul：20ul；所述震荡为12000rpm振荡30秒；
步骤3)中，静置的时间可为5分钟；
步骤4)中，所述M-洗涤液与DNA样本的体积比可为150-500ul：20ul，具体可为400ul：20ul；所述震荡可为12000rpm震荡30秒；
步骤5)中，所述L-脱硫缓冲液与DNA样本的体积比可为50-300ul：20ul，具体可为200ul：20ul；所述震荡可为12000rpm振荡30秒；放置的时间可为15-20min；
步骤6)中，所述M-洗涤液与DNA样本的体积比可为150-500ul：20ul，具体可为400ul：20ul；所述震荡可为12000rpm振荡30秒；放置的时间可为15-20min；
步骤7)中，所述温浴加热可为在55℃加热模块中温浴20-30分钟；
所述M-洗脱液与DNA样本的体积比可为5-50ul：20ul，具体可为25ul：20ul；
所述震荡可为12000rpm振荡30秒；所述放置为55℃放置4分钟；
得到的纯化DNA修饰液可进行后续的甲基化检测或保存于-80℃冰箱。
与现有技术相比，本发现的有益效果为：
本发明的转化试剂盒包括DNA修饰液、M-结合液、M-洗涤液、L-脱硫缓冲液、M-洗脱液、I号柱或磁珠和收集管。所述溶液按比例配制好后，可以更快速的对DNA胞嘧啶进行转化；所述洗涤液有利于清洗修饰过程中引入的其它成分，达到修饰DNA、纯化修饰DNA的目的。
附图说明
图1为DNA胞嘧啶转化示意图。
图2为扩增区基因组原序列。
图3为甲基化胞嘧啶转化情况。
图4为非甲基化胞嘧啶转化情况。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
提供一种快速转化胞嘧啶的试剂盒，所述试剂盒包括：
试验例
本试验例使用实施例提供的快速转化胞嘧啶的试剂盒，所述的转化步骤为：
1、添加130ul的DNA修饰液到有20ul的DNA样本(甲基化与非甲基化DNA，zymoresearch公司，货号：D5014，扩增区基因组原序列如图2所示)的PCR管中，充分混匀。置于PCR仪上按以下程序进行反应：98℃反应8分钟，54℃反应60分钟。然后进行后续实验或4℃保存不超过20小时。
2、把反应好的样本修饰液加入到装有M-结合液(600ul)的1号柱上，混匀，1000rpm离心30秒。
3、添加100ul的M-洗涤液，1000rpm离心30秒。
4、添加200ul的L-脱硫缓冲液，常温(20-30℃)放置15-20分钟。1000rpm离心30秒。
5、添加200ul的M-洗涤液，1000rpm离心30秒；重复操作一次。
6、把1号柱放到新的收集管，加10ul的M-洗脱液，全速离收30秒。
7、得到的DNA使用(甲基化与非甲基化DNA，zymoresearch公司，货号：D5014)引物进行扩增，扩增产物进行测序。测序结果显示，甲基化的胞嘧啶都没有被转化(图3)，而非甲基化的胞嘧啶都有被转化(图4)。
实施例2
本实施例提供一种快速转化胞嘧啶的试剂盒，所述试剂盒包括：
试验例
本试验例使用实施例提供的快速转化胞嘧啶的试剂盒，所述的转化步骤为：
1、添加130ul的DNA修饰液到有20ul的DNA样本(甲基化与非甲基化DNA，zymoresearch公司，货号：D5014)的PCR管中，充分混匀。置于PCR仪上按以下程序进行反应：98℃反应8分钟，54℃反应60分钟。然后进行后续实验或4℃保存不超过20小时。
2、加600ul M-结合液、10ul磁珠到收集管中；加入1处理好的样本，混匀，12000rpm振荡30秒。
3、静置5分钟后，转到磁力架上再静置5分钟直到磁珠与悬液分离，去上清。
4、把收集管中磁力架上取下，加400ul M-洗涤液，混匀并12000rpm振荡30秒，置于磁力架上3分钟直到磁珠与悬液分离，去上清。
5、添加200ul的L-脱硫缓冲液，混匀并12000rpm振荡30秒，常温(20-30℃)放置15-20分钟。置于磁力架上3分钟直到磁珠与悬液分离，去上清。
6、添加400ul的M-洗涤液，混匀并12000rpm振荡30秒，常温(20-30℃)放置15-20分钟。置于磁力架上3分钟直到磁珠与悬液分离，去上清。
7、转移收集管到55℃加热模块中温浴20-30分钟，加入25ul的M-洗脱液12000rpm振荡30秒混匀，55℃放置4分钟。置于磁力架上1分钟直到磁珠与悬液分离，收集悬液。
8、得到的DNA使用(甲基化与非甲基化DNA，zymoresearch公司，货号：D5014)引物进行扩增，扩增产物进行测序。测序结果显示，甲基化的胞嘧啶都没有被转化(图3)，而非甲基化的胞嘧啶都有被转化(图4)。
本实施例转化DNA过程只需要60分钟，转化的结果(图3、图4)显示非甲基化的胞嘧啶都被充分的转化。
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