氟芬那酸作为有效成分在制备气道平滑肌舒张剂中的应用
阅读说明：本技术 氟芬那酸作为有效成分在制备气道平滑肌舒张剂中的应用 (Application of flufenamic acid as active ingredient in preparation of airway smooth muscle relaxant ) 是由 罗明志 倪凯 田姈玉 郭佳 刘磊 李晶晶 潘艳 邓林红 于 2021-09-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了氟芬那酸作为有效成分在制备气道平滑肌舒张剂中的应用。本发明经试验首次揭示了,化合物(CID:3371)能够活化苦味受体,并强效舒张气道平滑肌细胞,其舒张程度接近异丙肾上腺素和沙丁胺醇；提示化合物(CID:3371)可用于制备舒张气道平滑肌药物,也可用于制备气道平滑肌舒张剂,从而用于哮喘、慢性阻塞性肺部疾病等,具有广阔的应用前景。(The invention discloses application of flufenamic acid as an active ingredient in preparation of an airway smooth muscle relaxant. The test of the invention firstly reveals that the compound (CID:3371) can activate bitter receptors and effectively relax airway smooth muscle cells, and the relaxation degree of the compound is close to that of isoproterenol and salbutamol; the prompting compound (CID:3371) can be used for preparing a medicament for relaxing airway smooth muscle, and can also be used for preparing an airway smooth muscle relaxing agent, so that the compound is used for treating asthma, chronic obstructive pulmonary diseases and the like, and has wide application prospect.)
技术领域
本发明属于技术领域，具体涉及到氟芬那酸作为有效成分在制备气道平滑肌舒张剂中的应用。
背景技术
哮喘是一种常见的慢性呼吸道疾病，全球哮喘病人多达3亿人，尽管医药行业已经取得了很大的进步，仍给社会带来了较大的经济负担。全国共有哮喘患者接近5000万，并且其患病率正在逐年上升。虽然因为科学技术的不断发展，在一些地区出现了住院和死亡率的下滑，但再过去的20年里，哮喘造成的负担仍上升了20％。
哮喘的特征是具有反复发作的哮鸣、胸闷、肺阻塞和呼吸功能不全等症状，这些呼吸道症状主要是由呼吸道阻塞引起。气道平滑肌细胞存在于气道的中间和外围，呈螺旋状环绕气道。所以在哮喘中，气道平滑肌细胞收缩介导的气道狭窄是阻塞的重要原因。因此，目前研究方向主要集中在如何舒张哮喘中的气道平滑肌细胞。
目前，根据全球哮喘防治协议(2020版)用于治疗阻塞性气道疾病的药物主要分为两种：①缓解剂(支气管扩张剂)主要通过舒张气道平滑肌细胞来缓解气道阻塞，②控制剂(预防剂)主要抑制潜在的疾病并提供对症状的长期控制。吸入式β2-受体激动剂作为目前市面上最有效的支气管扩张剂可用于短时间内缓解呼吸困难等症状，但对重症哮喘患者的症状控制很差。虽然重症哮喘患者只占所有哮喘患者的5-10％，由于重症哮喘患者需要更昂贵的药物，更有可能住院或需要额外的医疗护理，所以重症哮喘患者治疗费用占哮喘卫生保健支出的一半以上。因此，寻找到新型的支气管扩张剂和具有不同作用机制的气道平滑肌舒张新药迫在眉睫。
近年来发现苦味受体(Bitter taste receptors，TAS2Rs)在调节气道平滑肌细胞收缩、舒张和增殖中起着至关重要的作用。因此，基于苦味受体发现的激动剂有可能是治疗哮喘等呼吸道疾病的潜在药物。
由于苦味物质种类繁多，截止2019年已经鉴定出来的苦味化合物在苦味剂数据库(BitterDB)中更新到了1000多种。但到目前为止，仍缺乏强效TAS2R 激动剂，可作为新的药物制剂用于重症哮喘患者。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述和/或现有技术中存在的不足，本发明经试验首次揭示了，化合物(CID:3371)可用于制备舒张气道平滑肌药物，也可用于制备气道平滑肌舒张剂，从而用于哮喘、慢性阻塞性肺部疾病等，具有广阔的应用前景。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：氟芬那酸作为有效成分在制备气道平滑肌舒张剂中的应用，所述氟芬那酸结构如式(I)所示：
具体的，结构如式(I)所示的化合物(CID:3371)，分子式为C14H10F3NO2，分子量为281.23g/mol，微溶于水。国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)规定的名称为：2-[3-(trifluoromethyl)anilino]benzoic acid。所述化合物的中文名称为：氟芬那酸。
作为本发明应用的一种优选方案，其中，所述化合物通过靶向苦味受体舒张气道平滑肌细胞。
所称“苦味受体”，苦味受体(Bitter taste receptors，TAS2Rs)是一类7次跨膜的G-蛋白偶联受体(GPCR)，味觉受体细胞中苦味的转导主要通过G蛋白及GPCR来完成，截止2019年已经鉴定出来的苦味化合物在苦味剂数据库 (BitterDB)中更新到了1000多种。
本发明的另一个目的是提供氟芬那酸作为有效成分在制备舒张气道平滑肌药物中的应用，所述氟芬那酸结构如式(I)所示。
作为本发明应用的一种优选方案，其中，所述化合物通过靶向苦味受体舒张气道平滑肌细胞。
作为本发明应用的一种优选方案，其中，所述舒张气道平滑肌药物为哮喘治疗药物。
所述“治疗”是指在有需要的受试对象中减轻、抑制和/或逆转哮喘的发展。术语“治疗”包括哮喘的成功治疗或改善的任何迹象，包括任何客观或主观参数，例如减轻；缓和；症状减少或使受试对象更容易容忍损伤、病理或病症；延迟或减缓发展速率等。治疗或改善的测量可基于例如所属领域已知的身体检查、病理学检查和/或诊断检查的结果。
治疗也可指与在不采取该措施的情况下将会发生的相比，减少哮喘的发病或发作，或减少哮喘复发(例如延长复发时间)。
本发明的另一个目的是提供一种舒张气道平滑肌的药物组合物，至少包含结构式如式(I)所示的化合物。
本发明的另一个目的是提供一种舒张气道平滑肌的药物制剂，含有安全有效量的结构式如式(I)所示的化合物，余量为药学上可接受的载体。
作为本发明舒张气道平滑肌的药物制剂的一种优选方案，其中，所述药物制剂为针剂或者喷雾剂。
所称“药学上可接受的载体”，包含生理学上相容的任意的或全部的溶剂、分散介质、包衣、等渗剂、吸收促进剂和吸收阻滞剂等。药学上可接受的载体的例子包含水、盐类溶液、磷酸缓冲生理盐水(PBS)、单糖类、二糖类、寡糖、多糖类(糊精、葡聚糖、异麦芽糖糊精、纤维素、普鲁兰多糖、甲壳质、壳聚糖、瓜尔胶、卡拉胶等)等糖质和它们的衍生物、甘油、乙醇等醇类等，它们可以单独或适当地组合使用。作为注射剂等使用时，可以将pH调节剂、等渗剂、例如上述糖质、甘露醇、山梨糖醇、麦芽糖醇等糖醇、或者氯化钠等中的 1种或多种适当地组合使用。
作为本发明舒张气道平滑肌的药物制剂的一种优选方案，其中，所述针剂中，药学上可接受的载体选择磷酸缓冲溶液或者生理盐水。
作为本发明舒张气道平滑肌的药物制剂的一种优选方案，其中，所述舒张气道平滑肌的药物制剂为治疗哮喘的药物制剂。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明经试验首次揭示了，化合物(CID:3371)能够活化苦味受体，并强效舒张气道平滑肌细胞，其舒张程度接近异丙肾上腺素和沙丁胺醇。提示化合物(CID:3371)可用于制备舒张气道平滑肌药物，也可用于制备气道平滑肌舒张剂，从而用于哮喘、慢性阻塞性肺部疾病等，具有广阔的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为本发明16种不同苦味物质对ASMCs的舒张能力对比图；
图2为本发明氟芬那酸量效关系的拟合曲线；
图3为本发明氟芬那酸和异丙肾上腺素的舒张效应比较图；
图4为本发明光学磁微粒扭转细胞分析的试验结果图；
图5为本发明氟芬那酸的气道舒张功能评价试验结果图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
除非另有说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见：
Ni,K.,Guo,J.,Bu,B.,Pan,Y.,Li,J.,Liu,L.,Luo,M.,and Deng,L.(2021).Naringin as a plant-derived bitter tastant promotes proliferat ion ofcultured human airway epithelial cells via activation of TAS2Rsignaling.Phytomedicine 84,153491.
Luo,M.,Yu,P.,Ni,K.,Jin,Y.,Liu,L.,Li,J.,Pan,Y.,and Deng,L.(2020).Sanguinarine Rapidly Relaxes Rat Airway Smooth Muscle Cells Dependent onTAS2R Signaling.Biological&pharmaceutical bulletin 43,1027-1034.
Luo,M.,Ni,K.,Yu,P.,Jin,Y.,Liu,L.,Li,J.,Pan,Y.,and Deng,L.(2019).Sanguinarine Decreases Cell Stiffness and Traction Force and Inhibits theReactivity of Airway Smooth Muscle Cells in Culture.molecular cellularbiomechanics 16,141-151.
WangY.,Lu Y.,Luo M.,Shi X.,DengL.(2016).Evaluation of pharmacologicalrelaxation effect of the natural product naringin on in vitro cultured airwaysmooth muscle cells and in vivo ovalbumin-induced asthma Balb/cmice.Biomedical Reports 5(6):715-722.
实施例1
(1)实验对象
原代培养人ASMCs
(2)实验仪器
光学磁微粒扭转细胞分析系统(OMTC)、活细胞工作站、可拆卸96孔板、超净工作台、CO2细胞培养箱、低速离心机、细胞计数板、恒温水浴锅、高压灭菌锅、共聚焦培养皿。
(3)实验流程
从BitterDB数据库中筛选出16种可以在10μM以下浓度激活苦味受体的苦味物质(氟芬那酸，山奈酚，1,10-菲啰啉，卡利普多，穿心莲内脂，苯甲地那铵，橙皮素，奎宁，氯奎，柚皮素，安息香，橘皮素，芹菜素，槲皮素，葫芦素E，青蒿琥酯)。细胞经上述16种不同苦味物质处理后用光学磁粒扭转细胞测量术检测细胞刚度的变化，从而评价这些苦味物质对ASMCs的舒张能力。
随后分析氟芬那酸(最终浓度0.01μM、0.1μM、1μM、10μM、100μM、 1000μM)的剂量依赖效应，并比较氟芬那酸与经典气道平滑肌舒张剂异丙肾上腺素(ISO)舒张由50mM氯化钾引起的收缩效应。
具体方法为，先将细胞接种于可拆96孔板中，接种密度为1×104/孔，贴壁生长24h后，换IT培养基培养12h，加入包被整合素抗体的磁性微珠，随后利用光学磁粒扭转细胞测量术动态检测细胞刚度不同化合物(100μM)处理后的变化。先检测基础状态下的细胞刚度1min，随后加入10μL不同苦味物质，检测细胞刚度从而反应细胞舒张程度。检测条件为：频率0.3Hz，检测时间为 5min。
(4)实验结果
实验结果发现，采用16种苦味物质在100μM浓度下处理ASMCs，只有11种可以显著降低ASMCs的细胞刚度，其中氟芬那酸对ASMCs细胞刚度下降最大，达到60％左右(见图1)。
检测氟芬那酸剂量依赖效应结果发现，不同测试浓度中氟芬那酸有5个浓度表现出显著舒张效应(0.1μM、1μM、10μM、100μM、1000μM)，量效关系曲线拟合计算得EC50＝10.02μM，拟合曲线见图2。
进一步分析比较氟芬那酸和异丙肾上腺素的舒张效应，结果发现先采用50 mM氯化钾先引起气道平滑肌细胞收缩后，氟芬那酸的舒张效应强于异丙肾上腺素(图3)。
上述实验结果提示氟芬那酸是一种强效ASMCs舒张剂。
实施例2
(1)实验对象
原代培养人ASMCs
(2)实验仪器
光学磁微粒扭转细胞分析系统(OMTC)、活细胞工作站、可拆卸96孔板、超净工作台、CO2细胞培养箱、低速离心机、细胞计数板、恒温水浴锅、高压灭菌锅、共聚焦培养皿。
(3)实验流程
先抑制ASMCs苦味受体及下游信号通路后再经氟芬那酸处理，用光学磁粒扭转细胞测量术检测细胞刚度的变化。具体方法为先将细胞接种于可拆96 孔板中，接种密度为1×104/孔，贴壁生长24h后，换IT培养基培养12h，采用靶向TAS2R14的siRNA处理ASMCs 48h降低苦味受体14表达、U73122(20 μmol/L)抑制磷脂酶C活性和PD98059(20μmol/L)抑制IP3R活性来抑制细胞苦味受体14信号通路后，加入包被整合素抗体的磁性微珠，随后利用光学磁粒扭转细胞测量术动态检测细胞刚度随不同浓度氟芬那酸处理后的变化。
siRNA转染过程是先在一个EP管中加入125μL Opti-MEM和8μL si-RNA (5nM)；在另一个EP管中加入125μL Opti-MEM和6μL Lipofectamine 3000 试剂。静置5min后，将后一管加入前一管中，室温静置混匀20min。孵育好的试剂分别加入需要转染的细胞里，约12h后，用1×PBS清洗细胞1-2次，更换成不含抗生素的正常培养基，继续培养24h。
细胞刚度的检测是先检测基础状态下的细胞刚度1min，随后加入10μL 不同浓度的氟芬那酸(最终浓度0.01μM、0.1μM、1μM、10μM、100μM、1000 μM)，检测细胞刚度从而反应细胞舒张程度。检测条件为：频率0.3Hz，检测时间为5min。
(4)实验结果
采用RNA干扰技术降低苦味受体14表达、U73122抑制磷脂酶C活性和 PD98059抑制IP3R活性来抑制细胞苦味受体14信号通路，结果发现氟芬那酸的舒张作用显著降低，提示氟芬那酸靶向苦味受体14发挥舒张功能(图4)。
光学磁微粒扭转细胞分析(OMTC)实验证明化合物(CID:3371)通过活化苦味受体14强效舒张气道平滑肌细胞。
实施例3
(1)实验对象
BALB/c小鼠
(2)实验仪器
FlexiVent小动物肺功能测量仪、超净工作台、恒温水浴锅。
(3)实验流程
采用FlexiVent小动物肺功能测量仪检测正常和哮喘模型小鼠气道阻力，评价氟芬那酸的气道舒张功能。实验首先是将动物随机分成6组：正常对照组、哮喘模型组(卵清蛋白处理)对照组、氟芬那酸高、中、低剂量组(8mg/kg、 4mg/kg、2mg/kg)与沙丁胺醇组(8mg/kg)，每组5只。
哮喘模型的建立过程是在第1、7天分别对每只小鼠腹腔注射200μL卵清蛋白致敏剂，在第14天给予腹腔注射100μL卵清蛋白致敏剂；正常对照组以生理盐水代替致敏剂注射，部位和剂量与实验组相同。第15天到第21天使用 6mL 1％卵清蛋白激发液雾化吸入，每天1次，每次30min，连续7天；正常对照组以生理盐水代替1％卵清蛋白进行雾化激发。
卵清蛋白应激小鼠诱导哮喘模型之后，在第22天，治疗组分别雾化吸入氟芬那酸8、4、2mg/kg剂量和沙丁胺醇8mg/kg，随后采用FlexiVent小动物肺功能仪检测各实验组气道阻力，参数设置为：潮气量10.72mL/kg(约250μL/ 次)，每分钟呼吸150次，呼吸末压力为3cm H2O；
FlexiVent小动物肺功能仪检测过程首先是将小鼠接动物呼吸机待呼吸基本平稳后，向雾化适配器内加入50μL生理盐水以及32.5mg/kg浓度的Mch，从而有道气道阻力超过基础值的4-5倍。随后雾化吸入舒张剂沙丁胺醇或者氟芬那酸，评价氟芬那酸雾化吸入后对小鼠肺阻力的影响。
(4)实验结果
采用乙酰胆碱刺激后分别雾化吸入沙丁胺醇和氟芬那酸，结果发现32.5 mg/kg乙酰胆碱单独刺激可以将气道阻力增加502％(正常组)和560％(哮喘组)，10mg/kg沙丁胺醇则显著降低气道阻力，而相同浓度氟芬那酸在哮喘组具有沙丁胺醇类似的舒张能力，提示氟芬那酸在动物水平也能强效舒张气道平滑肌(图5)。
小动物肺功能实验证明化合物(CID:3371)强效舒张小鼠气道平滑肌。
针对介导ASMCs舒张的苦味受体主要是TAS2R-5,-10,和-14，我们从BitterDB数据库中筛选出16种可以在10μM以下浓度激活苦味受体的苦味物质，采用光学磁微粒扭转细胞分析(OMTC)检测这些药物在100μM浓度下对ASMCs的舒张效应，结果发现在这16中苦味物质中氟芬那酸对ASMCs舒张效应最大，达到60％左右。随后发现氟芬那酸对ASMCs的舒张效应EC50值为10.02μM，并且0.1μM氟芬那酸就能够显著舒张ASMCs。进一步比较氟芬那酸和经典ASMCs舒张剂异丙肾上腺素(ISO)和沙丁胺醇对ASMC的舒张效应发现，相同浓度下氟芬那酸比ISO的舒张效果更显著，和沙丁胺醇的效果类似，这些发现表明氟芬那酸是一种强效ASMCs舒张剂。
本发明经试验首次揭示了，化合物(CID:3371)能够活化苦味受体，并强效舒张气道平滑肌细胞，其舒张程度接近异丙肾上腺素和沙丁胺醇。提示化合物(CID:3371)可用于制备舒张气道平滑肌药物，也可用于制备气道平滑肌舒张剂，从而用于哮喘、慢性阻塞性肺部疾病等，具有广阔的应用前景。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。