具体实施方式

为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。

以下实施例中，所用到的具体实验方法如下所示：

1、细胞培养和处理

采用HCC细胞系HCCLM3和Huh7细胞株来完成体外实验；并用一株兔鳞状细胞系VX2进行兔原位移植。这三种细胞来自复旦大学(中国上海)中山医院肝癌研究所。VX2细胞已被广泛用作经典的肝肿瘤模型。细胞在Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM，Gibco，Gibco，Grand Island，NY，USA)中培养，该培养基含有10％胎牛血清(FBS)和抗生素(青霉素(100U/ml)/链霉素(0.1mg/ml))。培养条件为37℃、5％CO₂、加湿环境，每周换液3次。

2、转染和稳定细胞系

使用Lipofectamine 2000试剂(Life Technology，Thermo Fisher Scientific，DE，USA)进行质粒转染，pcDNA3.1-SERPINE1、pcDNA3.1-VEGF和SERPINE1病毒(Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin)和2条siRNAs(siMETTL3:5'-GCUACCUGGACGUCAGUAUTT-3'(SEQ ID NO：1)，siIGF2BP1:5'-TCTGCAACTCGTTCACCGT-3'(SEQ ID NO：2))均购自Genechem(中国上海)。空载体用作阴性对照。转染程序严格遵循制造商对Lipofectamine2000试剂(Invitrogen)的说明。对于一组，将总共5×10⁵个细胞接种到6孔板的孔中。转染后，RT-qPCR分析或蛋白质印迹分析用于验证转染效率。

3、RNA提取和实时PCR

根据制造商的说明，通过RNA纯化试剂盒(EZbioscience，USA)提取总RNA。然后，使用4×Reverse Transcription Master Mix(EZbioscience)进行RT-PCR，使用无DNAase和RNAase的尖端(YueYiBioTech，上海，中国)。SYBR Green PCR试剂盒(Yeasen，中国)用于qPCR。根据2-ΔΔCt方法，将每个基因的表达水平标准化为ACTIN的表达水平，作为内部对照。

人类基因和兔基因的引物(由中国Sunya合成)如下：

人-肌动蛋白：

ACTIN-F:ACCTTCTACAATGAGCTGCG(SEQ ID NO：3)；

ACTIN-R:CCTGGATAGCAACGTACATGG(SEQ ID NO：4)。

人类-SERPINE1：

SERPINE1-F：ACCGCAACGTGGTTTTCTCA(SEQ ID NO：5)；

SERPINE1-R：TTGAATCCCATAGCTGCTTGAAT(SEQ ID NO：6)。

人类-METTL3：

METTL3-F:TTGTCTCCAACCTTCCGTAGT(SEQ ID NO：7)；

METTL3-R:CCAGATCAGAGAGGTGGTGTAG(SEQ ID NO：8)。

人类-IGF2BP1：

IGF2BP1-F:GCGGCCAGTTCTTGGTCAA(SEQ ID NO：9)；

IGF2BP1-R:TTGGGCACCGAATGTTCAATC(SEQ ID NO：10)。

兔肌动蛋白：

肌动蛋白-F:TGGCTCTAACAGTCCGCCTAG(SEQ ID NO：11)；

肌动蛋白-R:AGTGCGACGTGGACATCCG(SEQ ID NO：12)。

兔-Serpine1：

Serpine1-F：GCCTCTAAGGACCGCAATGT(SEQ ID NO：13)；

Serpine1-R：GCCGTGCTCTGCTCATCTAT(SEQ ID NO：14)。

4、RNA-seq分析

对于RNA-Seq分析，在构建文库后，使用github包SOAPnuke(v1.5.2)(https://github.com)操作测序数据以删除以下元素：使用测序适配器读取；低质量读数。随后，干净的读数被转换为FASTQ格式。HISAT2(v2.0.4)(http://www.ccb.jhu.edu/software/hisat)用于绘制干净读数。然后，通过Ericscript(v0.5.5)(http://rnaseq-mats.sourceforge.net/)或rMATS(V3.2.5)(https://bowtiebio.sourceforge.io/)融合剪接基因。之后，使用RSEM(v1.2.12)计算基因的表达水平(https://github.com/deweylab/RSEM)。最后，使用R(https://www.r-project.org/)进行Q值≤0.05的分析。GO(http://www.geneontology.org/)和KEGG(https://www.kegg.jp/)对注释不同表达基因的富集分析有助于我们了解表型的变化。

5、蛋白质印迹

在指定时间收获细胞。在每个极中，20μg的总蛋白质用于电泳。将膜用5％脱脂牛奶室温封闭1小时，然后与一抗在4℃下孵育过夜。随后，将相应的二抗应用于膜并在室温下孵育2小时。使用化学发光ECL试剂盒(Tanon，上海，中国)可视化蛋白质条带。使用的抗体如下：单克隆抗β-肌动蛋白抗体#A5441(Sigma)；抗Serpine1(AB2)抗体#AV47470(Sigma)；β-肌动蛋白(13E5)兔单克隆抗体#4970(CST)；PAI-1(D9C4)兔单克隆抗体#11907(CST)；抗VEGFA抗体[VG-1]#ab1316(Abcam)；METTL3(E3F2A)Rabbit mAb#86132(CST)；IGF2BP1#ab82968(abcam)。

6、GEPIA和HPA和STRING

通过GEPIA2(http://gepia2.cancer-pku.cn)和TCGA数据库(http://www.oncolnc.组织/)。应用的统计方法是采用对数秩检验的Kaplan-Meier方法。HPA数据库中HCC和正常肝组织的表达评分描述了估计的SERPINE1水平。STRING数据库(https://string-db.org/cgi/input.pl)已被广泛用于预测蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)，通过该数据库寻找可能与SERPINE1相互作用的蛋白质。

7、消融模型

采用新西兰白兔建立肝癌原位模型。兔子首先皮下种植VX2细胞。异种移植物长到约1cm³后，将其切成碎片(约2～3mm³)并准备移植。兔在异种移植物原位移植前12小时禁食。移植开始时，兔用2％戊妥钠麻醉并清洗皮肤。移植后用明胶海绵止血，连续3天使用青霉素40万单位。VX2兔模型建立2周后进行超声检查(意大利Esaote的MyLab Twice)，移植图为9.50±1.56mm(8mm-13mm)。激光烧蚀系统为Echo Laser X4(发射激光波长为1064nm，光纤直径为300um)。消融时功率选择4W，输出能量100J左右。破坏了肿瘤的1/3-2/3，建立了残留肿瘤(部分消融)模型，创造了亚致死热处理的条件。然后分别在消融后3天、7天和14天使用彩色多普勒超声和剪切波粘弹性检查病变。

8、荧光素酶报告基因检测

根据制造商的说明(11402ES60，Yeasen)进行荧光素酶报告基因检测。将HCCLM3和Huh7细胞接种在6孔板中，并用宽型SERPINE1响应荧光素酶报告构建体(SERPINE1-WT)、突变型SERPINE1响应荧光素酶报告构建体(SERPINE1-MUT)、宽型METTL3质粒转染，或相应地，IGF2BP1。在转染后24h时，将细胞裂解物与10μg/ml的萤火虫和TK分别孵育10分钟，并使用双荧光素酶报告基因检测系统(Promega，麦迪逊，威斯康星州，美国)和微孔板发光计(普罗麦加)。萤火虫荧光素酶活性被相应的海肾荧光素酶活性校正。结果代表三个独立实验。

9、酶联免疫吸附试验

细胞转染后，收集细胞培养上清液。使用人SERPINE1试剂盒(ab269373，abcam)和VEGF-A人ELISA试剂盒(BMS277-2，Thermofish，Invitrogen)按照制造商的说明分析SERPINE1和VEGF浓度。

10、RNA衰变分析

根据Qing等的研究进行了RNA衰减测定。简而言之，HCCLM3和Huh7细胞以50％的汇合度接种在6厘米的平板中。24小时后，将每个6厘米的平板重新接种到三个6厘米的平板中。48小时后，在胰蛋白酶消化和收集前的6小时、3小时和0小时加入放线菌素D至3mg/ml。通过柱上DNase-I消化步骤纯化总RNA。RNA量由RT-qPCR确定。mRNA衰减率是通过Qing等人描述的方程计算的，具体计算过程如下：

dC：mRNA浓度；

dt：特定时间；

-k_decay：mRNA衰减的速率常数；

C：mRNA浓度；

t：时间；

首先可以得到公式：

dC/dt＝-k_decay·C；

然后降解常数可以被估计为：

In(C/C₀)＝-k_decay·t；

C₀是降解初始浓度，因此降解一半的浓度计算则为：

In(1/2)＝-k_decay·t_1/2；

所以RNA降解一半所需时间为：

t_1/2＝In2/k_decay。

11、裸鼠皮下异种移植

为了模拟亚致死热处理皮下植入模型，将HCCLM3在46℃下加热10分钟，并接种到6厘米的培养皿中以模拟亚致死状态，然后如前所述，每天更换培养皿两次培养基。2天后，将5×10⁵稳定亚致死热处理的HCCLM3细胞皮下注射到BALB/C裸鼠体内。植入后7天，对照组每隔一天给予PBS 0.1ml，而PAI-039组则每隔一天口服1mg/kg Tiplaxtinin(PAI-039)。25天后，处死小鼠。

12、类器官

建立了HCC PDO类器官，使用3个PDO进行实验。对于加热组，在300g离心10分钟后收集PDO，然后在46℃下孵育10分钟。PAI-1抑制剂PAI-039(终浓度：10μmol/L)加入PDO培养中位数4-5天。然后加热的PDO继续传代，并在福尔马林固定前每2-3天拍摄一次类器官照片。PDO预先用1％琼脂糖(Biowest琼脂糖，111860)包埋，用4％磷酸盐缓冲的福尔马林固定，包埋在石蜡中，切成4μm以进行苏木精-伊红和免疫荧光分析，使用标准程序。

在进行免疫荧光染色过程中，使用了以下一抗：抗EpCAM(1:100；21050-1-AP；Proteintech)、抗AFP(1:200；14550-1-AP；Proteintech)、抗PAI1(1:100；ab66705)；Abcam)。第二种是Alexa Fluor 488偶联的山羊抗兔抗体(1:200；GB25303；Servicebio，中国)或Cy3偶联的山羊抗兔抗体(1：200；GB21303；Servicebio，中国)。细胞核用4,6-二脒基-2-苯基吲哚(Servicebio，China)复染。图像是用共聚焦显微镜(奥林巴斯)获得的。

13、人类肝癌样本

2021年期间，5名HCC患者在介入放射科接受活检，并被诊断为HCC。所有患者均提供书面知情同意书。

14、管形成试验

在Matrigel上通过HUVEC细胞形成管，将来自不同转染条件的HCCLM3或Huh7的上清液放入HUVEC细胞中。9小时后，对管形成进行摄影。

15、免疫组化

样品用不同浓度的乙醇脱水，最后包埋在石蜡中。将石蜡切片制成碎片并在60℃下干燥过夜。连续石蜡切片在脱蜡后在浓度降低的乙醇中再水化。根据制造商的说明(BOSTER，武汉，中国)使用SABC试剂盒。使用的一抗和二抗分别为人SERPINE1，PAI-1抗体(ab66705，abcam)。最后，通过相差显微镜(佳能，日本)对切片进行成像。

实施例1

PAI-1在亚致死消融后增加：

对亚致死热处理模型进行了RNA-seq测序，并获得了前25个上调的mRNA和前25个下调的mRNA的热图，如图1A所示。由于肿瘤血管对肿瘤的存活至关重要，因此基于GO术语“正向调节血管生成”、“血管生成”、“细胞外外泌体”之间绘制了维恩图。结果显示了8个“交叉基因”，即“SERPINE1、RAPGEF3、ECM1、PRKD2、PRKCA、ERAP1、CAST、GAB1”，其中，“SERPINE1”具有最明显的变化，亚致死热处理组比对照组增加至少16倍，如图1B所示。这表明SERPINE1可能是HCC亚致死热处理后血管生成的关键蛋白。

此外，验证了SERPINE1的mRNA和蛋白质水平的变化。亚致死热处理后SERPINE1的mRNA和蛋白质表达水平增加，如图1C所示。随后通过分析TCGA数据库检查SERPINE1在HCC中的功能，分析TCGA数据库中SERPINE1高表达和低表达患者的总体存活率，LIHC数据集显示SERPINE1高表达组的存活时间较短，如图1D所示。另一方面，通过检测HCC不同阶段SERPINE1的水平发现，随着肿瘤分期的发展，患者具有更高的SERPINE1表达，如图1E所示。通过HPA数据库分析SERPINE1的典型蛋白质水平，HPA数据集表明，HCC患者的SERPINE1表达高于对应患者，如图1F所示，这与我们的病例一致，SERPINE1在接受切除的患者的HCC中表达高于癌旁组织中表达，如图1G所示。为了通过亚致死热处理模拟HCC，使用VX2建立了消融兔HCC模型，如图1H所示，图1I表示成功建立VX2肝癌原位模型，代表性肿瘤为7×7cm²。使用超声波精确定位异种移植物并控制消融区域，并使残留的HCC生长，如图1J所示，微波消融的功率为4W，输出能量100J左右。通过超声图像观察微波消融后1天、3天、7天、14天的一般情况，并对消融后第7天进行超声造影，结果如图1K所示。H.E.染色前后显微镜下观察消融部分周围的残留肿瘤和正常肝脏，可观察到残留的HCC组织存活下来，如图1L所示。通过检测SERPINE1的相对mRNA表达水平和蛋白表达水平升高，结果显示，与未消融组相比，消融后第3天和第7天SERPINE1的mRNA表达水平和蛋白表达水平升高，之后，SERPINE1的相对表达水平在消融7天之后逐渐减少，如图1M所示。

实施例2

SERPINE1在亚致死热处理后部分通过VEGF促进血管生成：

为了进一步研究SERPINE1的具体机制，在实验中建立了SERPINE1敲低的细胞，并使用了SERPINE1抑制剂PAI-039进行处理，结果显示，HCCLM3和Huh7细胞系在37℃培养条件下，敲低SERPINE1后mRNA表达水平和蛋白表达水平降低，46℃培养条件可部分恢复SERPINE1的mRNA表达水平和蛋白表达水平，如图2A所示。此外，HCCLM3和Huh7细胞系在37℃培养条件下，SERPINE1抑制剂PAI-039使SERPINE1的mRNA转录水平和蛋白表达水平下降，46℃培养条件可部分恢复SERPINE1的mRNA和蛋白表达水平，如图2B所示。当SERPINE1基因敲低或PAI-039抑制时，上清液中SERPINE1的分泌显著减少。之后进行酶联免疫吸附试验，ELISA显示在HCCLM3细胞系在37℃培养条件下，敲低SERPINE1后细胞外上清液中SERPINE1的水平下降，46℃培养条件可部分恢复SERPINE1的水平，而ELISA显示Huh7细胞系在37℃培养条件下，敲低SERPINE1后细胞外上清液中SERPINE1的水平下降，46℃培养条件却无法显著恢复SERPINE1的水平，如图2C所示。因此，在HCCLM3细胞中，亚致死热处理挽救了SERPINE1敲低或应用PAI-039的部分影响，然而，在Huh7细胞中加入PAI-039抑制剂却没有观察到这种现象。

收集来自HCCLM3或Huh7的在不同处理条件下获得的上清培养HUVEC 48小时。与直接使用37℃培养条件的上清液相比，使用敲低SERPINE1后细胞外上清液中培养后管形成数量显著降低，使用46℃培养条件获得的上清液可部分恢复管形成数量，如图2D所示；收集来自HCCLM3或Huh7的在不同处理条件下获得的上清培养HUVEC 48小时。与直接使用37℃培养条件的上清液相比，使用加入PAI-039后的培养上清液后管形成数量显著降低，而使用46摄氏度培养条件的上清液可显著增加管形成数量，如图2E所示。管形成试验表明，在病毒或PAI-039抑制SERPINE1的条件下，用上清液培养后，HUVEC降低了管形成能力。然后，通过STRING(https://string-db.org)分析了蛋白质-蛋白质相互作用，结果显示与SERPINE1潜在相关蛋白较多，SMAD家族和VEGF的一些成员与SERPINE1接近；此外，在TCGA LIHC数据集中，SMAD2、SMAD3、SMAD7和VEGFA与SERPINE1显著相关其中，VEGF与SERPINE1的相关性系数R值高达0.37，强烈表明SERPINE1与VEGF之间存在关联，如图2F所示。在HCCLM3和Huh7肝癌细胞中，SERPINE1敲低后VEGF的蛋白水平表达显著降低，而在46℃培养条件下，VEGF的表达水平可以增加，如图2G所示。在HCCLM3和Huh7肝癌细胞中，SERPINE1敲低后，上清液中VEGF的相对表达量显著降低，在加入VEGF后细胞外VEGF表达水平升高，如图2H所示。正如预期的那样，VEGF随着HCCLM3和Huh7中SERPINE1的抑制而降低，同时，分泌的VEGF也减少了。HCCLM3和Huh7细胞在46℃条件下进行培养，SERPINE1被敲除后VEGF表达降低，加入VEGF后，SERPINE表达无明显变化，如图2I所示。接下来，进行HUVEC的管形成试验，收集来自HCCLM3或Huh7的上清液并用于培养HUVEC 48小时。使用46℃+SERPINE1敲低的上清液处理后，管形成数量降低，当加入VEGF处理后的细胞上清液时，管形成数量增加，如图2J所示。因此，结果表明额外的VEGF可以促进通过抑制SERPINE1促进管形成。

实施例3

METTL3/IGF2BP1/m6A轴正向调节SERPINE1：

在之前的研究表明METTL3在亚致死热处理后促进HCC的侵袭。而血管生成与HCC的侵袭呈正相关。因此，接下来通过实验验证METTL3是否可以在血管生成中调节SERPINE1。当在HCCLM3或Huh7中敲低METTL3时，加入PAI-1后，SERPINE1的mRNA表达水平升高，METTL3的mRNA表达水平无明显变化，如图3A所示。当在HCCLM3或Huh7中加/不加SERPINE1敲低METTL3时，相对METTL3和SERPINE1蛋白水平变化如图3B所示。以上结果表明，抑制METTL3会降低SERPINE1在mRNA水平和蛋白质水平的表达，额外的SERPINE1可以部分挽救SERPINE1水平，但对METTL3没有影响。在HCCLM3或Huh7中，SERPINE1被敲低后，METTL3 mRNA表达水平无明显变化，抑制SERPINE1并没有抑制METTL3的表达，如图3C所示。上面的数据表明，METTL3可能位于SERPINE1的上游。由于METTL3是一种甲基转移酶，为了验证SERPINE1是否以m6A方式受METTL3调控，接着在RMBase 2.0(http://rna.sysu.edu.cn/rmbase)上分析了SERPINE1的m6A修饰位点。结果，有超过40个预测m6A位点，如图3E所示。

根据预测，通过选择两个基序得分最高的m6A修饰位点(紫色的)及其相邻的m6A位点来构建SERPINE1-mutant(SERPINE1-MUT)质粒。采用野生型或m6A共有序列突变体SERPINE1 cDNA与萤火虫荧光素酶报告基因融合，荧光素酶测定表明SERPINE1用METTL3强烈增加了萤火虫/海肾的活性，但SERPINE1-MUT不能，如图3F所示，SERPINE1的m6A共有序列的突变解除了HCCLM3和Huh7中SERPINE1与METTL3的转录后抑制结果。随后，进行HUVEC的小管形成实验，收集来自HCCLM3或Huh7的上清液并用于培养HUVEC 48小时。条件是46℃，敲除METTL3，加入PAI-1后增殖扩增能力提高，如图3G所示。因此，METTL3的沉默可以抑制小管形成能力，但SERPINE1的过表达可以挽救这种影响测定。46℃下有/无加SERPINE1敲低METTL3条件下的RNA稳定性，结果如图3H所示。在HCCLM3或Huh7细胞系中，当IGF2BP1被敲低后，IGF2BP1和SERPINE1在转录和翻译水平显著下降，如图3I所示。在HCCLM3或Huh7中，当SERPINE1被敲低后，IGF2BP1和SERPINE1在转录组和翻译水平显著下降，如图3J所示。采用野生型或m6A共有序列突变体SERPINE1 cDNA与萤火虫荧光素酶报告基因融合，荧光素酶测定结果如图3K所示。结果表明，SERPINE1的m6A共有序列的突变解除了HCCLM3和Huh7中SERPINE1与IGF2BP1的转录后抑制。

实施例4

SERPINE1在亚致死热处理下在类器官中上调：

进一步使用HCC PDO模型来验证SERPINE1的功能。在46℃10分钟的热处理后，HCCPDO表现出上皮表型，如更大的侵袭伪足形成和不规则的成纤维细胞样形状。添加SERPINE1抑制剂PAI-039(10μM)，表型可在一定程度上逆转，如图4A所示。HE染色表明PDO表现出假腺体组织学结构，如图4B所示。免疫荧光染色表明三个PDO表现出HCC的典型特征，例如AFP的阳性表达和EpCAM的阴性，如图4C-4E所示。通过检测SERPINE1的表达水平发现，SERPINE1的表达水平在经过热处理的PDO中显着更高，并且这种影响可以通过添加PAI-039来减弱，如图4C-4F所示。以上结果表明，在三维PDO模型中，热处理也刺激了SERPINE1的表达，这种作用可以被SERPINE1抑制剂PAI-039逆转。

实施例5

PAI-039在亚致死热处理后有效抑制体内SERPINE1的表达：

将10只雌性BALB/c裸鼠接受了亚致死热处理的HCCLM3注射，如图5A所示。其中5只接受生理盐水，另外5只每隔一天接受PAI-039。第25天实验结束，处死小鼠，通过建立亚致死热损伤HCCLM3皮下异种移植模型考察SERPINE1抑制剂PAI-039在亚致死热治疗后的体内作用，与对照组相比，PAI-039组显示出更小的异种移植体积，如图5B所示，注射PAI-039显著抑制肿瘤生长。两组均表现出恶性增长，如图5C所示。免疫组化结果显示，与对照组相比，PAI-039组的SERPINE1表达水平显著降低，如图5D所示，正如预期的那样，与对照组相比，PAI-039组显示出更少的SERPINE1表达。值得注意的是，免疫组化结果显示，与对照组相比，PAI-039组的VEGF表达水平显著降低，如图5E所示。这些数据表明，PAI-039可以抑制亚致死热处理后的体内异种移植。

上述实施例仅为本发明的优选实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 复旦大学附属中山医院

<120> SERPINE1抑制剂在肝细胞癌微波消融术后抗复发转移中的用途

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcuaccugga cgucaguaut t 21

<210> 2

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tctgcaactc gttcaccgt 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

accttctaca atgagctgcg 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cctggatagc aacgtacatg g 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

accgcaacgt ggttttctca 20

<210> 6

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttgaatccca tagctgcttg aat 23

<210> 7

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ttgtctccaa ccttccgtag t 21

<210> 8

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccagatcaga gaggtggtgt ag 22

<210> 9

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ccagatcaga gaggtggtgt ag 22

<210> 10

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ttgggcaccg aatgttcaat c 21

<210> 11

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tggctctaac agtccgccta g 21

<210> 12

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

agtgcgacgt ggacatccg 19

<210> 13

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gcctctaagg accgcaatgt 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gccgtgctct gctcatctat 20