一种基于maldi-tof的产气荚膜梭菌鉴定方法
阅读说明：本技术 一种基于maldi-tof的产气荚膜梭菌鉴定方法 (Identification method of clostridium perfringens based on MALDI-TOF ) 是由 陈佳 于 2021-08-31 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于MALDI-TOF的产气荚膜梭菌鉴定方法,包括以下步骤：A、取产气荚膜梭菌一代新鲜培养物划线接种于PCA平板,制备产气荚膜梭菌标准样品；B、使用甲酸萃取法处理产气荚膜梭菌样品,获取菌株样品蛋白,通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱获得样品的质谱图,选取特定峰值范围的质谱峰作为特征峰；C、使用甲酸萃取法处理产气荚膜梭菌样品,获取菌株样品蛋白,通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱获得样品的质谱图,针对步骤B中选取的特征峰进行二级质谱检测,得到鉴定结果。本发明能够实现食品中产气荚膜梭菌的快速检测。(The invention discloses a method for identifying clostridium perfringens based on MALDI-TOF, which comprises the following steps: A. streaking and inoculating a primary fresh culture of clostridium perfringens on a PCA plate to prepare a clostridium perfringens standard sample; B. processing a clostridium perfringens sample by using a formic acid extraction method to obtain strain sample protein, obtaining a mass spectrogram of the sample by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry, and selecting a mass spectrum peak in a specific peak value range as a characteristic peak; C. and (C) processing a clostridium perfringens sample by using a formic acid extraction method to obtain strain sample protein, obtaining a mass spectrogram of the sample by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry, and performing secondary mass spectrometry on the characteristic peak selected in the step (B) to obtain an identification result. The invention can realize the rapid detection of clostridium perfringens in food.)
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，尤其是一种基于MALDI-TOF的产气荚膜梭菌鉴定方法。
背景技术
产气荚膜梭菌是一种重要的致病菌，在我国，生的肉制品、水产品中存在较严重的产气荚膜梭菌污染。因此，快速准确的鉴定方法对于产气荚膜梭菌的日常检测具有重要意义。
目前常见的食品中产气荚膜梭菌的检测方法普遍使用传统常规培养生理生化检测方法，此方法存在不少弊端。传统常规培养生理生化法，即利用微生物的形态及常规生理生化特性进行检测，通常是包括微生物形态学以及培养特性的评价。其无特殊设备要求，并且方法经典可靠，具有准确、直观、稳定性好且假阳性低的优点。但检测周期长，费时费力，且存在漏检率，很难满足市场快速准确的检测需求。基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱是近年来发展的一种新型的分析技术，具有操作简单、快速、谱图直观、能耐受一定浓度的盐和去垢剂等特点，可针对蛋白质组与生物标志物进行更高灵敏、高精度、高分辨率的快速分析研究，实现对未知微生物的快速鉴定、分型、溯源等。
目前，在科研和实际应用上，均亟需将基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱应用到食品中产气荚膜梭菌的鉴定中，开发出食品中产气荚膜梭菌的快速检测方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种基于MALDI-TOF的产气荚膜梭菌鉴定方法，实现食品中产气荚膜梭菌的快速检测。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。
一种基于MALDI-TOF的产气荚膜梭菌鉴定方法，包括以下步骤：
A、取产气荚膜梭菌一代新鲜培养物划线接种于PCA平板，制备产气荚膜梭菌标准样品；
B、使用甲酸萃取法处理产气荚膜梭菌样品，获取菌株样品蛋白，通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱获得样品的质谱图，选取特定峰值范围的质谱峰作为特征峰；
C、使用甲酸萃取法处理产气荚膜梭菌样品，获取菌株样品蛋白，通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱获得样品的质谱图，针对步骤B中选取的特征峰进行二级质谱检测，得到鉴定结果。
作为优选，步骤A中，培养温度为36℃，培养时间为24h。
作为优选，步骤B中，具体包括以下步骤，
B11、样品前处理，挑取产气荚膜梭菌标准样品，转移至2mL离心管中，加入300μL灭菌水，充分振荡均匀后，加入900μL无水乙醇，涡旋至少一分钟，放入离心机，设置转速为13000rpm，离心时间2min，重复2次，离心后，倒掉上清液，保留取沉淀；
B12、样品靶板制作，向标准样品沉淀加入50μL 70％甲酸振荡2 min，然后加入50μL乙腈再次振荡2min，放入离心机，设置转速为13000rpm，离心时间2min，保留上清，取1μL加到基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱靶板上，待溶液挥发干后，加1μL基质，等质谱靶板完全干燥；
B13、质谱校准，将用于质谱对照的标准大肠杆菌划线接种于PCA 平板，每次检测样品使用标准大肠杆菌的11个特征峰进行校准；
B14、筛选特征峰，使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行鉴定，每个样品需独立检测3次，3次检测均反馈检测结果，从中挑选产气荚膜梭菌的特征峰。
作为优选，步骤B中，具体包括以下步骤，
B21、向装有HCCA的旋盖存液管中添加250μL标准溶剂，标准溶剂含有乙腈50％、水47.5％、三氟乙酸2.5％，振摇并涡旋使HCCA 完全溶解，得到浓度为10mgHCCA/mL的基质溶液；
B22、向装有BTS的管中加入50μL标准溶剂，用移液枪反复吹打至少20次使其完全溶解；
B23、室温下放置BTS溶液5分钟，然后上下吹打混合至少20次；
B24、在室温下离心，离心时间为2min，离线转速为13000rpm，留取上清液；
B25、将1μL BTS溶液放置在MALDI靶板上定义为验证的靶位，室温下晾干；
B26、将1μL HCCA基质溶液仔细涂敷在样本上，室温下晾干；
B27、在MALDI靶板上选取合适的靶位，将1μL产气荚膜梭菌靶板样品溶液放置在靶位上，室温下晾干；
B28、将1μL HCCA基质溶液仔细涂敷在待测的产气荚膜梭菌样品上，室温下晾干；
B29、使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行检测，得到产气荚膜梭菌的质谱图；根据质谱图，选出产气荚膜梭菌的特征峰。
作为优选，步骤C中，具体包括以下步骤，
C11、样品前处理，挑取产气荚膜梭菌标准样品，转移至2mL离心管中，加入300μL灭菌水，充分振荡均匀后，加入900μL无水乙醇，涡旋至少一分钟，放入离心机，设置转速为13000rpm，离心时间2min，重复2次，离心后，倒掉上清液，保留取沉淀；
C12、样品靶板制作，向标准样品沉淀加入50μL 70％甲酸振荡2 min，然后加入50μL乙腈再次振荡2min，放入离心机，设置转速为13000rpm，离心时间2min，保留上清，取1μL加到飞行质谱靶板上，待溶液挥发干后，加1μL基质，等质谱靶板完全干燥；
C13、质谱校准，将标准大肠杆菌划线接种于PCA平板，每次检测样品使用标准大肠杆菌的11个特征峰进行校准；
C14、鉴定，使用基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱，针对步骤B14筛选出的产气荚膜梭菌特征峰进行二级质谱检测，通过观察谱图中的谱峰进行鉴定。
作为优选，步骤C中，具体包括以下步骤，
C21、在MALDI靶板上选取合适的靶位，将1μL产气荚膜梭菌靶板样品溶液放置在靶位上，室温下晾干；
C22、将1μL HCCA基质溶液仔细涂敷在待测的产气荚膜梭菌样品上，室温下晾干；
C23、使用基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱对筛选出的特征峰进行二级质谱检测；
C24、将产气荚膜梭菌特征峰下的二级质谱图进行对比，通过观察谱峰的特异性进行鉴定。
采用上述技术方案所带来的有益效果在于：本发明结合基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱技术的精准分析，开发出了食品中产气荚膜梭菌的方法，为食品中产气荚膜梭菌的精准检测控制提供了必要的技术保障，也为基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱技术在其它污染菌和致病菌的检测方法的推广奠定了基础。
本发明根据产气荚膜梭菌的特征峰进行筛选，通过基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱快速鉴定产气荚膜梭菌，通过对样本制备方法的比较，最终建立了通过串联质谱鉴定产气荚膜梭菌的方法。
本发明的核心之一在于一级质谱对特征峰的筛选，使得二级质谱的鉴定具有更高精度和分辨度。本发明的另一核心在于使用基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱对产气荚膜梭菌特征峰的定义。
具体实施方式
以下实施例详细说明了本发明。本发明所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得。
试剂和仪器
试验试剂包括：HCCA、BTS。
培养基包括：血琼脂平板。
试验仪器包括：基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱：日本岛津；超净工作台：ESCO；3K15台式高速离心机：SIGMA；MIR254 型低温恒温培养箱：PHX；涡旋混匀器：IKA；可调移液器(0.1～2.5 μL，10～100μL，100～1000μL，BRAND生产)及其它辅助设备。
菌株
本项实验中所采用的菌株详见下表。所有菌株采购到货后首先用各自的指示培养基进行活化，在适宜的温度下培养，转接传代三次以后备用。
靶板样本制备方法比较与选择
(1)直接转移法：将单个菌落以薄膜形式直接涂到MALDI靶板上，室温下晾干。
(2)扩展直接转移法：将单个菌落以薄膜形式直接涂到MALDI 靶板上，覆盖1μL70％甲酸溶液，室温下晾干。
(3)甲酸萃取法：
①取待测产气荚膜梭菌样本(来自单个菌落，取一接种环的量即可)至盛有300μL超纯水的离心管中。
②用移液枪反复吹打，涡旋至少一分钟，至离心管中形成均匀菌悬液为止。
③添加900μL无水乙醇，涡旋至少一分钟。
注意：乙醇细胞悬液可于-18℃冰箱中保存最多6个月。
注意：此步骤与第②步必须依次按顺序完成，请勿直接使用75％乙醇溶液进行混悬。
④离心悬液(离心2分钟，13000rpm)并去除上清液。
⑤重复第④步，以完全除去乙醇溶液，残余乙醇可通过移液枪进行移除。
注意：残余的乙醇可能会影响最终谱图质量，导致鉴定延迟、丢失或者无鉴定结果，因此彻底移除乙醇非常重要。
注意：当细胞浓度较低时，必须在室温下对沉淀颗粒额外干燥几分钟，使乙醇充分挥发，防止影响结果。
⑥将50μL 70％的甲酸溶液加入沉淀颗粒中，通过移液枪进行反复吹打，并涡旋使其彻底混合均匀。
注意：如待测的菌含量较低，则可减少甲酸溶液的用量(最少可至1μL)。
⑦加入50μL乙腈溶液，通过移液枪进行反复吹打，并涡旋使其彻底混合均匀。
注意：如待测的菌含量较低，则必须依照第⑥步中加入甲酸溶液的用量加入乙腈溶液(最少可至1μL)。
注意：此步骤与第⑥步必须依次按顺序完成，请勿直接将甲酸和乙腈的混合后再加入样本中。
⑧离心微生物萃取物(离心2分钟，13000rpm)，留取上清液，即为靶板样品。
比较结果：直接涂抹法和扩展直接转移法操作简单，虽然有时也可以得到准确的鉴定结果，但是由于涂抹的菌量和均匀程度很难把握，直接导致采集到的图谱质量不稳定。相比直接转移法和扩展直接转移法，甲酸提取法得到的图谱基线更平稳，蛋白峰更多，重复性更好。因此，采用甲酸提取法对分离菌株进行处理。
基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱的校正
(1)向装有HCCA的旋盖存液管中添加250μL标准溶剂(含有乙腈50％、水47.5％、三氟乙酸2.5％)，振摇并涡旋使HCCA完全溶解，得到浓度为10mgHCCA/mL的基质溶液。
(2)向装有BTS的管中加入50μL标准溶剂(含有乙腈50％、水47.5％、三氟乙酸2.5％)，用移液枪反复吹打至少20次使其完全溶解。
注意：此步骤需避免溶液气泡。
(3)室温下放置BTS溶液5分钟，然后上下吹打混合至少20次。
(4)在室温下离心(2min，13000rpm)，留取上清液。
(5)将1μL BTS溶液放置在MALDI靶板上定义为验证的靶位，室温下晾干。
(6)将1μL HCCA基质溶液仔细涂敷在样本上，室温下晾干。
注意：样本晾干后，必须在30分钟内添加基质溶液。
产气荚膜梭菌的特征峰筛选
(1)在MALDI靶板上选取合适的靶位，将1μL实施例3中得到的产气荚膜梭菌靶板样品溶液放置在靶位上，室温下晾干。
(2)将1μL HCCA基质溶液仔细涂敷在待测的产气荚膜梭菌样品上，室温下晾干。
(3)使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行检测，得到产气荚膜梭菌的质谱图。
(4)根据质谱图，选出产气荚膜梭菌的特征峰。
基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱对产气荚膜梭菌的鉴定
(1)在MALDI靶板上选取合适的靶位，将1μL实施例3中得到的产气荚膜梭菌靶板样品溶液放置在靶位上，室温下晾干。
(2)将1μL HCCA基质溶液仔细涂敷在待测的产气荚膜梭菌样品上，室温下晾干。
(3)使用基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱对实施例6 中筛选出的特征峰进行二级质谱检测。
在一级质谱中选择峰值为1482的特征峰，对其进行二级质谱检测，该特征峰会二次解吸得到峰值为1151、1299、1460、1464的新特征峰。
(4)将产气荚膜梭菌特征峰下的二级质谱图进行对比，观察谱峰的特异性。
本发明可以通过对产气荚膜梭菌的裂解获得该菌的蛋白，并通过时间飞行质谱对蛋白进行高通量筛选和高精度分析，从而快速、准确地对产气荚膜梭菌进行鉴定。本研究用甲酸萃取法对待测细菌样品进行裂解，一定程度上提高了菌蛋白的图谱质量，通过基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱，达到了以更高灵敏、高精度、高分辨率的方式对产气荚膜梭菌进行快速鉴定的成果。本发明的鉴定结果是根据基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱的谱图而确定的，图中的峰值代表蛋白峰的相对强度，通过对峰值和峰频等重要信息的计算和比对，得出待测菌种的鉴定结果。
影响鉴定结果的因素很多，例如待测菌样本的培养、前处理方式、涂抹方式等。本研究对这些影响因素进行了优化，最终筛选出相对最佳的鉴定条件及方法。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。